与巨噬细胞激活剂组合的抗CSF-1R抗体的间歇给药的制作方法
本发明涉及与巨噬细胞激活剂组合的抗csf-1r抗体的间歇给药，相应的使用此类组合疗法的药物组合物或药物。
发明背景
csf-1r和csf-1r抗体
自1986年起就知道人csf-1受体(csf-1r；集落刺激因子1受体；同义词：m-csf受体；巨噬细胞集落刺激因子1受体，fms原癌基因，c-fms)(coussens，l.等人，nature320(1986)277-280)。csf-1r是一种生长因子且由c-fms原癌基因编码(综述见例如roth，p.和stanley，e.r.，curr.top.microbiol.immunol.181(1992)141-167)。
csf-1r是csf-1(集落刺激因子1，也称作m-csf，巨噬细胞集落刺激因子)的受体且介导此细胞因子的生物学效应(sherr，c.j.等人，cell41(1985)665-676)。集落刺激因子-1受体(csf-1r)(也称作c-fms)的克隆第一次记载于roussel，m.f.等人，nature325(1987)549-552。在该出版物中，显示了csf-1r具有依赖于该蛋白质的c端尾中的变化(包括抑制性酪氨酸969磷酸化的丧失，其结合cbl并由此调节受体下调)的转化潜力(lee，p.s.等人，emboj.18(1999)3616-3628)。最近，鉴定出csf-1r的第二种配体，称作白介素-34(il-34)(lin，h.等人，science320(2008)807-811)。
目前知道两种结合csf-1r胞外域的csf-1r配体。第一种是csf-1(集落刺激因子1，也称作m-csf，巨噬细胞；seqidno：28)，在细胞外作为二硫化物连接的同二聚体找到(stanley，e.r.等人，journalofcellularbiochemistry21(1983)151-159；stanley，e.r.等人，stemcells12suppl.1(1995)15-24)。第二种是il-34(人il-34；seqidno：29)(hume，d.a.等人，blood119(2012)1810-1820)。csf-1r信号传导的主要生物学效应是造血前体细胞至巨噬细胞谱系(包括破骨细胞)的分化，增殖，迁移，和存活。csf-1r的活化由其csf-1r配体csf-1(m-csf)和il-34介导。csf-1(m-csf)对csf-1r的结合诱导同二聚体的形成和激酶通过酪氨酸磷酸化的活化(li，w.等人，embojournal.10(1991)277-288；stanley，e.r.等人，mol.reprod.dev.46(1997)4-10)。
生物学活性同二聚体csf-1在csf-1受体胞外域(csf-1r-ecd)的亚域d1至d3内结合csf-1r。csf-1r-ecd包含五个免疫球蛋白样亚域(命名为d1至d5)。胞外域(csf-1r-ecd)的亚域d4至d5不涉及csf-1结合(wang，z.等人，molecularandcellularbiology13(1993)5348-5359)。亚域d4涉及二聚化(yeung，y-g.等人，molecular&cellularproteomics2(2003)1143-1155；pixley，f.j.等人，trendscellbiol14(2004)628-638)。
别的信号传导由分别连接pi3k/akt和ras/mapk途径的pi3k之p85亚基和grb2介导。这两种重要信号传导途径能调节增殖，存活和凋亡。其它结合磷酸化csf-1r胞内域的信号传导分子包括stat1，stat3，plcy，和cb1(bourette，r.p.和rohrschneider，l.r.，growthfactors17(2000)155-166)。
csf-1r信号传导在免疫应答中，在骨再建中及在生殖系统中具有生理学作用。已经显示了csf-1(pollard，j.w.，mol.reprod.dev.46(1997)54-61)或csf-1r(dai，x.m.等人，blood99(2002)111-120)任一敲除的动物具有骨石化，造血，组织巨噬细胞，和生殖表型，与csf-1r在各种细胞类型中的作用一致。
sherr，c.j.等人，blood73(1989)1786-1793涉及一些针对csf-1r的抗体，它们抑制csf-1活性。ashmun，r.a.等人，blood73(1989)827-837涉及csf-1r抗体。lenda，d.等人，journalofimmunology170(2003)3254-3262涉及csf-1缺陷小鼠中降低的巨噬细胞募集，增殖，和活化，导致肾炎症期间降低的管凋亡。kitaura，h.等人，journalofdentalresearch87(2008)396-400提及一种抗csf-1抗体，其抑制正牙牙齿移动。wo2001/030381提及csf-1活性抑制剂，包括反义核苷酸和抗体，虽然仅仅披露csf-1反义核苷酸。wo2004/045532涉及通过csf-1拮抗剂的转移和骨丢失预防和转移癌治疗，仅仅披露拮抗性抗csf-1抗体。wo2005/046657涉及通过抗csf-1抗体对炎性肠病的治疗。us2002/0141994涉及集落刺激因子的抑制剂。wo2006/096489涉及通过抗csf-1抗体对类风湿性关节炎的治疗。wo2009/026303和wo2009/112245涉及某些抗csf-1r抗体，它们在胞外域(csf-1r-ecd)的头三个亚域(d1至d3)内结合csf-1r。wo2011/123381，wo2011/140249，wo2012/110360涉及针对csf-1r的抗体。wo2011/070024涉及在二聚化域(d4至d5)内结合csf-1r的某些抗csf-1r抗体。
wo2013/132044，wo2014/173814和wo2015/036511格外涉及抗csf-1r抗体与不同巨噬细胞激活剂，像激动性cd40抗体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组合疗法。现在已经发现包含抗csf-1r抗体的中等延迟或停止的治疗方案的组合疗法相对于包含抗csf-1r抗体和巨噬细胞激活剂二者的连续共施用的治疗方案是有利的。
发明概述
组合癌症免疫疗法以利用扩增细胞毒性t细胞来抗击癌症已经成为患者治疗的一个焦点。消除肿瘤中的t细胞遏制性肿瘤相关巨噬细胞(tam)的csf-1r阻断剂代表组合免疫疗法的一个新参与者。令人惊讶地，我们发现它的治疗效果需要tam作为效应细胞的激动性cd40抗体在与tam消减性csf-1r抗体组合时在多种癌症小鼠模型中诱导完全消退。对分选的单核细胞和tam群体的离体分析揭示只有组合治疗导致促炎性tam在它们被csf-1r单抗消除之前的立即，瞬时和独特激活。
tam和cd8+t细胞消减实验指示这种组合的治疗益处依赖于这两种群体的存在。结肠直肠癌患者显示tam上csf1r和cd40的共表达且会在一项最近开始的临床试验中用这种组合来治疗。
免疫遏制性肿瘤相关巨噬细胞的组合消减与激活性cd40抗体一起在多种肿瘤模型中引起完全肿瘤排斥，这取决于巨噬细胞浸润物。来自各种人癌症患者的流行度数据显示csf1r和cd40二者的共表达。
如果抗csf1r和抗cd40的组合治疗在所有tam被抗csf1r完全消减之前给予的话，表型有变化且能看到组合治疗的强协同抗肿瘤效果。与之对比，在所有tam在抗csf1r和抗cd40的组合治疗之前完全预消减的情况中，观察不到协同抗肿瘤效果。因此，抗csf1r和抗cd40的组合治疗的强抗肿瘤效果需要巨噬细胞。
因此，下一次协同组合治疗需要巨噬细胞恢复。
因此，本发明的一个方面是一种结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症(优选实体瘤，黑素瘤，结肠直肠，间皮瘤)，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
本发明的另一个方面是一种结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症(优选实体瘤，黑素瘤，结肠直肠，间皮瘤)，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在血清中的cd14+cd16+阳性单核细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
本发明的另一个方面是一种结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症(优选实体瘤，黑素瘤，结肠直肠，间皮瘤)，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在cd163+/cd68+阳性肿瘤相关巨噬细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
本发明的一个实施方案是用于上述治疗之一的所述抗csf-1r抗体，其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
本发明的一个实施方案是用于上述治疗之一的所述抗csf-1r抗体，其中该治疗周期的长度介于2和4周之间，在一个优选的实施方案中该治疗周期的长度介于18和24天之间，在一个优选的实施方案中该治疗周期的长度是(约)3周。
本发明的一个实施方案是用于上述治疗之一的所述抗csf-1r抗体，其中以600-1200mg的剂量(在一个优选的实施方案中以750-1100mg的剂量，在一个实施方案中以750-1000mg的剂量，在另一个实施方案中以900-1000mg的剂量，在另一个实施方案中以750mg的剂量，在另一个实施方案中以900mg的剂量，在另一个实施方案中以1000mg的剂量)施用该抗csf-1r抗体。
本发明的一个实施方案是用于上述治疗之一的所述抗csf-1r抗体，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体且其中在每个周期以4-16mg的剂量(在一个优选的实施方案中以8-16mg的剂量)施用该激动性cd40抗体。
本发明的一个实施方案是用于上述治疗之一的所述抗csf-1r抗体，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体且其中在每个周期以1100-1300mg的剂量(在一个优选的实施方案中以1200的剂量)施用该拮抗性pd-l1抗体。
本发明的一个实施方案是用于上述治疗之一的所述抗csf-1r抗体，其中该组合疗法用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展。
本发明的一个实施方案是用于上述治疗之一的所述抗csf-1r抗体，其中该组合疗法用于刺激免疫应答或功能，诸如t细胞活性。
附图简述
图1：使用抗cd40和抗csf-1r的组合治疗导致mc38肿瘤的完全排斥。(a)总体研究设计。(b)存活读出。一旦肿瘤体积测量≥700mm3，就对小鼠进行图形检查。数字指示在第71天研究结束时组合组中无肿瘤小鼠的量；n＝10只小鼠每组。(c)使用5x106个肿瘤细胞对无肿瘤小鼠的再攻击。每天通过测径器测量监测肿瘤体积。
图2：组合抗cd40和抗csf-1r治疗前cd8α阳性t细胞的消减消除荷mc38肿瘤小鼠中的高存活率。(a)总体研究设计。(b)存活读出。第11天指示开始抗cd40+/-抗csf-1r抗体；而抗cd40只给予一次，抗csf-1r自此每周给予。一旦肿瘤体积测量≥700mm3，就对小鼠进行图形检查。数字指示在第71天研究结束时组合组中无肿瘤小鼠的量；n＝10只小鼠每组。
图3：组合抗cd40和抗csf-1r治疗前tam的消减消除荷mc38肿瘤小鼠中的高存活率。(a)总体研究设计。(b)tam(dapi-cd45+cd11b+f4/80高ly6g阴性ly6c低)的流式细胞术分析，n＝4只每组；通过单因素anova的统计学分析，***p≤0.0001。(c)存活读出。一旦肿瘤体积达到≥700mm3，就对小鼠进行图形检查。数字指示在第49天研究结束时无肿瘤小鼠的量；n＝10只小鼠每组。
图4：髓样细胞的rna测序实验。(a)用于髓样细胞分析的门控策略。(b)比较rnaseq数据与88种可得签名的签名分析的概览。
图5：量化ihc分析的相关性。crc：结肠直肠癌；tnbc：三重阴性乳腺癌。
图6：抗cd40和抗csf-1r组合在荷mc38肿瘤小鼠中得到较好耐受。
图7：施用750mgq6w后cd14+cd16+单核细胞和抗csf-1r抗体emactuzumab药动学的模拟中值概况。
图8：iv施用emactuzumab后使用tmdd模型计算的均值靶物饱和。
发明详述
术语“巨噬细胞激活”指例如刺激能够分泌多种生物学活性化合物，诸如数种促炎性细胞因子和表达共刺激性表面分子，增强的抗原呈递或其它与激活有关的表面标志物的巨噬细胞。
依照本发明的“巨噬细胞激活剂”选自cd40激动剂，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组。
“带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤”指包含肿瘤细胞和浸润性csf-1r表达性肿瘤相关巨噬细胞(tam)或组织驻留性巨噬细胞的异质肿瘤。
作为肿瘤相关巨噬细胞(tam)的替代，测量血清中的前体人cd14+cd16+(阳性)单核细胞，因为这种血液单核细胞的恢复与随后肿瘤相关巨噬细胞(tam)的恢复有关。如本文中使用的，术语“在血清中的cd14+cd16+阳性单核细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)”指
例如，在实施例1b中，为人cd14+cd16+单核细胞数据拟合了一种药效学模型。基于初步的群体分析，q6w施用的750mg剂量显示cd14+cd16+单核细胞恢复向。
由于抗csf-1r抗体的第一次治疗引起血清中肿瘤相关巨噬细胞(tam)和它们的前体人cd14+cd16+(阳性)单核细胞的强烈减少/消减，所以选择治疗周期的长度来提供足够时间使得这种人cd14+cd16+(阳性)单核细胞血液单核细胞显著恢复，这与随后肿瘤相关巨噬细胞(tam)的恢复有关，从而tam没有持续消减。而且与cd40激动剂的组合治疗能发挥它的强协同抗肿瘤功效。
csf-1r是由csf-1r基因编码的一种蛋白。它控制m2巨噬细胞的生成，分化，和功能，后者继而支持肿瘤生长和转移形成且分泌免疫遏制性细胞因子，引起患者中较差的预后。而且，数种人癌症(诸如卵巢和乳腺癌)中csf-1r阳性巨噬细胞的存在已经显示不仅与升高的血管密度而且与更差的临床结局有关。选择性抑制m2样tam的csf-1r抑制剂已经在临床前模型中展现活性(denardo，d.等人，cancerdiscovery1(2011)54-67；lin，e.等人，j.exp.med.193(2001)727-740)。阻断csf-1r活性导致tam募集减少，而且与化学疗法组合，协同作用导致肿瘤生长和转移负荷减少。最近的数据已经显示在具有pvns和tgct的患者中检测到csf-1的过表达且部分由csf-1r基因的易位介导(west，r.b.等人，proc.natl.acad.sci.usa3(2006)690-695)。在乳腺癌中csf-1应答基因签名的存在预测复发和转移的风险(beck，a.等人，clin.cancerres.3(2009)778-787)。
许多肿瘤特征在于突出的免疫细胞浸润，包括巨噬细胞。最初，认为免疫细胞是针对肿瘤的防御机制的一部分，但是最近的数据支持如下的观念，即数种免疫细胞群(包括巨噬细胞)可能事实上促进肿瘤进展。巨噬细胞特征在于它们的可塑性。取决于细胞因子微环境，巨噬细胞能展现所谓的m1或m2亚型。m2巨噬细胞参与阻抑肿瘤免疫。它们还在组织修复功能诸如血管发生和组织重塑(它们被肿瘤收编来支持生长)中发挥重要作用。与肿瘤促进性m2巨噬细胞相反，m1巨噬细胞经分泌炎性细胞因子和参与抗原呈递和吞噬展现抗肿瘤活性(mantovani，a.等人，curr.opin.immunol.2(2010)231-237)。
通过分泌各种各样的细胞因子，诸如集落刺激因子1(csf-1)和il-10，肿瘤细胞能够将巨噬细胞募集和塑造成m2亚型，而诸如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，ifn-γ等细胞因子将巨噬细胞编程朝向m1亚型。使用免疫组织化学，有可能区分共表达cd68和cd163的巨噬细胞亚群(它很可能是富集m2巨噬细胞的)和显示cd68+/mhcii+，或cd68+/cd80+免疫表型的亚集(很可能包括m1巨噬细胞)。cd68和cd163阳性巨噬细胞的细胞形状，大小，和空间分布与关于m2巨噬细胞的肿瘤促进作用(例如它们在肿瘤交叉基质和生命攸关肿瘤区域中的优先定位)发表的假说一致。相反，到处找到cd68+/mhcii类+巨噬细胞。它们在吞噬中的假定作用由凋亡细胞和坏死肿瘤区域附近cd68+/mhcii类+但cd163-免疫表型的簇反映。
不同巨噬细胞亚群的亚型和标志物表达与它们的功能状态有联系。m2巨噬细胞能通过下述各项支持肿瘤发生：
a)经分泌血管发生性因子诸如vegf或bfgf增强血管发生，
b)经分泌基质金属蛋白酶(mmp)，生长因子和迁移因子(引导肿瘤细胞至血流及设立转移小生境)支持转移形成(wyckoff，j.等人，cancerres.67(2007)2649-2656)，
c)通过分泌免疫阻抑性细胞因子诸如il-4，il-13，il-1ra和il-10(它们继而调节t调节细胞功能)在建立免疫阻抑性环境中发挥作用。相反，在临床前模型中已显示cd4阳性t细胞增强肿瘤促进性巨噬细胞的活性(mantovani，a.等人，eur.j.cancer40(2004)1660-1667；denardo，d.等人，cancercell16(2009)91-102)。
因而，在数种类型的癌症(例如乳腺，卵巢，何杰金氏淋巴瘤)中，m2亚型肿瘤相关巨噬细胞(tam)的流行性已与较差的预后联系起来(bingle，l.等人，j.pathol.3(2002)254-265；orre，m.,和rogers，p.a.，gynecol.oncol.1(1999)47-50；steidl，c.等人，n.engl.j.med.10(2010)875-885)。最近的数据显示cd163阳性巨噬细胞浸润在肿瘤和肿瘤分级中的相关性(kawamura，k.等人，pathol.int.59(2009)300-305)。自患者肿瘤分离的tam具有耐受表型且对肿瘤细胞不是细胞毒性的(mantovani，a.等人，eur.j.cancer40(2004)1660-1667)。然而，在细胞毒性t细胞存在下tam的浸润与非小细胞肺癌中改善的存活有关且因此反映此肿瘤类型中更加突出的m1巨噬细胞浸润(kawai，o.等人，cancer6(2008)1387-1395)。
csf-1r属于受体酪氨酸激酶的iii类亚家族且由c-fms原癌基因编码。csf-1或il-34的结合诱导受体二聚化，接着是自磷酸化和下游信号传导级联激活。csf-1r的激活调节单核细胞和巨噬细胞的存活，增殖和分化(xiong，y.等人，j.biol.chem.286(2011)952-960)。
除单核细胞谱系的细胞和破骨细胞(它们与巨噬细胞衍生自相同造血前体)以外，还已发现csf-1r/c-fms由数种人上皮癌诸如卵巢和乳腺癌及在平滑肌肉瘤和tgct/pvns中表达，尽管处于与巨噬细胞相比要低的表达水平。对于tgct/pvns，卵巢癌患者的腹水以及血清中升高的csf-1(csf-1r的配体)水平与较差的预后有关联(scholl，s.等人，br.j.cancer62(1994)342-346；price，f.等人，am.j.obstet.gynecol.168(1993)520-527)。而且，csf1r的组成性有活性突变体形式能够转化nih3t3细胞，癌基因的特性之一(chambers，s.，futureoncol5(2009)1429-1440)。
自1986年起就知道人csf-1r(csf-1受体；同义词：m-csf受体；巨噬细胞集落刺激因子1受体，fms原癌基因，c-fms，seqidno：24)(coussens，l.等人，nature320(1986)277-280)。csf-1r是一种生长因子且由c-fms原癌基因编码(综述见例如roth，p.和stanley，e.r.，curr.top.microbiol.immunol.181(1992)141-167)。
csf-1r是csf-1r配体csf-1(巨噬细胞集落刺激因子，也称作m-csf)(seqidno：28)和il-34(seqidno：29)的受体且介导这些细胞因子的生物学效应(sherr，c.j.等人，cell41(1985)665-676；lin，h.等人，science320(2008)807-811)。集落刺激因子-1受体(也称作c-fms)的克隆第一次记载于roussel，m.f.等人，nature325(1987)549-552。在该出版物中，显示了csf-1r具有依赖于该蛋白质的c端尾中的变化(包括抑制性酪氨酸969磷酸化的丧失，其结合cbl并由此调节受体下调)的转化潜力(lee，p.s.等人，emboj.18(1999)3616-3628)。
csf-1r是一种单链，跨膜受体酪氨酸激酶(rtk)及含有免疫球蛋白(ig)基序的rtk家族的成员，特征在于该受体的胞外域(ecd)中5个重复的ig样亚域d1-d5(wang，z.等人，molecularandcellularbiology13(1993)5348-5359)。人csf-1r胞外域(csf-1r-ecd)(seqidno：25)包含所有五个胞外ig样亚域d1-d5。人csf-1r片段d1-d3(seqidno：26)包含各个亚域d1-d3。列出了没有信号肽的序列。人csf-1r片段d4-d5(seqidno：27)包含相应亚域d4-d5。
目前知道两种结合csf-1r胞外域的csf-1r配体。第一种是csf-1(集落刺激因子1，也称作m-csf，巨噬细胞；人csf-1，seqidno：28)，在细胞外作为二硫化物连接的同二聚体找到(stanley，e.r.等人，journalofcellularbiochemistry21(1983)151-159；stanley，e.r.等人，stemcells12suppl.1(1995)15-24)。第二种是il-34(人il-34；seqidno：29)(hume，d.a.等人，blood119(2012)1810-1820)。如此，在一个实施方案中，术语“csf-1r配体”指人csf-1(seqidno：28)和/或人il-34(seqidno：29)。
对于实验，常常使用人csf-1的活性149个氨基酸(aa)片段(seqidno：28的aa33-181)。人csf-1的这种活性149aa片段(seqidno：28的aa33-181)包含在csf-1的所有3种主要形式中且足以介导对csf-1r的结合(hume，d.a.等人，blood119(2012)1810-1820)。
csf-1r信号传导的主要生物学效应是造血前体细胞至巨噬细胞谱系(包括破骨细胞)的分化，增殖，迁移，和存活。csf-1r的活化由其csf-1r配体csf-1(m-csf)和il-34介导。csf-1(m-csf)对csf-1r的结合诱导同二聚体的形成和激酶通过酪氨酸磷酸化的活化(li，w.等人，embojournal.10(1991)277-288；stanley，e.r.等人，mol.reprod.dev.46(1997)4-10)。
如本文中使用的，“结合人csf-1r”或“特异性结合人csf-1r”或“抗csf-1r抗体”指抗体以kd值1.0x10-8mol/l或更低(在一个实施方案中，以kd值1.0x10-9mol/l或更低)的结合亲和力特异性结合人csf-1r抗原。结合亲和力用标准结合测定法测定，诸如表面等离振子共振技术(
在一个实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人csf-1r的抗体选自下组：hmab2f11-c11，hmab2f11-d8，hmab2f11-e7，hmab2f11-f12，和hmab2f11-g1。
这些抗体记载于wo2011/070024且特征在于包含下述本文中描述的vh和vl序列：
表1
本发明中描述的这些抗csf-1r抗体结合人csf-1r的胞外域，在一个实施方案中是构成受体二聚化界面的近膜域d4和d5。
在一个实施方案中，它们结合域d1至d3。在一个实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人csf-1r的抗体公开于wo2009/026303，wo2009/112245，wo2011/123381，wo2011/140249，wo2012/110360(通过援引将其全部收录)。
本发明中描述的抗csf-1r抗体阻断csf-1，il-34介导的以及配体不依赖性的受体活化，导致诱导在体外在csf-1存在下分化的m2样巨噬细胞凋亡而保留m1样gm-csf分化的巨噬细胞。在人乳腺癌组织中，m2(cd68+/cd163+)巨噬细胞和csf-1r表达性巨噬细胞是共定位的。
cd40抗原是一种50kda细胞表面糖蛋白，它属于肿瘤坏死因子受体(tnf-r)家族(stamenkovic等人，emboj.8：1403-10(1989))。cd40在许多正常和肿瘤细胞类型中表达，包括b淋巴细胞，树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，胸腺上皮，内皮细胞，成纤维细胞，和平滑肌细胞(paulies.等人，cancerimmunol.immunother.20：23-8(1985)；banchereauj.等人，adv.exp.med.&biol.378：79-83(1995)；aldersonm.r.等人，j.ofexp.med.178：669-74(1993)；ruggierog.等人，j.ofimmunol.156：3737-46(1996)；hollenbaughd.等人，j.ofexp.med.182：33-40(1995)；yellinm.j.等人，j.ofleukocytebiol.58：209-16(1995)；及lazaara.l.等人，j.ofimmunol.161：3120-7(1998))。cd40在所有b淋巴瘤和70％的所有实体瘤中表达。尽管组成性表达，然而cd40在抗原呈递细胞中受成熟信号(诸如lps，il-1β，ifn-γ和gm-csf)上调。
cd40激活在调节体液和细胞免疫应答中发挥至关重要作用。在没有cd40激活的情况下抗原呈递能导致耐受，而cd40信号传导能逆转此类耐受，增强所有抗原呈递细胞(apc)的抗原呈递，导致辅助细胞因子和趋化因子的分泌，提高共刺激分子表达和信号传导，及刺激免疫细胞的细胞溶解活性。cd40在b细胞增殖，成熟和类转换中发挥至关重要作用(foyt.m.等人，ann.rev.ofimmunol.14：591-617(1996))。破坏cd40信号传导途径导致异常血清免疫球蛋白同种型分布，缺少cd4+t细胞引发，和次级体液应答缺陷。例如，x连锁的高igm综合征是一种与人cd40l基因中的突变有关的疾病，而且它特征在于没有能力影响个体来生成除igm同种型以外的抗体，指示有效的免疫应答需要cd40和cd40l之间的生产性相互作用。
cd40l对cd40的咬合导致cd40胞质域与traf(tnf-r相关因子)联合(leeh.h.等人，proc.natl.acad.sci.usa96：1421-6(1999)；pullens.s.等人，biochemistry37：11836-45(1998)；grammara.c.等人，j.ofimmunol.161：1183-93(1998)；ishidat.k.等人，proc.acadacad.sci.usa93：9437-42(1996)；pullens.s.等人，j.ofbiol.chem.274：14246-54(1999))。与traf的相互作用会在nfκb和jun/ap1途径二者的激活中登顶(tsukamoton.等人，proc.natl.acad.sci.usa96：1234-9(1999)；sutherlandc.l.等人，j.ofimmunol.162：4720-30(1999))。根据细胞类型，此信号传导导致细胞因子诸如il-6(jeppsonj.d.等人，j.ofimmunol.161：1738-42(1998)；uejimay.等人，int.arch.ofallergy&immunol.110：225-32(1996))，il-8(grussh.j.等人，blood84：2305-14(1994)；vonleoprechtinga.等人，cancerres.59：1287-94(1999)；denfeldr.w.等人，europ.j.ofimmunol.26：2329-34(1996))，il-12(cellam.等人，j.ofexp.med.184：747-52(1996)；ferlinw.g.等人，europ.j.ofimmunol.28：525-31(1998)；armantm.等人，europ.j.ofimmunol.26：1430-4(1996)；kochf.等人，j.ofexp.med.184：741-6(1996)；seguinr.和l.h.kasper，j.ofinfect.diseases179：467-74(1999)；chaussabeld.等人，infection&immunity67：1929-34(1999))，il-15(kuniyoshij.s.等人，cellularimmunol.193：48-58(1999))和趋化因子(mip1α，mip1β，rantes，等等)(mcdyerj.f.等人，j.ofimmunol.162：3711-7(1999)；schanielc.等人，j.ofexp.med.188：451-63(1998)；altenburga.等人，j.ofimmunol.162：4140-7(1999)；deckersj.g.等人，j.oftheam.societyofnephrology9：1187-93(1998))分泌增强，mhci和ii类表达升高(santos-argumedol.等人，cellularimmunol.156：272-85(1994))，及粘附分子(例如icam)(leeh.h.等人，proc.natl.acad.sci.usa.96：1421-6(1999)；groussonj.等人，archivesofdermatol.res.290：325-30(1998)；kataday.等人，europ.j.ofimmunol.26：192-200(1996)；mayumim.等人，j.ofallergy&clin.immunol.96：1136-44(1995)；flores-romol.等人，immunol.79：445-51(1993))和共刺激分子(例如b7)(roym.等人，europ.j.ofimmunol.25：596-603(1995)；jonesk.w.和c.j.hackett，cellularimmunol.174：42-53(1996)；cauxc.等人，journalofexp.med.180：1263-72(1994)；kienerp.a.等人，j.ofimmunol.155：4917-25(1995))表达升高。通过cd40咬合诱导的细胞因子增强t细胞存活和活化。
在细胞和免疫功能增强以外，cd40激活的效果还包括：通过趋化因子和细胞因子的细胞募集和分化；单核细胞活化；细胞溶解性t淋巴细胞(ctl)和天然杀伤(nk)细胞的溶细胞活性升高；在cd40阳性肿瘤中诱导凋亡；cd40阳性肿瘤的免疫原性增强；和肿瘤特异性抗体生成。还完善建立了cd40激活在细胞介导的免疫应答中的作用，综述见grewal等人，ann.rev.ofimmunol.16：111-35(1998)；mackey等人，j.ofleukocytebiol.63：418-28(1998)；及noeller.j.，agents&actions--suppl.49：17-22(1998)。
使用交叉引发模型系统的研究显示apc的cd40激活能置换细胞溶解性t淋巴细胞(ctl)的生成对辅助t细胞的需要(bennett等人，nature393：478-480(1998))。来自cd40l缺陷型小鼠的证据指示辅助t细胞引发明显需要cd40信号传导(grewali.s.等人，science273：1864-7(1996)；grewali.s.等人，nature378：617-20(1995))。cd40激活将其它情况下耐受原性，携带抗原的b细胞转变成胜任的apc(buhlmannj.e.等人，immunity2：645-53(1995))。cd40激活诱导脐带血祖先成熟和分化成树突细胞(flores-romol.等人，j.ofexp.med.185：341-9(1997)；mackeym.f.等人，j.ofimmunol.161：2094-8(1998))。cd40激活还诱导单核细胞分化成功能性树突细胞(brossartp.等人，blood92：4238-47(1998))。而且，经由apc-cd40诱导的细胞因子，cd40激活增强nk细胞的溶细胞活性(carbonee.等人，j.ofexp.med.185：2053-60(1997)；martin-fontechaa.等人，j.ofimmunol.162：5910-6(1999))。这些观察结果指示通过诱导apc成熟，辅助细胞因子分泌，共刺激分子上调，和效应器功能增强，cd40在免疫应答的起始和增强中发挥至关重要作用。
cd40信号传导在体液和细胞毒性免疫应答的起始和成熟中的至关重要作用使得此系统成为免疫增强的一种理想靶物。此类增强对于发起针对肿瘤抗原(通常经由活化的apc的交叉引发呈递给免疫系统)的有效免疫应答会是特别重要的(huanga.y.等人，cibafoundationsymp.187：229-44(1994)；toesr.e.m.等人，seminarsinimmunol.10：443-8(1998)；albertm.l.等人，nature392：86-9(1998)；bennetts.r.等人，j.ofexp.med.186：65-70(1997))。
几个小组证明了cd40激活对于体外和体内抗肿瘤应答的有效性(toesr.e.m.等人，seminarsinimmunol.10：443-8(1998))。使用肾细胞癌的肺转移模型和通过病毒转化细胞的皮下肿瘤，两个小组独立证明了cd40激活能逆转对肿瘤特异性抗原的耐受，导致有效的t细胞抗肿瘤引发(sotomayore.m.等人，naturemedicine5：780-787(1999)；diehll.等人，naturemedicine5：774-9(1999))。还报告了在scid小鼠中的人乳腺癌系模型中关于cd40l和抗cd40抗体处理在免疫细胞缺失下的抗肿瘤活性(hiranoa.等人，blood93：2999-3007(1999))。最近显示在小鼠模型中通过抗cd40抗体的cd40激活根除cd40+和cd40-淋巴瘤(frenchr.r.等人，naturemedicine5：548-53(1999))。而且，先前glennie及其同事的研究得出结论，对于诱导体内肿瘤清除，通过抗cd40抗体的信号传导活性比能够募集效应器的其它抗表面标志物抗体更加有效(tutta.l.等人，j.ofimmunol.161：3176-85(1998))。与这些观察结果一致，在测试抗cd40抗体针对体内cd40+肿瘤细胞的活性时，大部分但非全部杀肿瘤活性与cd40信号传导而非adcc有关(funakoshis.等人，j.ofimmunotherapywithemphasisontumorimmunol.19：93-101(1996))。在另一项研究中，用多种药剂离体处理骨髓树突细胞，并测试体内抗肿瘤活性。这些研究证明cd40l刺激的dc是最成熟且最有效的发起抗肿瘤应答的细胞。
还已经通过比较野生型和cd40-/-小鼠对肿瘤疫苗的响应证明cd40在抗肿瘤免疫中的至关重要作用。这些研究显示cd40-/-小鼠没有能力实现在正常小鼠中观察到的肿瘤免疫(mackeym.f.等人，cancerresearch57：2569-74(1997))。在另一项研究中，用肿瘤细胞刺激来自荷瘤小鼠的脾细胞，并离体用活化性抗cd40抗体处理，显示具有增强的肿瘤特异性ctl活性(donepudim.等人，cancerimmunol.immunother.48：153-164(1999))。这些研究证明cd40在cd40阳性和阴性肿瘤二者中的抗肿瘤免疫中占据至关重要的位置。由于cd40在淋巴瘤，白血病，多发性骨髓瘤，大多数鼻咽，膀胱，卵巢，和肝癌，和一些乳腺和结直肠癌中表达，因此活化cd40会具有广泛的临床应用。
如本文中使用的，“cd40激动剂”包括激动cd40/cd40l相互作用的任何模块。如此语境中使用的，cd40优选指人cd40，使得cd40激动剂优选是人cd40的激动剂。典型地，这些模块会是“激动性cd40抗体”或“激动性cd40l多肽”。举例而言，这些抗体包括特异性激动cd40/cd40l结合相互作用的人抗体，嵌合抗体，人源化抗体，双特异性抗体，scfv，和抗体片段。在一个优选实施方案中，激动性cd40抗体会包含嵌合的，完全人的或人源化的cd40抗体。在另一个优选实施方案中，激动性cd40抗体会包含嵌合的，完全人的或人源化的cd40抗体。
“激动剂”与细胞上的受体组合并起始与该受体的天然配体起始的反应或活性相似或相同的反应或活性。“cd40激动剂”诱导任何或所有(但不限于)下述应答：b细胞增殖和/或分化；经由诸如icam-1，e-选择蛋白，vc-am，等等分子的细胞间粘附上调；促炎症细胞因子(诸如il-1，il-6，il-8，il-12，tnf，等等)分泌；经由cd40受体的信号转导，通过诸如traf(例如traf2和/或traf3)，map激酶诸如nik(nf-kb诱导激酶)，i-κb激酶(ikk/β)，转录因子nf-kb，ras和mek/erk途径，pi3k-akt途径，p38-mapk途径，等等途径；通过诸如xiap，mcl-1，bcl-x，等等分子的抗凋亡信号转导；b和/或t细胞记忆生成；b细胞抗体生成；b细胞同种型转换，mhcii类和cd80/86的细胞表面表达上调，等等。
激动剂活性意指比阴性对照诱导的激动剂活性要大至少30％，35％，40％，45％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％的激动剂活性，如在b细胞应答的测定法中测量的。
在一个优选实施方案中，cd40激动剂具有比阴性对照诱导的激动剂活性要大至少2倍或至少3倍的激动剂活性，如在b细胞应答的测定法中测量的。
如此，例如，在感兴趣的b细胞应答是b细胞增殖的情况中，激动剂活性会以比由阴性对照诱导的b细胞增殖的水平要大至少2倍或至少3倍的水平诱导b细胞增殖。
在一个实施方案中，不结合cd40的抗体充当阴性对照。“没有显著激动剂活性”的物质会展现比由阴性对照诱导的激动剂活性要大不超过约25％，优选比由阴性对照诱导的激动剂活性要大不超过约20％，15％，10％，5％，1％，0.5％，或甚至不超过约0.1％的激动剂活性，如在b细胞应答的测定法中测量的。
如本文中使用的，“激动性cd40抗体”，或“活化性cd40抗体”或“激动性或活化性抗cd40抗体”表示在添加至表达cd40的细胞，组织或生物体时结合人cd40且将一种或多种cd40活性提高至少约20％的抗体。在一些实施方案中，抗体将cd40活性活化至少40％，50％，60％，70％，80％，85％。
在一些实施方案，在cd40l存在下添加活化性抗体。
在另一个优选实施方案中，如下测量激动性cd40抗体的激动剂活性：
抗cd40抗体对细胞系jy的免疫原性的提高
在rpmi培养基中培养和维持cd40阳性jiyoye细胞(atccccl87)(“jy细胞”)。将jiyoye细胞与本发明的抗cd40抗体(21.4.1)或与同种型匹配的抗体(抗klh)一起在完全rpmi培养基中温育24小时。然后清洗细胞并用25mg丝裂霉素c(sigma)/7ml培养基处理60分钟。然后以1:100比率将这些细胞与分离的人t细胞一起于37℃(5％co2)温育6天。然后收集t细胞，清洗，并针对新鲜的铬51(newenglandnuclear，boston，mass.)标记的jiyoye细胞测定ctl活性的水平。以％特异性细胞溶解＝(细胞溶解jy(cpm)-自发细胞溶解(cpm))/(总细胞溶解(cpm)-自发细胞溶解(cpm))计算特异性ctl活性。
在一个优选实施方案中，如本文中使用的，激动性cd40抗体将cd40阳性jiyoye细胞(atccccl87)中的免疫原性提高至少50％，如体外jiyoye细胞(atccccl87)测定法中测量(如上所述)的。
激动性cd40抗体(在本文中也称作抗cd40活化性抗体)能经由数种重要机制促成肿瘤根除。这些中首要的是活化宿主树突细胞进行增强的肿瘤抗原加工和呈递，以及cd40阳性肿瘤细胞自身增强的抗原呈递或免疫原性，导致肿瘤特异性cd4+和cd8+淋巴细胞活化。可以通过下述来介导别的抗肿瘤活性，即cd40信号传导的其它免疫增强效果(生成趋化因子和细胞因子，募集和活化单核细胞，和增强ctl和nk溶细胞活性)，以及通过诱导凋亡或通过刺激体液应答(导致adcc)对cd40+肿瘤的直接杀伤。凋亡和垂死的肿瘤细胞也能变成由cd40激活的apc加工和呈递的肿瘤特异性抗原的一个重要来源。
本发明描述了结合人cd40且作为cd40激动剂起作用的分离的抗体或其抗原结合部分。
激动性cd40抗体记载于例如beatty等人，science331(2011)1612-1616；r.h.vonderheide等人，jclinoncol25，876(2007)；khalil，m等人，updatecancerther.2007june1；2(2)：61-65。作为模型抗体的激动性cd40大鼠抗小鼠igg2a单抗fgk45记载于s.p.schoenberger等人，nature393，480(1998)；小鼠交叉反应性激动性cd40抗体克隆1c10记载于santos-argumedol.等人，cellimmunol.156(1994)272-285及heathaw等人，eurjimmunol24(1994)1828-34。处于临床试验的例子有例如cp-870,893和dacetuzumab(一种激动性cd40抗体，cas号880486-59-9，sgn-40；人源化s2c6抗体)(khalil，m等人，updatecancerther.2007june1；2(2)：61-65)。另一种激动性抗体是来自wo2016/023960第54页的adc-1013。
在一个优选实施方案中，激动性cd40抗体是cp-870,893，它是一种完全人的igg2激动性cd40抗体，由pfizer开发。它以3.48x10-10m的kd结合人cd40，但不阻断cd40l结合(参见例如us7,338,660或ep1476185，其中cp-870,893称作抗体21.4.1)。cp-870,893(us7,338,660的抗体21.4.1)特征在于包含(a)重链可变域氨基酸序列
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpdsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelnrlrsddtavyycardqplgyctngvcsyfdywgqgtlvtvss(seqidno：11)(它对应于us7,338,660的seqidno：42)；(b)轻链可变域氨基酸序列
diqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqgiyswlawyqqkpgkapnlliytastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqanifpltfgggtkveik(seqidno：12)(它对应于us7,338,660的seqidno：44)；和/或具有由杂交瘤21.4.1(它具有美国典型培养物保藏中心(atcc)登录号pta-3605)生成的抗体的重链可变域和轻链可变域氨基酸序列。dacetuzumab和其它人源化s2c6抗体记载于us6,946,129和us8,303,955。
因此，在一个优选实施方案中，在组合疗法中与抗csf-1r抗体一起使用的激动性cd40抗体特征在于包含(a)重链可变域氨基酸序列
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpdsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelnrlrsddtavyycardqplgyctngvcsyfdywgqgtlvtvss(seqidno：11)(它对应于us7,338,660的seqidno：42)；(b)轻链可变域氨基酸序列
diqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqgiyswlawyqqkpgkapnlliytastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqanifpltfgggtkveik(seqidno：12)(它对应于us7,338,660的seqidno：44)；和/或具有由杂交瘤21.4.1(它具有美国典型培养物保藏中心(atcc)登录号pta-3605)生成的抗体的重链可变域和轻链可变域氨基酸序列。dacetuzumab和其它人源化s2c6抗体记载于us6,946,129和us8,303,955。
在一个优选实施方案中，在组合疗法中与抗csf-1r抗体一起使用的激动性cd40抗体是人源化s2c6抗体。例如，人源化s2c6抗体基于鼠单抗s2c6(以pta-110保藏于atcc)的重和轻链可变域的cdr1，2和3。鼠单抗s2c6的重和轻链可变域的cdr1，2和3记载和披露于us6,946,129。在一个实施方案中，激动性cd40抗体是dacetuzumab。在一个实施方案中，激动性cd40抗体特征在于包含(a)重链可变域氨基酸序列
evqlvesggglvqpggslrlscaasgysftgyyihwvrqapgkglewvarvipnaggtsynqkfkgrftlsvdnskntaylqmnslraedtavyycaregiywwgqgtlvtvs(seqidno：13)；(b)轻链可变域氨基酸序列diqmtqspsslsasvgdrvtitcrssqslvhsngntflhwyqqkpgkapklliytvsnrfsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyfcsqtthvpwtfgqgtkveikr(seqidno：14)。
在一个实施方案中，激动性cd40抗体是人抗体。如本文中使用的，术语“人抗体”表示可变和恒定域序列衍生自人序列的抗体。人激动性cd40抗体详细记载于wo03/040170，据此通过援引收录其完整公开内容。人抗体在本发明的治疗方法中提供实质性优点，因为它们预期最小化与在人患者中使用非人抗体有关的免疫原性和变应性反应。
对于本发明有用的其它例示性人抗cd40抗体包括具有wo03/040170中记载的称作3.1.1，3.1.1h-a78t，3.1.1h-a78t-v88a-v97a，7.1.2，10.8.3，15.1.1，21.4.1，21.2.1，22.1.1，22.1.1h-c109a，23.5.1，23.25.1，23.28.1，23.28.1h-d16e，23.29.1，24.2.1，3.1.1h-a78t-v88a-v97a/3.1.1l-l4m-l83v和23.28.1l-c92a的抗体的氨基酸序列的抗体以及包含任何例示性抗体的cdr或可变区的抗体。
在本发明的一个实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人csf-1r的抗体特征在于包含
a)seqidno：1的重链可变域vh和seqidno：2的轻链可变域vl，或
b)seqidno：3的重链可变域vh和seqidno：4的轻链可变域vl，或
c)seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，或
d)seqidno：7的重链可变域vh和seqidno：8的轻链可变域vl，或
e)seqidno：9的重链可变域vh和seqidno：10的轻链可变域vl；且该组合疗法中使用的激动性cd40抗体特征在于包含
a)seqidno：11的重链可变域vh和seqidno：12的轻链可变域vl。
在本发明的一个优选实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人csf-1r的抗体特征在于包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且该组合疗法中使用的激动性cd40抗体特征在于包含seqidno：11的重链可变域vh和seqidno：12的轻链可变域vl。
在某些实施方案中，癌症或肿瘤治疗抑制癌症细胞增殖，抑制或阻止肿瘤重量或体积增大，和/或引起肿瘤重量或体积减小。在一些实施方案中，癌症治疗延长患者存活。在某些实施方案中，肿瘤生长与不治疗的那些相比抑制至少50％，55％，60％，65％，70％或75％。在一些实施方案中，癌症或肿瘤是cd40阳性的。
在本发明中，术语“cd40l”或其在本领域的别名“cd154”包括所有哺乳动物cd40l，例如人，大鼠，非人灵长动物，鼠及其片段，变体，寡聚体，和缀合物，它们结合至少相应哺乳动物cd40多肽，例如人cd40。在本发明中，所施用的cd40l可以包含cd40l多肽或编码所述cd40l多肽的dna。特别地，此类cd40l多肽和dna包括天然cd40l序列及其片段，变体，和寡聚体，如披露于immunex美国专利no.6,410,711；美国专利no.6,391,637；美国专利no.5,981,724；美国专利no.5,961,974和美国已公布申请no.20040006006，通过援引将所有这些专利和申请及其中披露的cd40l序列完整收入本文。
cd40l多肽可用作依照本发明的cd40激动剂，而且特别包括天然cd40l序列及其片段，变体，和寡聚体，如披露于immunex美国专利no.6,410,711；美国专利no.6,391,637；美国专利no.5,981,724；美国专利no.5,961,974和美国已公布申请no.20040006006，通过援引将所有这些专利和申请及其中披露的cd40l序列完整收入本文。
pd-1/pd-l1/pd-l2途径：
一种调节t细胞活化的重要负共刺激信号是由编程性死亡-1受体(pd-1)(cd279)及其配体结合配偶pd-l1(b7-h1，cd274；seqidno：31)和pd-l2(b7-dc，cd273)提供的。pd-1的负调节作用是通过pd-1敲除(pdcd1-/-)揭示的，其倾向于自身免疫。nishimura等人，immunity11：141-51(1999)；nishimura等人，science291：319-22(2001)。pd-1与cd28和ctla-4有关，但是缺少容许同二聚化的近膜半胱氨酸。pd-1的胞质域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(itim，v/ixyxxl/v)。pd-1只结合pd-l1和pd-l2。freeman等人，j.exp.med.192：1-9(2000)；dong等人，naturemed.5：1365-1369(1999)；latchman等人，natureimmunol.2：261-268(2001)；tseng等人，j.exp.med.193：839-846(2001)。
pd-1能在t细胞，b细胞，天然杀伤t细胞，活化的单核细胞和树突细胞(dc)上表达。pd-1由活化的但不由未刺激的人cd4+和cd8+t细胞，b细胞和髓样细胞表达。这与更受局限的cd28和ctla-4表达形成对比。nishimura等人，int.immunol.8：773-80(1996)；boettler等人，j.virol.80：3532-40(2006)。已经自活化的人t细胞克隆了pd-1的至少4种变体，包括缺少(i)外显子2，(ii)外显子3，(iii)外显子2和3，或(iv)外显子2至4的转录物。nielsen等人，cell.immunol.235：109-16(2005)。除pd-1δex3外，在静息外周血单个核细胞(pbmc)中所有变体以与全长pd-1相似的水平表达。所有变体的表达在用抗cd3和抗cd28活化人t细胞后显著诱导。pd-1δex3变体缺少跨膜域，且类似可溶性ctla-4，其在自身免疫中发挥重要作用。ueda等人，nature423：506-11(2003)。此变体在具有类风湿性关节炎的患者的滑液和血清中富集。wan等人，j.immunol.177：8844-50(2006)。
两种pd-1配体区别在于它们的表达样式。pd-l1在小鼠t和b细胞，cd，巨噬细胞，间充质干细胞和骨髓衍生肥大细胞上组成性表达。yamazaki等人，j.immunol.169：5538-45(2002)。pd-l1在广泛的非造血细胞(例如角膜，肺，血管上皮，肝非实质细胞，间充质干细胞，胰岛，胎盘合胞滋养层，角质形成细胞，等)上表达[keir等人，annu.rev.immunol.26：677-704(2008)]，而且在活化后在多种细胞类型上上调。i型和ii型干扰素ifn均上调pd-l1。eppihimer等人，microcirculation9：133-45(2002)；schreiner等人，j.neuroimmunol.155：172-82(2004)。细胞系中的pd-l1表达在myd88，traf6和mek受到抑制时降低。liu等人，blood110：296-304(2007)。jak2也已经与pd-l1诱导联系起来。lee等人，febslett.580：755-62(2006)；liu等人，blood110：296-304(2007)。磷酸酶和张力蛋白同系物(pten)(一种修饰磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)和akt信号传导的细胞磷酸酶)的丧失或抑制提高癌症中的转录后pd-l1表达。parsa等人，nat.med.13：84-88(2007)。
pd-l2表达比pd-l1更受局限。pd-l2在dc，巨噬细胞，和骨髓衍生肥大细胞上可诱导表达。pd-l2还在约二分之一至三分之二的静息腹膜b1细胞上表达，但是不在常规b2b细胞上表达。zhong等人，eur.j.immunol.37：2405-10(2007)。pd-l2+b1细胞结合磷脂酰胆碱，而且对于针对细菌抗原的先天免疫应答可能是重要的。ifn-γ对pd-l2的诱导部分依赖于nf-κb。liang等人，eur.j.immunol.33：2706-16(2003)。pd-l2还可以在单核细胞和巨噬细胞上受gm-cf，il-4和ifn-γ诱导。yamazaki等人，j.immunol.169：5538-45(2002)；loke等人，pnas100：5336-41(2003)。
pd-1信号传导通常具有比对细胞增殖要大的对细胞因子生成的影响，对ifn-γ，tnf-α和il-2生成有显著影响。pd-1介导的抑制性信号传导还依赖于tcr信号传导的强度，在低水平的tcr刺激投递较大的抑制。这种降低可以通过经由cd28的共刺激[freeman等人，j.exp.med.192：1027-34(2000)]或il-2的存在[carter等人，eur.j.immunol.32：634-43(2002)]来克服。
越来越多的证据说明经由pd-l1和pd-l2的信号传导可能是双向的。就是说，在修饰tcr或bcr信号传导以外，信号传导还可以投递回到表达pd-l1和pd-l2的细胞。虽然用自具有瓦尔登斯特伦(waldenstrom)氏巨球蛋白血症的患者分离的天然人抗pd-l2抗体处理树突细胞未发现上调mhcii或b7共刺激分子，但是此类细胞确实生成极大量的促炎症细胞因子，特别是tnf-α和il-6，且刺激t细胞增殖。nguyen等人，j.exp.med.196：1393-98(2002)。用这种抗体处理小鼠还(1)增强对移植的b16黑素瘤抗性和快速诱导肿瘤特异性ctl。radhakrishnan等人，j.immunol.170：1830-38(2003)；radhakrishnan等人，cancerres.64：4965-72(2004)；heckman等人，eur.j.immunol.37：1827-35(2007)；(2)阻断变应性哮喘小鼠模型中气道炎性疾病发生。radhakrishnan等人，j.immunol.173：1360-65(2004)；radhakrishnan等人，j.allergyclin.immunol.116：668-74(2005)。
关于逆信号传导入树突细胞(“dc”)的进一步证据源自用可溶性pd-1(与ig恒定区融合的pd-1ec域-“s-pd-1”)培养的骨髓衍生dc的研究。kuipers等人，eur.j.immunol.36：2472-82(2006)。此spd-1以通过施用抗pd-1可逆的方式抑制dc活化且提高il-10生成。
另外，数项研究显示了pd-l1或pd-l2的一种不依赖于pd-1的受体。b7.1早就鉴定为pd-l1的结合配偶。butte等人，immunity27：111-22(2007)。化学交联研究提示pd-l1和b7.1能经由它们的igv样域相互作用。b7.1:pd-l1相互作用能诱导进入t细胞的抑制性信号。通过b7.1连接cd4+t细胞上的pd-l1或通过pd-l1连接cd4+t细胞上的b7.1投递抑制性信号。缺少cd28和ctla-4的t细胞显示在通过抗cd3加b7.1包被珠刺激时降低的增殖和细胞因子生成。在缺少b7.1的所有受体(即cd28，ctla-4和pd-l1)的t细胞中，t细胞增殖和细胞因子生成不再受抗cd3加b7.1包被珠抑制。这指示b7.1在cd28和ctla-4缺失下经由t细胞上的pd-l1特异性起作用。类似地，缺少pd-1的t细胞在抗cd3加pd-l1包被珠存在下刺激时显示降低的增殖和细胞因子生成，证明pd-l1连接t细胞上的b7.1的抑制效果。当t细胞缺少pd-l1的所有已知受体(即没有pd-1和b7.1)时，t细胞增殖不再受抗cd3加pd-l1包被珠削弱。如此，pd-l1能经由b7.1或pd-1任一对t细胞发挥抑制效果。
b7.1和pd-l1之间的直接相互作用提示当前关于共刺激的理解是不全面的，而且强调对这些分子在t细胞上的表达的意义。关于pd-l1-/-t细胞的研究指出t细胞上的pd-l1能下调t细胞的细胞因子生成。latchman等人，proc.natl.acad.sci.usa101：10691-96(2004)。因为pd-l1和b7.1均在t细胞，b细胞，dc和巨噬细胞上表达，所以这些细胞类型上的b7.1和pd-l1之间的定向相互作用是有可能的。另外，非造血细胞上的pd-l1可能与b7.1以及t细胞上的pd-1相互作用，这提出了pd-l1是否参与它们的调节的问题。关于b7.1:pd-l1相互作用的抑制性作用的一种可能的解释是t细胞pd-l1可能诱捕或隔离apcb7.1，不得与cd28相互作用。
结果是，拮抗经由pd-l1的信号传导(包括阻断pd-l1与pd-1，b7.1任一或二者相互作用，由此阻止pd-l1将负共刺激信号发送至t细胞和其它抗原呈递细胞)很可能增强响应感染(例如急性和慢性)的免疫和肿瘤免疫。另外，本发明的抗pd-l1抗体可以与pd-1:pd-l1信号传导的其它成分的拮抗剂(例如拮抗性抗pd-1和抗pd-l2抗体)组合。
术语“人pd-l1”指人蛋白质pd-l1(seqidno：31，pd-1信号传导，通常)。如本文中使用的，“结合人pd-l1”或“特异性结合人pd-l1”或“抗pd-l1抗体”或“拮抗性抗pd-l1”指抗体以kd值1.0x10-8mol/l或更低(在一个实施方案中，以kd值1.0x10-9mol/l或更低)的结合亲和力特异性结合人pd-l1抗原。结合亲和力用标准结合测定法测定，诸如表面等离振子共振技术(
在一个实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人pd-l1的抗体是阿特珠单抗，其特征在于包含下述本文中描述的vh和vl序列：
表2
在本发明的一个实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人csf-1r的抗体特征在于包含
a)seqidno：1的重链可变域vh和seqidno：2的轻链可变域vl，或
b)seqidno：3的重链可变域vh和seqidno：4的轻链可变域vl，或
c)seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，或
d)seqidno：7的重链可变域vh和seqidno：8的轻链可变域vl，或
e)seqidno：9的重链可变域vh和seqidno：10的轻链可变域vl；且该组合疗法中使用的结合人pd-l1的抗体特征在于包含
a)seqidno：15的重链可变域vh和seqidno：16的轻链可变域vl。
在本发明的一个优选实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人csf-1r的抗体特征在于包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且该组合疗法中使用的结合人pd-l1的抗体特征在于包含seqidno：15的重链可变域vh和seqidno：16的轻链可变域vl。
tlr和toll样受体(tlr)配体，尤其是tlr9和tlr9激动剂
用于癌症治疗的不同实验性toll样受体激动剂已有记载(galluzzi等人，oncoimmunology，1：5(2012)699-716)。toll样受体(tlr)一般是原型样式识别受体(prr)，对它们知道的最多的是它们响应保守微生物成分诸如脂多糖和双链rna而激活先天免疫系统的能力。越来越多的证据指示tlr的功能不局限于针对侵入的病原体引发先天免疫应答。事实上tlr已显示出参与组织修复和损伤诱导的再生以及针对癌症的适应性免疫应答。特别地，tlr4信号传导看来是树突细胞对细胞相关肿瘤抗原的有效加工和交叉呈递所需要的，这实际上是针对一些抗癌药物的最佳治疗性响应的基础。如此，tlr构成抗癌免疫应答的激活/强化的突出治疗靶。与此观念一致，长期使用的制备物诸如coley毒素(杀死的酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)和粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)细菌的混合物)和卡介苗(bcg，牛分枝杆菌(mycobacteriumbovis)的一种减毒株，最初作为针对结核病的疫苗开发)(均已经与一致的抗癌应答联系起来)有力地激活tlr2和tlr4信号传导。
根据当前接受的模型，tlr作为同或异二聚体运转且在质膜处(主要结合蛋白质-脂质mamp的tlr，即tlr1，tlr2，tlr4，tlr5，tlr6和tlr10)或在内体中(检测微生物核酸的tlr，即tlr3，tlr7，tlr8，tlr9)表达。tlr10(它是人tlr中唯一的孤儿受体)也已经显示出与tlr2共定位于吞噬体，提示它可能与tlr2共享结合酰化脂肽的能力。然而，这个问题上尚未报告决定性的数据。tlr11-13在人基因组中没有编码。在小鼠中，tlr11-13在中枢神经系统中组成性表达且响应囊虫病经历数倍诱导。21tlr11据报告识别由鼠弓形体(toxoplasmagondii)表达的肌动蛋白抑制蛋白(profilin)样蛋白且已定位于内质网。tlr13也看来定位于细胞内，在那里它会特异性检测水泡性口炎病毒。至今，tlr12的配体特异性和胞内定位仍然有待探索。
所以，总之，不同toll样受体具有不同功能，结构和表达样式。因此，它们的配体和激动剂也具有不同功能和作用模式。例如，lps(tlr2和tlr4的天然配体，还知道是内毒素)具有抗癌特性，这早在二十世纪六十年代就已经发现了，那时甚至还没有猜想tlr的存在。
toll样受体(tlr)是在先天免疫系统中发挥关键作用的一类蛋白质。它们是单一，跨膜，非催化性受体，通常在岗哨细胞诸如巨噬细胞和树突细胞中表达，识别自微生物衍生的结构上保守的分子。一旦这些微生物已经突破物理屏障诸如皮肤或肠道粘膜，它们就受到tlr识别，后者激活免疫细胞应答。tlr包括tlr1，tlr2，tlr3，tlr4，tlr5，tlr6，tlr7，tlr8，tlr9，tlr10，tlr11，tlr12，和tlr13，尽管后两种在人中没有找到(mahla，rs等人，frontimmunol4(2013)248)。
tlr配体：
由于toll样受体(和其它先天免疫受体)的特异性，它们在进化过程中不能轻易改变，这些受体识别与威胁(即病原体或细胞应力(stress))恒定相关且对这些威胁高度特异性(即不能误认是在生理条件下正常表达的自身分子)的分子。满足这种要求的病原体相关分子认为是对病原体的功能至关紧要的且难以经由突变来改变；它们据说是进化上保守的。病原体中有点保守的特征包括细菌细胞表面脂多糖(lps)，脂蛋白，脂肽，和脂阿拉伯甘露聚糖；蛋白质诸如来自细菌鞭毛的鞭毛蛋白；病毒的双链rna；或细菌和病毒dna的未甲基化cpg岛；和还有真核dna的启动子中找到的cpg岛；以及某些其它rna和dna分子。对于大多数tlr，现在已经通过基因靶向(也称作“基因敲除”：一种可以在小鼠中选择性删除个别基因的技术)确立配体识别特异性。
已知tlr配体的汇总见下表(waltenbaughc等人，immunology.lippincott'sillustratedreviews.philadelphia：wolterskluwerhealth/lippincottwilliams&wilkins.(2008)p.17)。
表3
由toll样受体活化引起的血清型(stereotypic)炎性应答促使推测toll样受体的内源活化剂可能参与自身免疫病。已经怀疑tlr结合宿主分子，包括纤维蛋白原(牵涉血液凝固)，热休克蛋白(hsp)，hmgb1，细胞外基质成分和自身dna(它正常情况下被核酸酶降解，但是在炎性和自身免疫性条件下它能与内源蛋白质形成复合物，变成对这些核酸酶有抗性且获得到达内体tlr像tlr7或tlr9)。这些内源配体通常作为非生理性细胞死亡的结果生成(kawai，t.等人，natureimmunology.11(2010)373-384)。
简短概览：不同tlr的配体。
tlr-1：-细菌脂蛋白和肽聚糖
tlr-2：-细菌肽聚糖
tlr-3：-双链rna
tlr-4：-脂多糖
tlr-5：-细菌鞭毛
tlr-6：-细菌脂蛋白
tlr-7：-单链rna，细菌的和病毒的
tlr-8：-单链rna，细菌的和病毒的，吞噬的细菌rna[30]
tlr-9：-cpgdna
tlr-10：-未知的
tlr-11：-来自弓形虫(toxoplasmagondii)，也有可能是致尿路病的细菌的肌动蛋白抑制蛋白
tlr-12：-来自弓形虫的肌动蛋白抑制蛋白
tlr-13：-细菌核糖体rna
tlr9主要在b细胞，单核细胞，巨噬细胞和类浆树突细胞dc的内体隔室中找到(galluzzi等人，oncoimmunology，1：5(2012)699-716)。tlr9的主要配体是细菌/病毒dna，因未甲基化cpg寡聚脱氧核苷酸的频率升高而不同于它的哺乳动物对应物。事实上，尽管哺乳动物dna没有免疫刺激活性，然而施用细菌/病毒dna在体内诱导有力的th1免疫应答，它在tlr9-/-小鼠中完全消除。cpg寡聚脱氧核苷酸(或cpgodn)是含有胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸("c")，接着是鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸("g")的短单链合成dna分子。"p"指连续核苷酸之间的磷酸二酯连接，尽管一些odn改为具有经修饰的硫代磷酸酯(ps)主链。当这些cpg基序未甲基化时，它们作为免疫刺激物起作用(weiner，gj等人，pnas94(1997)10833-7)。
由于它们在微生物基因组中的丰富性但它们在脊椎动物基因组中的稀有性，cpg基序被认为是病原体相关分子样式(pamp)(bauer，s，currenttopicsinmicrobiologyandimmunology270(2002)145-54)。cpgpamp受到样式识别受体(prr)toll样受体9(tlr9)识别，后者仅在人和其它高等灵长类动物中的b细胞和类浆树突细胞(pdc)中组成性表达(rothenfusser，s等人，humanimmunology63(2002)1111-9)。
合成cpgodn与微生物dna区别在于它们具有部分或完全硫代磷酸酯化(ps)主链代替典型的磷酸二酯主链和3'末端，5'末端，或二者处的聚g尾。ps修饰保护odn免于被身体中的核酸酶(诸如dna酶)降解，而聚g尾增强细胞摄取(dalpke，ah等人，immunology106(2002)102-12)。聚g尾形成分子间四分体，导致高分子量聚集物。这些聚集物对聚g序列所给予的升高的活性负有责任；而非序列自身。
已经作为佐剂广泛研究了这些含有未甲基化cpg基序的合成寡聚脱氧核苷酸(cpgodn)，诸如odn1826(steinhagen，f等人，2011，vaccine29(17)：3341-55)。与哺乳动物dna相比，这些cpg基序以高20倍的频率存在于细菌dna中(hemmi，h等人，2000，nature408：740-5)。cpgodn激动在人b细胞和类浆树突细胞(pdc)上表达的tlr9，由此诱导th1占优势的免疫应答(coffman等人，2010，immunity33(4)：492-503)。在啮齿类动物和非人灵长类动物中进行的临床前研究和人临床试验已证明cpgodn能显著改善疫苗特异性抗体应答(steinhagen，f等人，2011，vaccine29(17)：3341-55)。
已显示众多序列刺激tlr9，它们在cpg二聚体的数目和定位，以及cpg二聚体侧翼的精确碱基序列方面有变化。这导致创建cpgodn的类或范畴，根据它们的序列，二级结构，和对人外周血单个核细胞(pbmc)的作用，都是tlr9激动剂。cpgodn的三个主要类是a，b和c类，区别在于它们的免疫刺激活性(krug，a等人，2001，eurjimmunol，31(7)：2154-63)。而且，cpgodn以物种特异性方式激活tlr9(bauer，s等人，2001，pnas，98(16)：9237-42)。第一a类odn之一，odn2216，由krug等人于2001年描述(见上文)。这类odn明显不同于先前描述的b类odn(即odn2006)，在于它刺激大量i型干扰素(最重要的是ifnα)生成且诱导pdc成熟。
经由间接细胞因子信号传导，a类odn还是nk细胞的强激活物。a类odn通常在两个末端之一或二者含有7至10个ps修饰碱基，它们抵抗核酸酶的降解作用且延长odn的寿命。上述规则严格定义该类，但是这些“规则”内的序列可能有变化。还应当注意，序列的改变会影响响应的程度。例如，内部回文序列长度可以是4至8个碱基对且碱基次序有变化，然而，发现样式5'-pupucgpupycgpypy-3'与数种其它序列相比是最有活性的。在dna链任一末端找到的聚g尾长度和甚至数目可以有变化，但是它的存在对于该分子的活性是至关重要的。
b类odn(即odn2007)是人b细胞和单核细胞成熟的强刺激物。它们还刺激pdc成熟但是程度比a类odn和很小量的ifnα低。这类中的最强odn具有三个6聚物序列。由于它们诱导强体液免疫应答的能力(使得它们作为疫苗佐剂是理想的)，已作为治疗剂广泛研究b类odn。
odn1826是一种对小鼠tlr9特异性的b型cpgodn。b型cpgodn含有带一个或多个cpg二核苷酸的完全硫代磷酸酯主链且能强烈激活b细胞(krug，a等人，2001，eurjimmunol，31(7)：2154-63)。已在众多动物模型中作为佐剂测试odn1826，一种小鼠反应性替代tlr9激动剂(bauer，s等人，2001，pnas，98(16)：9237-42)。小鼠中的研究证明了odn1826施用能诱导i型ifn抗病毒活性8-9和抗原呈递细胞激活，指示th1免疫应答(longhi，mp等人，2009，jexpmed206：1589-602)。
此外，对携带肿瘤的啮齿类动物施用b型cpg寡核苷酸(单独或与化疗剂或肽疫苗组合)据报告发挥有力的抗癌效果。2000年4月发起了初始i/ii期临床试验来测试cpg-7909针对肿瘤学适应症的安全性和功效。大约同一时段开始针对癌症无关适应症(主要是抗病毒疫苗)作为佐剂广泛调查cpg-7909，显示没有严重的副作用和令人鼓舞的功效。
在最近十年，已在大量i/ii期临床试验中调查cpg-7909(作为孤立药剂或与化疗和/或疫苗接种办法组合)的安全性和抗癌潜力，包括白血病，淋巴瘤，基细胞癌，黑素瘤，食管鳞状细胞癌，nsclc，肾细胞癌，和前列腺癌患者的研究。数种tlr9激动剂是已知的且当前在临床测试中进行开发，agatolimod(含有3个cpg基序的一种合成24聚物寡核苷酸的二十三钠盐；pfizer)，gnkg168(cpgodn；sbibiotech)，imo-2055(含有未甲基化cpg二核苷酸的合成寡核苷酸；iderapharmaceuticals)，mgn-1703(mologen)。典型地，这些tlr9激动剂用于治疗不同癌症：
schroder，k等人，jleukocbiol.81(6)(2007)1577-90涉及tlr激动剂(含有未甲基化cpg的dna(cpgdna))对小鼠tlr9表达的调节，并阐释了ifn-γ放大小鼠巨噬细胞对cpgdna的应答的分子机制。
术语“toll样受体9”(tlr9，cd289；seqidno：32)指toll样受体(tlr)家族的一种蛋白质，它在病原体识别和先天免疫激活中发挥基础作用。tlr从果蝇到人高度保守且共享结构和功能相似性。它们识别在传染因子上表达的病原体相关分子样式(pamp)，且介导有效免疫形成必需的细胞因子的生成。多种多样的tlr展现不同的表达样式。此基因在富含免疫细胞的组织中优先表达，诸如脾，淋巴结，骨髓和外周血白细胞。小鼠和人中的研究指示此受体介导针对细菌dna中的未甲基化cpg二核苷酸的细胞应答以发起先天免疫应答。
tlr9主要在b细胞，单核细胞，巨噬细胞和类浆树突细胞dc的内体隔室中找到(galluzzi等人，oncoimmunology，1：5(2012)699-716)。tlr9的主要配体是细菌/病毒dna，因未甲基化cpg寡聚脱氧核苷酸的频率升高而不同于它的哺乳动物对应物。事实上，尽管哺乳动物dna没有免疫刺激活性，然而施用细菌/病毒dna在体内诱导有力的th1免疫应答，它在tlr9-/-小鼠中完全消除。cpg寡聚脱氧核苷酸(或cpgodn)是含有胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸("c")，接着是鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸("g")的短单链合成dna分子。"p"指连续核苷酸之间的磷酸二酯连接，尽管一些odn改为具有经修饰的硫代磷酸酯(ps)主链。当这些cpg基序未甲基化时，它们作为免疫刺激物起作用(weiner，gj等人，pnas94(1997)10833-7)。如此，“toll样受体9激动剂”(tlr9激动剂)特征在于结合toll样受体9且刺激tlr9免疫应答。例如，在一个实施方案中，toll样受体9激动剂(tlr9激动剂)特征在于结合人类浆树突细胞(pdc)上的toll样受体9且在这些类浆树突细胞(pdc)中诱导ifn-α，il-6，和/或il-12(提高ifn-α，il-6，和/或il-12的水平)
由于它们在微生物基因组中的丰富性但它们在脊椎动物基因组中的稀有性，cpg基序被认为是病原体相关分子样式(pamp)(bauer，s，currenttopicsinmicrobiologyandimmunology270(2002)145-54)。cpgpamp受到样式识别受体(prr)toll样受体9(tlr9)识别，后者仅在人和其它高等灵长类动物中的b细胞和类浆树突细胞(pdc)中组成性表达(rothenfusser，s等人，humanimmunology63(2002)1111-9)。
合成cpgodn与微生物dna区别在于它们具有部分或完全硫代磷酸酯化(ps)主链代替典型的磷酸二酯主链和3'末端，5'末端，或二者处的聚g尾。ps修饰保护odn免于被身体中的核酸酶(诸如dna酶)降解，而聚g尾增强细胞摄取(dalpke，ah等人，immunology106(2002)102-12)。聚g尾形成分子间四分体，导致高分子量聚集物。这些聚集物对聚g序列所给予的升高的活性负有责任；而非序列自身。
已经作为佐剂广泛研究了这些含有未甲基化cpg基序的合成寡聚脱氧核苷酸(cpgodn)，诸如odn1826(steinhagenf等人，2011，vaccine29(17)：3341-55)。与哺乳动物dna相比，这些cpg基序以高20倍的频率存在于细菌dna中(hemmih等人，2000，nature408：740-5)。cpgodn激动在人b细胞和类浆树突细胞(pdc)上表达的tlr9，由此诱导th1占优势的免疫应答(coffman等人，2010，immunity33(4)：492-503)。在啮齿类动物和非人灵长类动物中进行的临床前研究和人临床试验已证明cpgodn能显著改善疫苗特异性抗体应答(steinhagenf等人，2011，vaccine29(17)：3341-55)。
已显示众多序列刺激tlr9，它们在cpg二聚体的数目和定位，以及cpg二聚体侧翼的精确碱基序列方面有变化。这导致创建cpgodn的类或范畴，根据它们的序列，二级结构，和对人外周血单个核细胞(pbmc)的作用，都是tlr9激动剂。cpgodn的三个主要类是a，b和c类，区别在于它们的免疫刺激活性(kruga等人，2001，eurjimmunol，31(7)：2154-63)。而且，cpgodn以物种特异性方式激活tlr9(bauer，s等人，2001，pnas，98(16)：9237-42)。第一a类odn之一，odn2216，由krug等人于2001年描述(见上文)。这类odn明显不同于先前描述的b类odn(即odn2006)，在于它刺激大量i型干扰素(最重要的是ifnα)生成且诱导pdc成熟。
经由间接细胞因子信号传导，a类odn还是nk细胞的强激活物。a类odn通常在两个末端之一或二者含有7至10个ps修饰碱基，它们抵抗核酸酶的降解作用且延长odn的寿命。上述规则严格定义该类，但是这些“规则”内的序列可能有变化。还应当注意，序列的改变会影响响应的程度。例如，内部回文序列长度可以是4至8个碱基对且碱基次序有变化，然而，发现样式5'-pupucgpupycgpypy-3'与数种其它序列相比是最有活性的。在dna链任一末端找到的聚g尾长度和甚至数目可以有变化，但是它的存在对于该分子的活性是至关重要的。
b类odn(即odn2007)是人b细胞和单核细胞成熟的强刺激物。它们还刺激pdc成熟但是程度比a类odn和很小量的ifnα低。这类中的最强odn具有三个6聚物序列。由于它们诱导强体液免疫应答的能力(使得它们作为疫苗佐剂是理想的)，已作为治疗剂广泛研究b类odn。
odn1826是一种对小鼠tlr9特异性的b型cpgodn。b型cpgodn含有带一个或多个cpg二核苷酸的完全硫代磷酸酯主链且能强烈激活b细胞(kruga等人，2001，eurjimmunol，31(7)：2154-63)。已在众多动物模型中作为佐剂测试odn1826，一种小鼠反应性替代tlr9激动剂(bauer，s等人，2001，pnas，98(16)：9237-42)。小鼠中的研究证明了odn1826施用能诱导i型ifn抗病毒活性8-9和抗原呈递细胞激活，指示th1免疫应答(longhimp等人，2009，jexpmed206：1589-602)。
此外，对携带肿瘤的啮齿类动物施用b型cpg寡核苷酸(单独或与化疗剂或肽疫苗组合)据报告发挥有力的抗癌效果。2000年4月发起了初始i/ii期临床试验来测试cpg-7909针对肿瘤学适应症的安全性和功效。大约同一时段开始针对癌症无关适应症(主要是抗病毒疫苗)作为佐剂广泛调查cpg-7909，显示没有严重的副作用和令人鼓舞的功效。
在最近十年，已在大量i/ii期临床试验中调查cpg-7909(作为孤立药剂或与化疗和/或疫苗接种办法组合)的安全性和抗癌潜力，包括白血病，淋巴瘤，基细胞癌，黑素瘤，食管鳞状细胞癌，nsclc，肾细胞癌，和前列腺癌患者的研究。数种tlr9激动剂是已知的且当前在临床测试中进行开发，agatolimod(含有3个cpg基序的一种合成24聚物寡核苷酸的二十三钠盐；pfizer)，gnkg168(cpgodn；sbibiotech)，imo-2055(含有未甲基化cpg二核苷酸的合成寡核苷酸；iderapharmaceuticals)，mgn-1703(mologen)。典型地，这些tlr9激动剂用于治疗不同癌症：
含有未甲基化cpg基序的细菌和合成dna作为tlr9的激动剂起作用且诱导th1型免疫应答概况。tlr9激动剂的免疫刺激效果是多因子的且依赖于核苷酸序列，主链的性质和特定结构基序的存在。根据诱导的细胞因子概况，已描述三种独特类型的tlr9激动剂，a，b和c类。每一类tlr9激动剂由不同核苷酸序列构成，其容许生成不同免疫概况的结构(或无结构)形成。
系统研究了作为tlr9的激动剂起作用的寡核苷酸的结构-活性相关性(kandimalla，e.r.和agrawal，s.(2005)于tollandtollreceptor：animmunologicperspective(rich，t.，ed.)，pp.181-212，kluweracademic/plenumpublishers，newyork)。寡核苷酸中cpg基序的存在是tlr9刺激所要求的。具有磷酸二酯和硫代磷酸酯主链的寡核苷酸刺激tlr9介导的免疫应答。常常使用硫代磷酸酯主链寡核苷酸，因为它们比磷酸二酯寡核苷酸对遍在的核酸酶的降解作用不太易感。在核苷酸间磷酸二酯键上引入硫原子导致rp和sp非对映异构体形成；硫代磷酸酯连接的rp非对映体刺激比sp非对映体强的tlr9介导的免疫应答。胞嘧啶(c)和鸟嘌呤(g)之间和邻近的磷酸上的负电荷也是tlr9介导的活性所要求的。通过在这些位置掺入甲基膦酸酯连接中和电荷导致免疫刺激性活性丧失。此外，tlr9激活还依赖于cpg二核苷酸侧翼的序列，核苷酸主链的性质和二级结构。
侧翼序列在tlr9刺激中发挥重要作用
在cpg基序中的c或g核苷酸的糖环的2′位引入化学修饰导致tlr9激动剂丧失免疫刺激性活性。另外，在侧翼序列中含有化学修饰诸如甲基膦酸酯连接，2′-烃基或3′-脱氧或-烃基核糖核苷，非核苷酸接头或无碱基核苷酸的tlr9激动剂的研究指示在cpg二核苷酸5′第四个至第六个核苷酸位置掺入取代显著增强免疫刺激性活性。一般而言，在远离cpg二核苷酸的3′-侧翼序列中掺入修饰具有依赖于修饰性质的影响。
tlr9的刺激要求激动剂有游离5′端。
经由它们的5′端连接的两个cpg寡核苷酸不激活免疫细胞，尽管有两个cpg基序可用。当相同寡核苷酸经由它们的3′端连接时，它们生成比具有一个5′端的亲本cpg寡核苷酸要高且独特的细胞因子概况。这些是第一个证明tlr9激活要求可及或游离的5′端且受体自5′端读序列的研究。转录因子nf-κb受含有两个5′端的tlr9激动剂快速激活，但是在j774细胞中这些化合物与常规tlr9激动剂对mapk(丝裂原激活的蛋白质激酶)途径具有相同活性。
这些研究提示含有两个5′端的激动剂推动受体二聚化，引起免疫应答快速激活。此外，tlr9激活能经由合成免疫刺激性基序和游离5′端的适宜呈递来调控，引起下游细胞因子诱导概况的变化。与这些结果一致，最近的研究已显示tlr9以二聚体形式存在且结合单链寡核苷酸。然而，只有含有cpg基序的寡核苷酸引起受体的构象变化，引起免疫信号传导途径激活。
寡核苷酸经由它们3′端的附着不仅提供两个5′端用于最佳tlr9激活，而且还提高针对3′-外切核酸酶的稳定性。具有磷酸二酯主链且短至5和6个nt的经由它们的3′端连接的寡核苷酸作为有力的tlr9激动剂起作用且生成免疫应答。此外，由于它们在胃肠道中的极大稳定性，口服施用含有新颖结构的tlr9激动剂诱导有力的粘膜免疫应答，作为佐剂与抗原一起起作用，且在小鼠模型中预防和逆转花生变态反应。
tlr9刺激所要求的胞嘧啶和鸟嘌呤的官能团
如上所述，在cpg二核苷酸内引入的改变结构和构象的某些化学修饰引起激动剂丧失免疫刺激性活性。一种此类修饰是替换tlr9激动剂的cpg基序中的胞嘧啶的5位处的甲基基团。脊椎动物使用此特征来区分自身dna与细菌dna，后者含有更多的未甲基化cpg基序。
代替胞嘧啶，多种多样嘧啶类似物(y)的效果，诸如5-oh-dc，du，dp，1-(2′-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-2-氧-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，n3-me-dc和n4-et-dc(kandimalla，e.r.等人(2001)bioorg.med.chem.9，807-813；kandimalla，e.r.等人s.(2003)pnas.100，14303-14308；或putta，m.r.等人s.(2006)nucleicacidsres.34，3231-3238)。为了了解鸟嘌呤的不同官能团在tlr9识别中的作用，代替cpg中的鸟嘌呤检查了数种嘌呤核碱基(r)，诸如7-脱氮-dg，n1-me-dg，2-氨基-d-嘌呤，水粉蕈素，2-氨基-da，7-脱氮-d-黄嘌呤，k碱基和di(kandimalla，e.r.等人(2001)bioorg.med.chem.9，807-813；kandimalla，e.r.等人(2003)pnas.100，14303-14308；putta，m.r.等人(2006)nucleicacidsres.34，3231-3238；kandimalla，e.r.等人(2003)nucleicacidsres.31，2393-2400；或kandimalla，e.r.等人(2005)pnas.102，6925-6930)。这些研究引起用于免疫调控的备选合成核苷酸基序(ypg，cpr)的开发且已证明tlr9对某些杂环碱基变体的接受。
新颖合成tlr9激动剂(s.agrawal和e.r.kandimalla，biochemicalsocietytransactions(2007)35：1461-1467)。上文所述新颖结构和合成免疫刺激性基序的组合给我们提供工具来生成新颖合成tlr9激动剂的组合文库。小鼠，人和猴系统中具有两个5′端且含有不同核苷酸组合的合成cpr二核苷酸的数种tlr9激动剂的系统研究提示核苷酸序列和二级结构在调控免疫应答中发挥作用。基于这些研究，我们已广泛鉴定出两组不同的合成tlr9激动剂。
在一个实施方案中，tlr9激动剂特征在于在类浆树突细胞(pdc)中诱导ifn-α，il-6，和/或il-12(提高ifn-α，il-6，和/或il-12的水平)。在一个实施方案中，tlr9激动剂特征在于在人类浆树突细胞(pdc)中提高ifn-α的水平(如通过下文或例如wo2010/088395中描述的夹心式elisa测量的)。
用于测量人pdc中本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂的ifn-α诱导(提高ifn-α，il-6，和/或il-12的水平)的测定法
人pbmc分离：通过ficoll密度梯度离心法(histopaque-1077，sigma)自新鲜采集的健康志愿者血液(cbrlaboratories，boston，ma)分离外周血单个核细胞(pbmc)。
人pdc分离：使用bdca4细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)依照制造商的说明书通过正选择自新鲜获得的健康人志愿者血液pbmc分离人类浆树突细胞(pdc)。
以1x106个细胞/ml将人pdc分配入96孔盘。在dpbs(ph7.4；mediatech)中溶解来自表1的各种免疫调控性化合物，并以0，0.1，0.3，1.0，3.0，或10.0μg/ml的剂量添加至细胞培养物。然后将细胞于37℃温育24小时，并收集上清液用于luminex多路或elisa测定法。
通过夹心式elisa测量ifn-α，il-6，和/或il-12的水平。需要的试剂(包括细胞因子抗体和标准品)可以自pharmingen购买。
知道ifn-α是抗病毒细胞因子已有多年。它刺激thl细胞发育，因此促进含有cg的dna分子的作用。ifn-α还在小鼠和人恶性中展现抗肿瘤活性且能够降低移植的肿瘤细胞的肿瘤发生力，部分通过激活细胞毒性t细胞及由此提高肿瘤细胞的细胞溶解的可能性来实现。ifn-α还提高nk细胞和巨噬细胞活性二者(对抗肿瘤细胞毒性也是重要的)(brassard等人，j.leukoc.biol.200271：565-81)。因此，用本公开文本的dna构建物刺激后提高ifn-α的量预期对癌症治疗是有益的。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序(cprodn)的寡聚脱氧核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)嘌呤-磷酸-鸟嘌呤(rpg)基序(rpgodn)的寡聚脱氧核苷酸，其中该tlr9激动剂刺激tlr9(在一个实施方案中，该tlr9激动剂诱导类浆树突细胞(pdc)成熟；在一个实施方案中，该tlr9激动剂特征在于人b细胞成熟；在一个实施方案中)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是含有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序的寡聚脱氧核苷酸(cpgodn)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是a类cpgodn。
在一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是包含下述各项的寡聚脱氧核苷酸：
a)5'端，或3'端，或两端的聚g序列，
b)内部回文序列，
c)内部回文序列内包含的gc二核苷酸，和
d)部分ps修饰的主链
a类cpgodn通常在一端或两端含有7至10个ps修饰的碱基，它们抵抗核酸酶的降解作用且延长odn的寿命。上述规则严格定义该类，但是这些规则内的序列可能有变化。内部回文序列长度可以是4至8个碱基对且碱基次序有变化，然而，发现样式5'-pupucgpupycgpypy-3'与数种其它序列相比是最有活性的。在dna链的任一端找到的聚g尾长度和数目可以有变化。
在一个实施方案中，a类cpgodn(xueqingliang等人，blood.2010june17；115(24)：5041-5052)选自下组：cpgodn2216(5′-gggggacgatcgtcgggggg-3′)(seqidno：17)；cpgodnpb4(5′-tcggacgatcgtcgggggg-3′)(seqidno：18)；或cpgodn1002(5′-ggggtcgttcgtcgttgggggg-3′)(seqidno：19)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是b类cpgodn。
在一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是包含下述各项的寡聚脱氧核苷酸：
a)一个或多个6聚物未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序5'-pupycgpypu-3'(一个或多个6聚物5'-rycgyr-3'6聚物(r＝a或g；y＝t或c))，
b)完全硫代磷酸酯化(ps修饰)的主链，和
c)18至28个核苷酸(长度)
在一个实施方案中，b类cpgodn选自下组：cpg-28，cpg-685(gnkg168；cpgodn；sbibiotech)，cpg-684和cpg-7909(cpg-odn2006，pf-3512676，agatolimod)。
cpg-7909(cpg2006，pf-3512676，agatolimod)是一种合成的，24聚物硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸(d(p-thio)(t-c-g-t-c-g-t-t-t-t-g-t-c-g-t-t-t-t-g-t-c-g-t-t)dna)(5′-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3′)(seqidno：20)，其含有多个胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序或其衍生物之一，像二十三钠盐。制备记载于例如wo9818810或us7223741)
cpg-685(gnkg168；cpgodn；sbibiotech)是合成的，21聚物，基于未甲基化cpg基序的寡聚脱氧核苷酸(odn)(685，5′-tcgtcgacgtcgttcgttctc-3′)(seqidno：21)，其具有免疫刺激性活性。cpg685(gnkg168)(一种21聚物完全硫代磷酸酯化寡核苷酸，设计成直接靶向在b细胞中介导细胞应答的toll样受体9)在scid小鼠中显示抗肿瘤效果，而且处于人慢性淋巴细胞性白血病(b-cll)治疗的临床开发(sbibiotechco)。在本文中，以血浆和细胞裂解物开发了一种灵敏且特异性的测定法以支持其临床前药理学研究。cpg寡聚脱氧核苷酸gnkg168结合并激活toll样受体9(tlr9)且通过胞吞被摄取入细胞中；一旦内在化，它可激活众多信号转导途径，导致释放多种细胞因子，诸如免疫球蛋白(ig)，干扰素(ifn)，白介素(il)和肿瘤坏死因子(tnf)。
cpg-684是合成的，23聚物，基于未甲基化cpg基序的寡聚脱氧核苷酸(odn)684，5′-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3′(seqidno：22)；
cpg-28合成的基于未甲基化cpg基序的寡聚脱氧核苷酸(odn)，含有多次重复的具有免疫刺激活性的未甲基化cpg基序(cpgodn)(5′-taaacgttataacgttatgacgtcat-3′)(seqidno：23)及完全硫代磷酸酯主链(carpentieraf等人，frontbiosci.2003；8：e115-e127；mengy等人，intjcancer.2005；116：992-997；或carpentiera等人，neuro-oncology2006；8：60-66)。在经胞吞进入细胞时，cpg-28激活众多信号转导途径，导致释放多种细胞因子。cpg-28具有免疫调控特性，直接激活b淋巴细胞，树突和nk细胞导致刺激先天免疫和抗体依赖性细胞细胞毒性(adcc)。另外，此药剂间接调控t细胞应答，这经由释放细胞因子(il-12和ifnγ)以诱导朝向th1(辅助)表型的优先转换，导致cd8+细胞细胞毒性增强来实现。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是含有嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序的寡聚脱氧核苷酸(ypgodn)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是含有胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序的寡聚脱氧核苷酸(cprodn)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是imo-2055(idera)(由3'-3'连接的结构和合成cpr(r＝2'-脱氧-7-脱氮鸟嘌呤)基序组成的odn)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序(cprodn)的寡聚脱氧核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合治疗中使用的tlr9激动剂是基于含有cpg基序的环状odn的寡聚脱氧核苷酸(例如mgn-1703，其来自mologen，记载于wo2012/085291)，其基于
在本发明的一个实施方案中，tlr9激动剂选自下组：cpgodn2216，cpgodn1002，cpg-28，cpg-685，cpg-684，cpg-7909，imo-2055或mgn-1703。在本发明的一个实施方案中，tlr9激动剂选自下组：cpg-685，cpg-7909，imo-2055或mgn-1703。在一个实施方案中，tlr9激动剂选自下组：cpg-7909，imo-2055或mgn-1703。
在本发明的一个实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人csf-1r的抗体特征在于包含
a)seqidno：1的重链可变域vh和seqidno：2的轻链可变域vl，或
b)seqidno：3的重链可变域vh和seqidno：4的轻链可变域vl，或
c)seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，或
d)seqidno：7的重链可变域vh和seqidno：8的轻链可变域vl，或
e)seqidno：9的重链可变域vh和seqidno：10的轻链可变域vl；且
组合疗法中使用的tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序(cprodn)的寡聚脱氧核苷酸(优选含有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)的寡聚脱氧核苷酸)。
在本发明的一个优选实施方案中，本文中描述的组合疗法中使用的结合人csf-1r的抗体特征在于包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
组合疗法中使用的tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序(cprodn)的寡聚脱氧核苷酸(优选含有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)的寡聚脱氧核苷酸)。
术语“表位”表示能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面聚组组成，而且表位通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于对前者而非后者的结合在变性溶剂存在下丧失。
如本文中使用的，“可变域”(轻链可变域vl，重链可变域vh)表示轻和重链域对中的每一个，它们直接涉及抗体对抗原的结合。可变轻和重链域具有相同的整体结构，而且每个域包含四个框架(fr)区，它们的序列是广泛保守的，由三个“高变区”(或互补决定区，cdr)连接。框架区采取β-片层构象，而且cdr可以形成连接β-片层结构的环。每条链中的cdr通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的cdr一起形成抗原结合位点。抗体的重和轻链cdr3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，而且因此提供本发明的又一个目的。
术语“抗体的抗原结合部分”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基。“框架”或“fr”区是可变域中那些与本文中定义的高变区残基不同的区。因此，抗体的轻和重链可变域自n至c端包含域fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，和fr4。尤其地，重链的cdr3是对抗原结合贡献最大且限定抗体特性的区。cdr和fr区依照kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。
如本文中使用的，术语“核酸”或“核酸分子”意图包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链dna。
如本本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸组，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：a)，精氨酸(arg，r)，天冬酰胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半胱氨酸(cys，c)，谷氨酰胺(gln，q)，谷氨酸(glu，e)，甘氨酸(gly，g)，组氨酸(his，h)，异亮氨酸(ile，i)，亮氨酸(leu，l)，赖氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，脯氨酸(pro，p)，丝氨酸(ser，s)，苏氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，和缬氨酸(val，v)。
抗体的“fc部分”不直接涉及抗体对抗原的结合，但是展现出多种效应器功能。“抗体的fc部分”是熟练技术人员公知的术语，而且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割定义。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白分成类：iga，igd，ige，igg和igm，并且这些中的数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如igg1，igg2，igg3，和igg4，iga1，和iga2。依照重链恒定区，不同类的免疫球蛋白分别称作α，δ，ε，γ，和μ。抗体的fc部分直接涉及基于补体激活，c1q结合和fc受体结合的adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和cdc(补体依赖性细胞毒性)。补体激活(cdc)是通过补体因子c1q结合大多数igg抗体亚类的fc部分启动的。虽然抗体对补体系统的影响依赖于某些条件，但是对c1q的结合是由fc部分中的限定结合位点引起的。此类结合位点是本领域现有技术中已知的，而且记载于例如boackle，r.j.等人，nature282(1979)742-743；lukas，t.j.等人，j.immunol.127(1981)2555-2560；brunhouse，r.和cebra，j.j.，mol.immunol.16(1979)907-917；burton，d.r.等人，nature288(1980)338-344；thommesen，j.e.等人，mol.immunol.37(2000)995-1004；idusogie，e.e.等人，j.immunol.164(2000)4178-4184；hezareh，m.等人，j.virology75(2001)12161-12168；morgan，a.等人，immunology86(1995)319-324；ep0307434。此类结合位点是例如l234，l235，d270，n297，e318，k320，k322，p331和p329(依照kabat，e.a.的eu索引的编号方式，参见下文)。亚类igg1，igg2和igg3的抗体通常显示补体激活及c1q和c3结合，而igg4不激活补体系统，而且不结合c1q和c3。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体包含自人起源衍生的fc部分和优选地，人恒定区的所有其它部分。如本文中使用的，术语“自人起源衍生的fc部分”表示如下的fc部分，其是属于亚类igg1，igg2，igg3或igg4的人抗体的fc部分，优选来自人igg1亚类的fc部分，来自人igg1亚类的突变型fc部分(在一个实施方案中具有l234a+l235a上的突变)，来自人igg4亚类的fc部分或来自人igg4亚类的突变型fc部分(在一个实施方案中具有s228p上的突变)。在一个优选实施方案中，人重链恒定区是人igg1亚类的，在另一个优选实施方案中，人重链恒定区是具有突变l234a，l235a和p329的人igg1亚类的，在另一个优选实施方案中，人重链恒定区是人igg4亚类的，而在另一个优选实施方案中，人重链恒定区是具有突变s228p的人igg4亚类的。在一个实施方案中，所述抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在一个实施方案中，所述最小限度的效应器功能源自效应器降低性fc突变。在一个实施方案中，所述效应器降低性fc突变为l234a/l235a或l234a/l235a/p329g或n297a或d265a/n297a。在一个实施方案中，为每种抗体选择的所述效应器降低性fc突变彼此独立地选自包含l234a/l235a，l234a/l235a/p329g，n297a和d265a/n297a的组(由l234a/l235a，l234a/l235a/p329g，n297a和d265a/n297a组成的组)。
在一个实施方案中，本文中描述的抗体属于人igg类(即属于igg1亚类，igg2亚类，igg3亚类或igg4亚类)。
在一个优选实施方案中，本文中描述的抗体属于人igg1亚类或人igg4亚类。在一个实施方案中，本文中描述的抗体属于人igg1亚类。在一个实施方案中，本文中描述的抗体属于人igg4亚类。
在一个实施方案中，本文中描述的抗体特征在于恒定链是人起源的。此类恒定链是本领域现有技术公知的，而且记载于例如kabat，e.a.，(参见例如johnson，g.和wu，t.t.，nucleicacidsres.28(2000)214-218)。例如，一种有用的人重链恒定区包含氨基酸序列seqidno：34。例如，一种有用的人轻链恒定区包含κ轻链恒定区氨基酸序列seqidno：33。
本发明包含用于治疗需要治疗的患者的方法，特征在于对该患者施用治疗有效量的依照本发明的抗体。
本发明包含依照本发明的抗体用于所述治疗的用途。
本发明的一个实施方案是本文中描述的csf-1r抗体，其用于与本文中描述的选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合治疗癌症。
本发明的一个实施方案是本文中描述的csf-1r抗体，其用于与本文中描述的激动性cd40抗体组合治疗癌症。
本发明的一个实施方案是本文中描述的csf-1r抗体，其用于与本文中描述的拮抗性pd-l1抗体组合治疗癌症。
在本发明的一个优选实施方案中，该癌症是实体瘤。
在本发明的另一个优选实施方案中，该癌症是黑素瘤，结肠直肠癌，或间皮瘤。
如本文中使用的，术语“癌症”可以是例如肺癌，非小细胞肺(nscl)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌症，结肠癌，乳腺癌，子宫的癌症，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴门癌，何杰金(hodgkin)氏病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆囊癌，中枢神经系统(cns)新生物，脊柱轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑脊膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤，淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，包括任何上述癌症的顽固形式，或一种或多种上述癌症的组合。在一个优选的实施方案中，此类癌症是乳腺癌，结肠直肠癌，黑素瘤，头和颈癌，肺癌或前列腺癌。在一个优选的实施方案中，此类癌症是乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，肺癌或前列腺癌。在另一个优选的实施方案中，此类癌症是乳腺癌，肺癌，结肠癌，卵巢癌，黑素瘤，膀胱癌，肾的癌，肾癌，肝癌，头和颈癌，结肠直肠癌，胰腺癌，胃癌，食管癌，间皮瘤，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，骨髓瘤。在一个优选的实施方案中，此类癌症进一步特征在于csf-1或csf-1r表达或过表达。本发明的又一个实施方案是本发明的csf-1r抗体，用于同时治疗原发性肿瘤和新转移。如此，本发明的另一个实施方案是本发明的csf-1r抗体，用于治疗牙周炎，组织细胞增多病x，骨质疏松症，佩吉特(paget)氏骨病(pdb)，癌症治疗所致骨丢失，假体周围骨质溶解，糖皮质激素诱导的骨质疏松，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，骨关节炎，炎性关节病(inflammatoryarthridities)，和炎症。
优选通过重组手段来生产本文中描述的抗体。此类方法是现有技术广泛知道的，而且包括原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体多肽且通常纯化至药学可接受纯度。为了蛋白质表达，通过标准方法将编码轻和重链或其片段的核酸插入表达载体中。在适宜的原核或真核宿主细胞中实施表达，诸如cho细胞，ns0细胞，sp2/0细胞，hek293细胞，cos细胞，酵母，或大肠杆菌细胞，并自细胞(自上清液或在细胞裂解后)回收抗体。
抗体的重组生产是现有技术公知的，而且记载于例如综述性论文makrides，s.c.，proteinexpr.purif.17(1999)183-202；geisse，s.等人，proteinexpr.purif.8(1996)271-282；kaufman，r.j.，mol.biotechnol.16(2000)151-161；werner，r.g.，drugres.48(1998)870-880。
抗体可以存在于完整细胞中，细胞裂解物中，或部分纯化的或实质性纯的形式。通过标准技术实施纯化以消除其它细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质，标准技术包括碱/sds处理，cscl成带，柱层析，琼脂糖凝胶电泳，和本领域公知的其它技术。参见ausubel，f.等人编，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingandwileyinterscience，newyork(1987)。
ns0细胞中的表达记载于例如barnes，l.m.等人，cytotechnology32(2000)109-123；barnes，l.m.等人，biotech.bioeng.73(2001)261-270。瞬时表达记载于例如durocher，y.等人，nucl.acids.res.30(2002)e9。可变域的克隆记载于orlandi，r.等人，proc.natl.acad.sci.usa86(1989)3833-3837；carter，p.等人，proc.natl.acad.sci.usa89(1992)4285-4289；norderhaug，l.等人，j.immunol.methods204(1997)77-87。一种优选的瞬时表达系统(hek293)记载于schlaeger，e.-j.和christensen，k.，cytotechnology30(1999)71-83，及schlaeger，e.-j.，j.immunol.methods194(1996)191-199。
将依照本发明的重和轻链可变域与启动子，翻译起始，恒定区，3'非翻译区，聚腺苷酸化，和翻译终止的序列组合以形成表达载体构建物。可以将重和轻链表达构建物组合入单一载体中，共转染，序贯转染，或分开转染入宿主细胞中，然后融合以形成表达双链的单一宿主细胞。
适合于原核生物的控制序列包括例如启动子，任选的操纵基因序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，增强子和聚腺苷酸化信号。
在将核酸放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时，它是“可操作连接的”。例如，若前序列或分泌前导的dna以参与多肽分泌的前蛋白表达，则它与多肽的dna可操作连接；若启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作连接；或者若核糖体结合位点定位为使得便于翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意指所连接的dna序列是连续的，而且在分泌前导的情况中，是连续的且在读码框中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点，则依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白a-sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析，或亲和层析，恰当地将单克隆抗体与培养液分开。使用常规规程，容易分离编码单克隆抗体的dna和rna及测序。杂交瘤细胞可充当此类dna和rna的来源。一旦分离，可以将该dna插入表达载体中，然后将该表达载体转染入不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(诸如hek293细胞，cho细胞，或骨髓瘤细胞)中，以获得该宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。
如本文中使用的，表述“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化子”和“经转化细胞”包括原代受试细胞及自其衍生的培养物，不管转移的次数。还理解，由于有意的或无意的突变，所有后代的dna内容可以不是精确相同的。包括具有在初始转化细胞所筛选的相同功能或生物学活性的变异后代。
在另一个方面，本发明提供含有一种或一组本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，与药学可接受载体一起配制的组合物，例如药物组合物。
如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有生理学相容的溶剂，分散介质，涂层，抗细菌和抗真菌剂，等张和吸收/再吸收延迟剂，等等。优选地，载体适合于注射或输注。
可以通过本领域已知的多种方法来施用本发明的组合物。正如技术人员会领会的，施用的路径和/或模式会随期望的结果而变化。
药学可接受载体包括无菌水溶液或分散体和用于制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂对药学活性物质的使用是本领域已知的。在水之外，载体可以是例如等张缓冲盐水溶液。
不管选择的施用路径，通过本领域技术人员知道的常规方法将可以以合适水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
本发明的药物组合物中活性组分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者，组合物，和施用模式有效实现期望治疗响应，对患者没有毒性的活性组分量(有效量)。选择的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括采用的本发明特定组合物或其酯，盐或酰胺的活性，施用路径，施用时间，采用的特定化合物的排泄速率，与采用的特定组合物组合使用的其它药物，化合物和/或材料，治疗的患者的年龄，性别，重量，状况，一般健康和在先医学史，及医学领域公知的类似因素。
术语“治疗方法”或其等同用语在应用于例如癌症时指设计为降低或消除患者中的癌细胞数目，或者减轻癌症症状的规程或作用过程。癌症或另一种增殖性病症的“治疗方法”不必意味着实际上会消除癌细胞或其它病症，实际上会降低细胞数目或病症，或实际上会减轻癌症或其它病症的症状。经常，甚至会实施具有较低的成功概率，但是然而鉴于医学史和估计的患者存活预期认为诱导总体有益的作用过程的治疗癌症的方法。
术语“与……组合施用”，“共施用”，“组合疗法”或“组合治疗”指例如作为分开的配制剂/应用(或者作为一种单一配制剂/应用)施用本文中描述的抗csf-1r和本文中描述的选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂。共施用可以是同时的或者以任意次序序贯的，其中有一个时段所有活性剂同时在各自治疗周期内发挥它们的生物学活性，其中共施用本文中描述的抗csf-1r和本文中描述的选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂二者，且其中有一个时段在没有抗csf1r治疗的各自进一步的治疗周期中不发挥csf1r抗体的生物学活性且血清中肿瘤相关巨噬细胞(tam)和/或它们的前体人cd14+cd16+单核细胞的水平已经恢复(例如达到抗csf-1r治疗之前的原始水平的约80％)。共施用是同时的或序贯的(例如静脉内(i.v.)经由连续输注)。在一个实施方案中，共施用是同时的。在一个实施方案中，共施用是序贯的。共施用是同时的或序贯的(例如静脉内(i.v.)经由连续输注)。
不证自明的是，以“治疗有效量”(或仅为“有效量”)对患者施用抗体，所述治疗有效量是相应化合物或组合会引发研究人员，兽医，医学医生或其它临床医生寻找的组织，系统，动物或人的生物学或医学应答的量。
共施用量和共施用时机会取决于所治疗患者的类型(物种，性别，年龄，重量，等)和状况和所治疗疾病或状况的严重性。可以一次或在一系列治疗里，例如在同一天或在次日对患者适当地共施用所述抗csf-1r抗体和别的药剂。
在与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合的抗csf-1r抗体以外，还可以施用化疗剂。
在一个实施方案中，此类可以与如本文中描述的抗csf-1r抗体和如本文中描述的选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂一起施用的另外的化疗剂包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂，包括：氮芥，诸如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，异环磷酰胺(ifosfamide)，美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)；亚硝基脲(nitrosourea)，诸如卡莫司汀(carmustine)(bcnu)，洛莫司汀(lomustine)(ccnu)，和司莫司汀(semustine)(methyl-ccnu)；temodaltm(替莫唑胺(temozolamide))，乙撑亚胺/甲基蜜胺诸如三乙撑蜜胺(tem)，三乙烯硫代磷酰胺(塞替派(thiotepa))，六甲基蜜胺(hmm，六甲蜜胺(altretamine))；烃基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)；三嗪，诸如达卡巴嗪(dacarbazine)(dtic)；抗代谢物，包括叶酸类似物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和三甲曲沙(trimetrexate)，嘧啶类似物，诸如5-氟尿嘧啶(5fu)，氟脱氧尿苷，吉西他滨(gemcitabine)，胞嘧啶阿拉伯糖苷(arac，阿糖胞苷(cytarabine))，5-氮胞苷，2,2'-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物，诸如6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，硫唑嘌呤(azathioprine)，t-脱氧柯福霉素(喷司他丁(pentostatin))，赤羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine(ehna))，磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)，和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-cda)；天然产物，包括抗有丝分裂药物，诸如帕利他赛(paclitaxel)，长春花生物碱(包括长春碱(vinblastine)(vlb)，长春新碱(vincristine)，和长春瑞滨(vinorelbine))，泰索帝(taxotere)，雌莫司汀(estramustine)，和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素(pipodophylotoxin)，诸如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，诸如放线菌素d(actimomycind)，道诺霉素(daunomycin)(柔红霉素(rubidomycin))，多柔比星(doxorubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，伊达比星(idarubicin)，博来霉素(bleomycin)，普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))，丝裂霉素c(mitomycinc)，和放线菌素(actinomycin)；酶，诸如l-天冬酰胺酶；生物学应答改性剂，诸如干扰素-α，il-2，g-csf和gm-csf；包括铂配位复合物的混杂剂，诸如奥沙利铂(oxaliplatin)，顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)，蒽二酮，诸如米托蒽醌(mitoxantrone)，取代的脲，诸如羟基脲，甲基肼衍生物，包括n-甲基肼(mih)和丙卡巴肼(procarbazine)，肾上腺皮质阻抑剂，诸如米托坦(mitotane)(o，p-ddd)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，诸如强的松(prednisone)及等效物，地塞米松(dexamethasone)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；gemzartm(吉西他滨(gemcitabine))，妊娠素，诸如己酸羟基孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)，乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)和乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)；雌激素，诸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和乙炔雌二醇等效物；抗雌激素，诸如他莫昔芬(tamoxifen)；雄激素，包括丙酸睾酮(testosteronepropionate)和氟甲睾酮(fluoxymesterone)/等效物；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)，促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林(leuprolide)；和非类固醇抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)。靶向后成机制的疗法包括但不限于组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，脱甲基化剂(例如vidaza)和释放转录阻抑(atra)疗法也可以与抗原结合蛋白质组合。在一个实施方案中，化疗剂选自下组：紫杉烷(像例如帕利他赛(taxol)，多西他赛(taxotere)，经修饰的帕利他赛(例如abraxane和opaxio)，多柔比星，舒尼替尼(sutent)，索拉非尼(nexavar)，和其它多激酶抑制剂，奥沙利铂，顺铂和卡铂，依托泊苷，吉西他滨，和长春碱。在一个实施方案中，化疗剂选自下组：紫杉烷(像例如帕利他赛(taxol)，多西他赛(taxotere)，经修饰的帕利他赛(例如abraxane和opaxio)。在一个实施方案中，别的化疗剂选自5-氟尿嘧啶(5-fu)，亚叶酸，伊立替康，或奥沙利铂。在一个实施方案中，化疗剂为5-氟尿嘧啶，亚叶酸和伊立替康(folfiri)。在一个实施方案中，化疗剂为5-氟尿嘧啶和奥沙利铂(folfox)。在一个优选的实施方案中，不跟与抗cd40抗体组合的抗csf-1r抗体一起施用别的化疗剂。
与别的化疗剂的组合疗法的具体例子包括例如与紫杉烷(例如多西他赛或帕利他赛)或经修饰的帕利他赛(例如abraxane或opaxio)，多柔比星，卡培他滨和/或贝伐单抗(avastin)用于治疗乳腺癌的疗法；与卡铂，奥沙利铂，顺铂，帕利他赛，多柔比星(或经修饰的多柔比星(caelyx或doxil))，或拓扑替康(hycamtin)用于卵巢癌的疗法；与多激酶抑制剂mki(sutent，nexavar，或706)和/或多柔比星用于治疗肾癌的疗法；与奥沙利铂，顺铂和/或放射用于治疗鳞状细胞癌的疗法；与taxol和/或卡铂用于治疗肺癌的疗法。
因此，在一个实施方案中，别的化疗剂选自下组：紫杉烷(多西他赛或帕利他赛)或经修饰的帕利他赛(abraxane或opaxio)，多柔比星，卡培他滨和/或贝伐单抗(用于治疗乳腺癌)。
在一个优选的实施方案中，不跟与抗cd40抗体组合的抗csf-1r抗体一起施用别的化疗剂。
氨基酸序列说明
seqidno：1重链可变域，hmab2f11-c11
seqidno：2轻链可变域，hmab2f11-c11
seqidno：3重链可变域，hmab2f11-d8
seqidno：4轻链可变域，hmab2f11-d8
seqidno：5重链可变域，hmab2f11-e7
seqidno：6轻链可变域，hmab2f11-e7
seqidno：7重链可变域，hmab2f11-f12
seqidno：8轻链可变域，hmab2f11-f12
seqidno：9重链可变域，hmab2f11-g1
seqidno：10轻链可变域，hmab2f11-g1
seqidno：11cd40激动性抗体cp-870,893(us7,338,660的抗体21.4.1)
的重链可变域
seqidno：12cd40激动性抗体cp-870,893(us7,338,660的抗体21.4.1)的轻链可变域
seqidno：13cd40激动性抗体人源化s2c6变体的重链可变域
seqidno：14cd40激动性抗体人源化s2c6变体的轻链可变域
seqidno：15抗pd-l1抗体阿特珠单抗的重链可变域
seqidno：16抗pd-l1抗体阿特珠单抗的轻链可变域
seqidno：17tlr9激动剂cpgodn2216
seqidno：18tlr9激动剂cpgodnpb4
seqidno：19tlr9激动剂cpgodn1002
seqidno：20tlr9激动剂cpg-7909(cpg2006，pf-3512676，agatolimod)
seqidno：21tlr9激动剂cpg-685(gnkg168；cpgodn；sbibiotech)
seqidno：22tlr9激动剂cpg-684
seqidno：23tlr9激动剂cpg-28
seqidno：24例示性人csf-1r(wtcsf-1r)
seqidno：25人csf-1r胞外域(域d1-d5)
seqidno：26人csf-1r片段域d1-d3
seqidno：27人csf-1r片段域d4-d5
seqidno：28人csf-1
seqidno：29人il-34
seqidno：30例示性人cd40
seqidno：31例示性人pd-l1
seqidno：32例示性人toll样受体9(tlr9)
seqidno：33人卡帕轻链恒定区
seqidno：34自igg1衍生的人重链恒定区
seqidno：35l234a和l235a上突变的自igg1衍生的人重链恒定区seqidno：36自igg4衍生的人重链恒定区
seqidno：37s228p上突变的自igg4衍生的人重链恒定区
下面描述本发明的具体实施方案：
1a.一种结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期(在一个实施方案中在每第三个周期)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
1b.一种结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在血清中的cd14+cd16+阳性单核细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
1c.一种结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在cd163+/cd68+阳性肿瘤相关巨噬细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
2.实施方案1a或1b或1c任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期(在一个实施方案中在每第三个周期)与该巨噬细胞激活组合剂施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
3.实施方案1至2任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该治疗周期的长度介于2和4周之间(在一个优选的实施方案中该治疗周期的长度介于18和24天之间且在另一个优选的实施方案中该治疗周期的长度是(约)3周)。
4.实施方案1至3任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中以600-1200mg的剂量(在一个实施方案中以750-1100mg的剂量，在一个实施方案中以750-1000，900-1000mg的剂量，在一个实施方案中750，在一个实施方案中900，在一个实施方案中1000)施用该抗csf-1r抗体。
5.实施方案1至4任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体且在每个周期以4-16mg的剂量(在一个实施方案中以8-16mg的剂量)施用。
6.实施方案1至4任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体且在每个周期以1100-1300mg的剂量(在一个实施方案中以1200的剂量)施用。
7.实施方案1至6任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该组合疗法用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展。
8.实施方案1至6任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该组合疗法用于刺激免疫应答或功能，诸如t细胞活性。
9.实施方案1至8任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该抗csf-1r抗体包含
a)seqidno：1的重链可变域vh和seqidno：2的轻链可变域vl，
或
b)seqidno：3的重链可变域vh和seqidno：4的轻链可变域vl，
或
c)seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，
或
d)seqidno：7的重链可变域vh和seqidno：8的轻链可变域vl，
或
e)seqidno：9的重链可变域vh和seqidno：10的轻链可变域vl。
10.实施方案1至5，7至9任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体。
11.实施方案10的用于治疗的抗csf-1r抗体，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
该激动性cd40抗体包含seqidno：11的重链可变域vh和seqidno：12的轻链可变域vl。
12.实施方案1至4，6至9任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体。
13.实施方案12的用于治疗的抗csf-1r抗体，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
该拮抗性pd-l1抗体包含seqidno：15的重链可变域vh和seqidno：16的轻链可变域vl。
14.实施方案1至4，7至9任一项的用于治疗的抗csf-1r抗体，其中该巨噬细胞激活剂是tlr9激动剂。
15.实施方案14的用于治疗的抗csf-1r抗体，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
其中该tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序(cprodn)的寡聚脱氧核苷酸(优选含有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)的寡聚脱氧核苷酸)。
下面描述本发明的具体实施方案：
1a.一种包含结合人csf-1r的抗体的药物组合物或药物，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期(在一个实施方案中在每第三个周期)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
1b.一种包含结合人csf-1r的抗体的药物组合物或药物，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在血清中的cd14+cd16+阳性单核细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
1c.一种包含结合人csf-1r的抗体的药物组合物或药物，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在cd163+/cd68+阳性肿瘤相关巨噬细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
2.实施方案1a或1b或1c任一项的药物组合物或药物，其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期(在一个实施方案中在每第三个周期)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
3.实施方案1至2任一项的药物组合物或药物，其中该治疗周期的长度介于2和4周之间(在一个优选的实施方案中该治疗周期的长度介于18和24天之间且在另一个优选的实施方案中该治疗周期的长度是(约)3周)。
4.实施方案1至3任一项的药物组合物或药物，其中以600-1200mg的剂量(在一个实施方案中以750-1100mg的剂量，在一个实施方案中以750-1000，900-1000mg的剂量，在实施方案中750，在一个实施方案中900，在一个实施方案中1000)施用该抗csf-1r抗体。
5.实施方案1至4任一项的药物组合物或药物，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体且在每个周期以4-16mg的剂量(在一个实施方案中以8-16mg的剂量)施用。
6.实施方案1至4任一项的药物组合物或药物，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体且在每个周期以1100-1300mg的剂量(在一个实施方案中以1200的剂量)施用。
7.实施方案1至6任一项的药物组合物或药物，其中该组合疗法用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展。
8.实施方案1至6任一项的药物组合物或药物，其中该组合疗法用于刺激免疫应答或功能，诸如t细胞活性。
9.实施方案1至8任一项的药物组合物或药物，其中该抗csf-1r抗体包含
a)seqidno：1的重链可变域vh和seqidno：2的轻链可变域vl，
或
b)seqidno：3的重链可变域vh和seqidno：4的轻链可变域vl，
或
c)seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，
或
d)seqidno：7的重链可变域vh和seqidno：8的轻链可变域vl，
或
e)seqidno：9的重链可变域vh和seqidno：10的轻链可变域vl。
10.实施方案1至5，7至9任一项的药物组合物或药物，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体
11.实施方案10的药物组合物或药物，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
该激动性cd40抗体包含seqidno：11的重链可变域vh和seqidno：12的轻链可变域vl。
12.实施方案1至4，6至9任一项的药物组合物或药物，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体。
13.实施方案13的药物组合物或药物，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
该拮抗性pd-l1抗体包含seqidno：15的重链可变域vh和seqidno：16的轻链可变域vl。
14.实施方案1至4，7至9任一项的药物组合物或药物，其中该巨噬细胞激活剂是tlr9激动剂。
15.实施方案14的药物组合物或药物，
其中抗csf-1r抗体包含
seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且其中该tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序(cprodn)的寡聚脱氧核苷酸(优选含有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)的寡聚脱氧核苷酸)。
下面描述本发明的具体实施方案：
1a.结合人csf-1r的抗体在制造药物中的用途，该药物用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期(在一个实施方案中在每第三个周期)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
1b.结合人csf-1r的抗体在制造药物中的用途，该药物用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在血清中的cd14+cd16+阳性单核细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
1c.结合人csf-1r的抗体在制造药物中的用途，该药物用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在cd163+/cd68+阳性肿瘤相关巨噬细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
2.实施方案1a或1b或1c任一项的用途，其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期(在一个实施方案中在每第三个周期)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
3.实施方案1至2任一项的用途，其中该治疗周期的长度介于2和4周之间(在一个优选的实施方案中该治疗周期的长度介于18和24天之间且在另一个优选的实施方案中该治疗周期的长度是(约)3周)。
4.实施方案1至3任一项的用途，其中以600-1200mg的剂量(在一个实施方案中以750-1100mg的剂量，在一个实施方案中以750-1000，900-1000mg的剂量，在一个实施方案中750，在一个实施方案中900，在一个实施方案中1000)施用该抗csf-1r抗体。
5.实施方案1至4任一项的用途，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体且在每个周期以4-16mg的剂量(在一个实施方案中以8-16mg的剂量)施用。
6.实施方案1至4任一项的用途，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体且在每个周期以1100-1300mg的剂量(在一个实施方案中以1200的剂量)施用。
7.实施方案1至6任一项的用途，其中该组合疗法用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展。
8.实施方案1至6任一项的用途，其中该组合疗法用于刺激免疫应答或功能，诸如t细胞活性。
9.实施方案1至8任一项的用途，其中该抗csf-1r抗体包含
a)seqidno：1的重链可变域vh和seqidno：2的轻链可变域vl，
或
b)seqidno：3的重链可变域vh和seqidno：4的轻链可变域vl，
或
c)seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，
或
d)seqidno：7的重链可变域vh和seqidno：8的轻链可变域vl，
或
e)seqidno：9的重链可变域vh和seqidno：10的轻链可变域vl。
10.实施方案1至5，7至9任一项的用途，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体。
11.实施方案10的用途，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
该激动性cd40抗体包含seqidno：11的重链可变域vh和seqidno：12的轻链可变域vl。
12.实施方案1至4，6至9任一项的用途，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体。
13.实施方案12的用途，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
该拮抗性pd-l1抗体包含seqidno：15的重链可变域vh和seqidno：16的轻链可变域vl。
14.实施方案1至4，7至9任一项的用途，其中该巨噬细胞激活剂是tlr9激动剂。
15.实施方案14的用途，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
其中该tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序(cprodn)的寡聚脱氧核苷酸(优选含有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)的寡聚脱氧核苷酸)。
下面描述本发明的具体实施方案：
1a.一种治疗方法，该方法包含施用(有效量的)结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与(有效量的)选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期(在一个实施方案中在每第三个周期)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
1b.一种治疗方法，该方法包含施用(有效量的)结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与(有效量的)选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在血清中的cd14+cd16+阳性单核细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
1c.一种治疗方法，该方法包含施用(有效量的)结合人csf-1r的抗体，用于
a)治疗癌症，或
b)治疗具有带有csf-1r表达性巨噬细胞浸润物的肿瘤的患者，
其中在第一个治疗周期中与(有效量的)选自激动性cd40抗体，toll样受体(tlr)配体，tlr激动剂，拮抗性pd-l1抗体的组的巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，
且其中在后面仅仅在cd163+/cd68+阳性肿瘤相关巨噬细胞显著恢复之后(在一个实施方案中该恢复大于60％，在一个实施方案中大于80％)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体。
2.实施方案1a或1b或1c任一项的方法，其中在后面的治疗周期中仅仅在每第二个周期(在一个实施方案中在每第三个周期)与该巨噬细胞激活剂组合施用该抗csf-1r抗体，而在每个治疗周期施用该巨噬细胞激活剂。
3.实施方案1至2任一项的方法，其中该治疗周期的长度介于2和4周之间(在一个优选的实施方案中该治疗周期的长度介于18和24天之间且在另一个优选的实施方案中该治疗周期的长度是(约)3周)。
4.实施方案1至3任一项的方法，其中以600-1200mg的剂量(在一个实施方案中以750-1100mg的剂量，在一个实施方案中以750-1000，900-1000mg的剂量，在一个实施方案中750，在一个实施方案中900，在一个实施方案中1000)施用该抗csf-1r抗体。
5.实施方案1至4任一项的方法，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体且在每个周期以4-16mg的剂量(在一个实施方案中以8-16mg的剂量)施用。
6.实施方案1至4任一项的方法，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体且在每个周期以1100-1300mg的剂量(在一个实施方案中以1200的剂量)施用。
7.实施方案1至6任一项的方法，其中该组合疗法用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展。
8.实施方案1至6任一项的方法，其中该组合疗法用于刺激免疫应答或功能，诸如t细胞活性。
9.实施方案1至8任一项的方法，其中该抗csf-1r抗体包含
a)seqidno：1的重链可变域vh和seqidno：2的轻链可变域vl，
或
b)seqidno：3的重链可变域vh和seqidno：4的轻链可变域vl，
或
c)seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，
或
d)seqidno：7的重链可变域vh和seqidno：8的轻链可变域vl，
或
e)seqidno：9的重链可变域vh和seqidno：10的轻链可变域vl。
10.实施方案1至5，7至9任一项的方法，其中该巨噬细胞激活剂是激动性cd40抗体。
11.实施方案10的方法，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
该激动性cd40抗体包含seqidno：11的重链可变域vh和seqidno：12的轻链可变域vl。
12.实施方案1至4，6至9任一项的方法，其中该巨噬细胞激活剂是拮抗性pd-l1抗体。
13.实施方案12的方法，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
该拮抗性pd-l1抗体包含seqidno：15的重链可变域vh和seqidno：16的轻链可变域vl。
14.实施方案1至4，7至9任一项的方法，其中该巨噬细胞激活剂是tlr9激动剂。
15.实施方案14的方法，
其中抗csf-1r抗体包含seqidno：5的重链可变域vh和seqidno：6的轻链可变域vl，且
其中该tlr9激动剂是含有a)胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)，b)嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(ypg)基序(ypgodn)或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(cpr)基序(cprodn)的寡聚脱氧核苷酸(优选含有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序(cpgodn)的寡聚脱氧核苷酸)。
实施例
抗csf-1r抗体和巨噬细胞激活性激动性cd40抗体的组合
实施例1a：抗csf-r抗体+巨噬细胞激活性激动性cd40抗体的协同功效(图1)
给雌性c57bl/6n小鼠(6-8周龄，自charlesriver获得)皮下接种106个mc38结肠直肠腺癌肿瘤细胞。通过测径器测量监测肿瘤生长曲线，一旦肿瘤尺寸达到平均250mm3，就用下面各项给各组分配处理：
a)igg同种型对照抗体：30mg/kg鼠igg1，克隆mopc-21(bioxcell)；或
b)抗cd40抗体：4mg/kg大鼠igg2a抗体，克隆fgk45(bioxcell)；或
c)抗csf-1r抗体：30mg/kg仓鼠-小鼠嵌合抗体克隆2g2(ries等人，cancercell25：846-859，2014)；或
d)抗cd40抗体和抗csf-1r抗体的组合：组合，同时处理，如b)和c)中给药。
抗csf-1r抗体或相应igg1对照抗体每周施用直至肿瘤完全消退或动物达到终止标准，而抗cd40抗体只在第10天与抗csf-1r抗体并行施用一次。总体研究设计在图1a中描绘。
图1b描绘无进展存活直至肿瘤体积达到≥700mm3，证明csf-1r和cd40抗体组合处理的协同抗肿瘤功效。通过皮下接种5x106个mc38入对侧体侧，再攻击用抗csf-1r抗体和抗cd40抗体的组合处理且在初始肿瘤排斥后至少30天保持无肿瘤的小鼠。图1c显示与未处理小鼠相比，先前用抗csf-1r抗体与抗cd40抗体组合处理的小鼠的再攻击导致快速肿瘤排斥。确实，所有8只先前组合处理的小鼠到第二次肿瘤注射之后第21天无肿瘤。这些结果指示抗csf-1r和抗cd40抗体组合处理能诱导肿瘤细胞特异性免疫应答。
实施例1b：抗cd40和抗csf1r抗体的组合处理前cd8α阳性t细胞的消减消除抗csf-r抗体和巨噬细胞激活剂样激动性cd40抗体的协同效应(图2)
给雌性c57bl/6n小鼠(6-8周龄，自charlesriver获得)皮下接种106个mc38结肠直肠腺癌肿瘤细胞。通过测径器测量监测肿瘤生长曲线，一旦肿瘤尺寸达到平均190mm3，就用下面的消减性抗体给小鼠分配处理：
a)抗cd8α抗体；4mg/kg小鼠igg2a，克隆53-6.7(bioxcell)；或
b)抗cd4抗体；4mg/kg小鼠igg2b，克隆gk1.5(biolegend)；或
c)抗nk1.1抗体；4mg/kg小鼠igg2a，克隆pk136(bioxcell)；
当肿瘤尺寸达到平均190mm3时开始使用抗cd8α，抗cd4和抗nk1.1抗体消减淋巴细胞。每第二天给予抗体达四次。在第二和三剂消减性抗体之间，用下面各项进一步处理动物：
d)媒介对照：0.9％钠盐水(消减抗体单独对照)，或
e)igg同种型对照抗体：30mg/kg鼠igg1，克隆mopc-21(bioxcell)；或
f)抗cd40抗体：4mg/kg大鼠igg2a抗体，克隆fgk45(bioxcell)；或
g)抗cd40抗体和抗csf-1r抗体的组合：30mg/kg仓鼠-小鼠嵌合抗体克隆2g2(ries等人，cancercell25：846-859，2014)；
抗csf-1r抗体或相应igg1对照抗体每周施用直至肿瘤完全消退或动物达到终止标准，而抗cd40抗体只在第11天与抗csf-1r抗体同时施用一次。总体研究设计在图2a中描绘。
图2b显示cd8阳性t细胞的消减导致抗cd40和csf-1r荷肿瘤小鼠中存活的有益效果的消除。cd4阳性t细胞或nk1.1表达性nk细胞的消减均不影响这些小鼠中的存活。这突显细胞毒性t细胞应答在用组合处理的小鼠中启动。值得注意的是，与消减其它淋巴细胞亚型的小鼠相比，消减cd4阳性细胞并单独用抗cd40处理的小鼠的存活显著增强(10只小鼠中4只无肿瘤)。这可能指示遏制性cd4阳性t细胞(例如调节性t细胞)也对抗cd40处理后荷mc38肿瘤小鼠中总体存活具有负面影响。
实施例1c：抗csf-r抗体和巨噬细胞激活剂样激动性cd40抗体的协同功效依赖于肿瘤相关巨噬细胞(tam)的存在(图3)
给雌性c57bl/6n小鼠(6-8周龄，自charlesriver获得)皮下接种106个mc38结肠直肠腺癌肿瘤细胞。通过测径器测量监测肿瘤生长曲线并在第3天开始预处理。用下面的抗体给动物分配预处理：
a)igg同种型对照抗体：30mg/kg鼠igg1，克隆mopc-21(bioxcell，有完全fc能力的抗体)；或
b)igg同种型对照抗体的无fc活性
c)抗csf-1r抗体无fc活性
对于功效读出，在肿瘤接种之后第3天和第9天给小鼠腹膜内注射任一抗体(a至c)，然后根据肿瘤尺寸(平均120mm3)进一步分配以在第11天用下面的抗体处理：
d)igg同种型对照抗体：30mg/kg鼠igg1，克隆mopc-21(bioxcell)；或
e)抗cd40抗体：4mg/kg大鼠igg2a抗体，克隆fgk45(bioxcell)；或
f)抗cd40抗体和抗csf-1r抗体的组合(30mg/kg仓鼠-小鼠嵌合抗体克隆2g2；ries等人，cancercell25：846-859，2014)。
对于组合处理，动物只用抗cd40抗体和抗csf-1r抗体同时处理一次。总体研究设计在图3a中描绘。
流式细胞术：对4只小鼠每个预处理组的肿瘤，在施用组合处理之前第11天使用流式细胞术来测定tam消减的功效。有完全fc能力csf-1r抗体(克隆2g2，在第3和9天处理，30mg/kg；ries等人，cancercell2014，25：846-859)的处理充当阳性对照。对于流式细胞术分析，收集肿瘤并在机械破碎后使用分散酶ii(最终1mg/ml，roche#04942078001)，胶原酶iv(最终1mg/ml，sigmaaldrich#l5138)和dna酶i(最终0.01％；roche#11284932001)于37℃在dpbs(pan-biotech，#p04-36500)中消化30分钟。在40μm细胞滤器(easystrainer，greiner#542040)上运行单细胞悬浮液并清洗细胞之后，使用pharm裂解缓冲液依照制造商的说明书(bdpharmingen，#558995)去除红细胞。细胞(2x106)最终在125μlfacs缓冲液(dpbs+5％fsc(gibco，#10500-038)，5mmedta(invitrogen,#15575-038))中重悬浮并使用fc阻断性抗体(克隆2.4g2，bdpharmingen，#553142)温育5分钟，之后添加下面的抗体，在冰上温育30分钟并再次清洗掉：
为了排除死细胞，添加dapi(roche，#10236276001)，之后在cantoii流式细胞仪(bdbioscience)上获取数据。使用flowjo软件10版分析数据并使用graphpadprism软件6.07版进行统计学评估。
为了显示抗csf-1r和抗cd40抗体的组合效果(见实施例1a)确实依赖于巨噬细胞，消减tam，之后应用组合疗法。抗cd40抗体的功能依赖于经由fcriib的交联(li和ravetch，science2011，333：1030-1034；white等人，journalofimmunology2001，187：1754-63；richmann&vonderheide，cancerimmunologyresearch2013，2：19-26)，这可能在预处理期间使用30mg/kg鼠igg1(同种型或抗csf-1r抗体)阻断。因此，使用缺乏fc受体功能(
抗cd40或抗cd40与抗csf-1r抗体组合的处理之前预消减tam的存活研究的结局在图3c中显示。与对照预处理相比，组合抗cd40和抗csf-1r处理前使用csf-1r
实施例1d：csf-1r信号传导阻断提升cd40单抗调节的肿瘤相关巨噬细胞(tam)朝向强促炎性表型的极化(图4)
给雌性c57bl/6n小鼠(6-8周龄，自charlesriver获得)皮下接种106个mc38结肠直肠腺癌肿瘤细胞。通过测径器测量监测肿瘤生长曲线，一旦肿瘤尺寸达到平均220mm3，就用下面各项给各组分配处理：
a)igg同种型对照抗体：30mg/kg鼠igg1，克隆mopc-21(bioxcell)；或
b)抗cd40抗体：4mg/kg大鼠igg2a抗体，克隆fgk45(bioxcell)；或
c)抗csf-1r抗体：30mg/kg仓鼠-小鼠嵌合抗体克隆2g2(ries等人，cancercell25：846-859，2014)；或
d)抗cd40抗体和抗csf-1r抗体的组合：组合，同时处理，如b)和c)中给药。
所有抗体施用一次并在16小时之后获得肿瘤。对于细胞分选目的，为了流式细胞术如实施例1c中所述对肿瘤进行处理和染色。使用facsariaii仪器(bdbioscience)自4只动物每组分选细胞并如图4a中所示为分选设门。获得三种不同髓样细胞群体(每份样品分选最少10,000个细胞)：
a)单核细胞mdsc(髓样衍生抑制细胞)：
cd45+cd11b+f4/80低ly6g阴性ly6c高
b)tam前体：
cd45+cd11b+f4/80低ly6g阴性ly6c低
c)tam(肿瘤相关巨噬细胞)：
cd45+cd11b+f4/80高ly6g阴性ly6c低
对分选的细胞群体实施rna测序分析并使用基于在后面的研究中描述的方法的内部工具加工原始数据：langmead，b.&salzberg，s.l.，natmethods9(2012)357-359；mortazavi，a.等人，natmethods5(2008)621-628，为来自每个处理组的每种细胞群体中的每种基因生成标准化基因表达值。
使用一种公众可得的工具(sandmann，t.等人，bioinformatics30(2014)127-128)对所得基因表达值实施签名分析。结果是wilcoxon/mann-whitney秩和统计量，代表彼此相比处理组中签名所代表的途径或表型的激活水平或可能性水平。为每个处理组实施三项比较，例如，将抗cd40抗体和抗csf-1r抗体组合处理组分开与抗cd40，抗csf-1r和igg同种型对照组比较。
签名是一组功能相关基因，典型地是自旨在表征感兴趣生物学表型，例如不同巨噬细胞亚型(m1对m2)或lps刺激的巨噬细胞对未刺激的巨噬细胞的化学或遗传扰动实验的生物信息学分析定义的。使用牵涉lps，干扰素或tnf刺激的，多种细胞类型(例如免疫细胞，癌症细胞，乳腺上皮细胞)的扰动的88种签名来检查一般性免疫激活效应。所有88种签名是自分子签名数据库(msigdb，subramaniana.等人，pnas102(2005)15545-50)获得的。使用7种签名来检查m1/m2表型；在这7种中，3种是自已发表的研究获得的(schmiedera.等人，semincancerbiol.22(4)(2012)289-97；martinezf.o.等人，blood121(9)：(2013)e57-69)，4种是在roche使用在affymetrix微阵列芯片上测定概况的体外分化的巨噬细胞的基因表达数据生成的。
图4b汇总每个非对照处理组(行)和髓样细胞群体(列)的分析结果。“x”指示在处理组的所有三项比较间没有显著或一致的激活/抑制。总之，在三种非对照处理中，抗cd40抗体和抗csf-1r抗体的组合是在分析的时间点清楚地诱导所有三种髓样亚型中的激活的m1样效应(顶部小图)和所有三种髓样亚型中的一般性免疫激活样效应(底部小图)的唯一处理。
实施例1e：cd40和csf-1r由人tam表达(irisihc)(图5)
将患者样品切成来自结肠直肠癌(crc)，间皮瘤和三重阴性乳腺癌(tnbc)的2.5μm福尔马林固定，石蜡包膜组织切片。在ventanabenchmarkxt上使用nexes软件10.6版用用于foxp3(1μg/ml，236a/e7，abcamab20034)，cd40(1:100，springbioscience，e3704)与cd68(rtu，kp-1，ventanamedicalsystems，790-2931)的双联体(duplex)，cd163(rtu，mrq-26，ventanamedicalsystems，760-4437)和csf1r(1μg/ml，29，rochediagnosticsgmbh)的ihc方案将切片染色。
将切片提交cc1(基于tris的细胞条件化1)处理达32分钟，继以抗体温育(foxp3：于37℃1小时，cd40：于37℃32分钟，cd68：于37℃32分钟，cd163：于37℃16分钟，csf1r：于37℃32分钟)并使用optiviewdab(foxp3，cd40，csf1r)检测系统或ultraview-dab(cd163)或-red(cd68)检测系统检测阳性染色。使用ventanaiscanht明视野扫描仪以20x扫描载片并由委员会认证的病理学家使用基于组稀疏度(sparsity)模型的算法(chen和chukka，doi：10.1016/j.compmedimag.2015.04.001)进行分析。
将不同生物标志物的所得密度值彼此成对关联。在图5中的热图中显现所得相关系数以容许容易概览不同标志物之间的相关性：红色场显示正相关，蓝色场显示负相关。其中，csf1r阳性细胞的密度与cd40+/cd68+细胞正相关，指示在间皮瘤和crc子集中显著观察到的这些标志物的潜在共表达。比较而言，在tnbc子集中没有找到显著的相关性(图5)。
实施例1f：cd40和csf-1r组合在临床前小鼠模型中得到较好耐受(图6)
给雌性c57bl/6n小鼠(6-8周龄，自charlesriver获得)皮下接种106个mc38结肠直肠腺癌肿瘤细胞。通过测径器测量监测肿瘤生长曲线，一旦肿瘤尺寸达到平均260mm3，就用下面各项给各组分配处理：
a)igg同种型对照抗体：30mg/kg鼠igg1，克隆mopc-21(bioxcell)；或
b)抗cd40抗体：4mg/kg大鼠igg2a抗体，克隆fgk45(bioxcell)；或
c)抗csf-1r抗体：30mg/kg仓鼠-小鼠嵌合抗体克隆2g2(ries等人，cancercell25：846-859，2014)；或
d)抗cd40抗体和抗csf-1r抗体的组合：组合，同时处理，如b)和c)中给药。
所有抗体在第11天施用一次并在指定时间点监测动物的体重。自n＝5至10只小鼠每组计算均值±sem。
单独的抗cd40疗法诱导瞬时的体重损失，与抗cd40加抗csf1r组合相当。在第17天(在处理开始之后6天)没有检测到与抗cd40，抗csf-1r或igg对照处理的动物相比的体重差异(图6)。
实施例1g：csf1r疗法自连续至瞬时肿瘤相关巨噬细胞(tam)消减的转变与巨噬细胞激活剂样cd40激动剂的组合(图7和8)
探索性队列cohortq6w中emactuzumab(包含seqidno：5和seqidno：7的vh和vl的抗csfr抗体，作为ig1卡帕恒定域)的剂量和日程表原理
备选处理日程表的目标是调查巨噬细胞在通过emactuzumab给药实现它们的初始减少之后的再建群是否是有益的。临床前模型已经鉴定在体内驱动最大功效的巨噬细胞依赖性。为了容许巨噬细胞的再建群，会测试emactuzumab的q6w给药日程表。已经为这种方案选择固定(平坦)剂量给药，因为预期体表面积(bsa)或体重对总体暴露没有强烈影响。
作为肿瘤相关巨噬细胞(tam)的替代物，测量血清中的前体人cd14+cd16+单核细胞，因为这种血液单核细胞的恢复与随后肿瘤相关巨噬细胞(tam)的恢复相关。
已经将药效学模型拟合当前可得的人cd14+cd16+单核细胞数据。基于初步群体分析，q6w施用的750mg剂量显示朝向q6w的给药间隔结束(～7天)的cd14+cd16+单核细胞的恢复(图5)。这种估计的单核细胞恢复还朝向q6w的给药间隔结束与靶物饱和的降低及与emactuzumab的线性pk的丧失一致(图7)。
基于来自研究bp27772(100-3000mgq2w；n＝36名患者)的pk分析，emactuzumab的pk显示自100直至900mgq2w是非线性的。c最大和auc二者显示大于与剂量成比例的升高，伴有相同剂量范围上总清除的降低，这指示emactuzumab的消除在以这些剂量实现的暴露时主要是靶物介导的。在900mg以上时，暴露以大约与剂量成比例的方式升高直至3000mg，这指示靶物介导的消除饱和。
已经将包含线性和非线性清除途径的二者的一种两隔室pk模型拟合当前可得的人数据。非线性清除途径可能与处理开始时受体的目标水平有关且可以认为代表tmdd。两隔室模型中的非线性消除也可用于预测靶物介导的消除的饱和(靶物饱和的替代)。auc最后和cl指示tmdd对总cl的贡献在600mg的剂量开始降低且在900mg和更高的剂量达到最小，这指示≥900mg的剂量达到≥90％靶物饱和(q2w)(图8)。
自200mg起在皮肤和肿瘤活检中观察到巨噬细胞的剂量/系统性暴露依赖性降低，自100μg/ml的c平均达到平台，这大约对应于≥900mg剂量的单药疗法和与帕利他赛的组合。还调查了另外的外周血生物标志物，诸如单核细胞和csf-1水平。这些外周血生物标志物的剂量/暴露趋势与组织生物标志物(巨噬细胞)相似且在≥900mg时达到平台。基于迄今可得的数据，为了实现巨噬细胞的最大消减，会要求≥90％靶物饱和。
测试结肠直肠癌症(crc)或黑素瘤(mel)患者(n＝多至50)。要以两步骤办法进行研究以调查前体单核细胞以及相关巨噬细胞恢复，测试emactuzumab的备选剂量给药日程表，其具有更长给药间隔以容许巨噬细胞前体单核细胞以及相关巨噬细胞在抗csf-1r抗体emactuzumab实现的初始降低之后的再建群：
在步骤1a(插入)中，用激动性cd40抗体q3w(以研究的部分i中限定的mtd)和emactuzumabq6w(750mg)处理的头10名患者会自初始emactuzumab输注六周分析tam，皮肤巨噬细胞以及循环单核细胞的潜在恢复。emactuzumab750mgq6w的起始剂量，是基于临床建模限定的。
在n＝10份可评估配对肿瘤活检中的tam没有恢复的情况中，可以在另外n＝10名患者中测试第二个剂量或剂量给药日程表(步骤1b)。第二个剂量和剂量给药日程表会根据剂量扩大和正在进行的扩充队列的正在出现的数据来选择。
在emactuzumab输注之后6周时观察到tam恢复的情况中，会对这个扩充队列进一步募集多至30名患者(步骤2)。如果在剂量和日程表的第一次调整之后没有观察到tam恢复的话，这个研究分支会终止。
实施例1h：会如下评估在抗肿瘤活性方面的临床功效：
·最好的总体响应。
·总体响应率(orr)，定义为部分响应率加完全响应率，在初始记录之后≥4周通过重复评估确认。
·无进展存活(pfs)，定义为自第一次研究处理至第一次发生疾病进展或死亡的时间，无论哪种先发生。
·响应持续时间(dor)，定义为自有记录的客观响应的第一次发生的时间至进展或任何起因的死亡的时间，无论哪种先发生。
·临床受益率(cbr)，定义为部分响应率加完全响应率加稳定疾病率。
最好的总体响应，客观响应和疾病进展会通过调查人员评估和通过中心审查使用常规recistv1.1和改良recist标准二者来确定。如果可得的话，强烈鼓励提交任选的最晚的(不超过在周期1第1天前6个月)研究前计算机断层摄影术(ct)扫描(历史ct扫描)。这次扫描会与在研究期间收集的那些比较以确定纵向肿瘤生长动力学。
序列表
<110>豪夫迈·罗氏有限公司（f.hoffmann-larocheag）
<120>与巨噬细胞激活剂组合的抗csf-1r抗体的间歇给药
<130>p33829-wo(wj)
<150>ep16185704.0
<151>2016-08-25
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<212>prt
<213>人工的
<220>
<223>人源化s2c6轻链可变域变体
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arg
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<213>人工的
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<223>抗pd-l1抗体阿特珠单抗的重链可变域
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151015
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<212>prt
<213>人工的
<220>
<223>抗pd-l1抗体阿特珠单抗的轻链可变域
<400>16
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151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalserthrala
202530
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354045
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505560
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65707580
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<213>人工的
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<213>人工的
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<210>23
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<213>人工的
<220>
<223>含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序的寡聚脱氧核苷酸cpg-28
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<400>28
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275280285
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290295300
progluglualaserglyglualasergluileprovalproglngly
305310315320
thrgluleuserproserargproglyglyglysermetglnthrglu
325330335
proalaargproserasnpheleuseralaserserproleuproala
340345350
seralalysglyglnglnproalaaspvalthrglythralaleupro
355360365
argvalglyprovalargprothrglyglnasptrpasnhisthrpro
370375380
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glyserproargileserserleuargproglnglyleuserasnpro
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servalleuproleuglygluleugluglyargargserthrargasp
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<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>29
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hisprosertrplystyrleuglngluvalgluthrleuleuleuasn
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valglnglnglyleuthraspvalgluvalserprolysvalgluser
130135140
valleuserleuleuasnalaproglyproasnleulysleuvalarg
145150155160
prolysalaleuleuaspasncyspheargvalmetgluleuleutyr
165170175
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180185190
valproserproglnsercysserprogluproserleuglntyrala
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leupro
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<212>prt
<213>人（homosapiens）
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505560
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procysprovalglyphepheserasnvalserseralapheglulys
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cyshisprotrpthrsercysgluthrlysaspleuvalvalglngln
165170175
alaglythrasnlysthraspvalvalcysglyproglnaspargleu
180185190
argalaleuvalvalileproileilepheglyileleuphealaile
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leuleuvalleuvalpheilelyslysvalalalyslysprothrasn
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lysalaprohisprolysglngluproglngluileasnpheproasp
225230235240
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valglngluarggln
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<213>人（homosapiens）
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325
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