细胞溶质穿透抗体及其用途的制作方法

本公开文本涉及细胞溶质穿透抗体及其用途，并且更具体地涉及可以增加细胞溶质穿透抗体(cytotransmab)的内体逃逸功效以便在通过细胞膜蛋白细胞内化到活细胞中之后具有显著改进的从内体逃逸到细胞溶质中的能力的内体逃逸基序、包含该内体逃逸基序的轻链可变区和/或重链可变区、包含该轻链可变区和/或该重链可变区的细胞溶质穿透抗体、用于生产该细胞溶质穿透抗体的方法、以及该细胞溶质穿透抗体的用途。

背景技术：

一般的抗体和大分子生物药物因为它们不能通过疏水性细胞膜而具有局限性，并因此不能结合和抑制各种疾病相关物质。此外，常规抗体由于其大的尺寸和亲水性质而不能直接穿透活细胞。

因此，大多数常规抗体特异性地靶向细胞外分泌的蛋白或细胞膜蛋白。

此外，通常，在研究例如细胞的生长、特异性抑制等机制的实验中使用的特异性地结合细胞内物质的商业抗体不能直接用于治疗活细胞，并且为了使这些抗体与细胞内物质结合，必然需要通过使用两亲性糖苷皂苷(glycosidesaponin)的细胞膜透化过程在细胞膜中形成孔的预处理过程。

已经开发了许多靶向细胞膜蛋白或细胞外分泌蛋白的治疗性抗体，因为它们具有以高特异性和高亲和力结合靶蛋白的特性。靶向细胞膜蛋白的抗体可以与细胞膜蛋白结合，并然后经由内体途径通过受体介导的内吞作用过程进入细胞。

该过程包括早期内体阶段后的各种途径。也就是说，1)大多数抗体可以从早期内体转运到晚期内体和溶酶体，并且可以在酸性条件下被蛋白酶完全降解；并且2)一些抗体可以在酸性条件下与早期内体中的fcrn(新生儿fc受体)结合，并通过循环内体途径从细胞中出来。

因此，大多数抗体与靶膜蛋白强烈结合，并且主要通过溶酶体途径降解。在内体途径中，内体成熟的同时其内部通过质子泵逐渐酸化。已知早期内体的ph为约5.5-6.5，晚期内体的ph为约4.5-5.5，并且溶酶体的ph为约ph3.5-4.5(quadirma等人,2014；lis等人,2014)。内体中的许多蛋白酶被激活，并且内吞蛋白在内体中被降解。

因此，当抗体在受体介导的内吞作用后通过内体途径移动时，它们应与靶膜蛋白分离并在内体中形成孔，以便在运输至溶酶体之前从早期或晚期内体逃逸到细胞溶质中。

在天然存在的细胞内物质中，已知病毒和毒素通过内吞作用主动穿透活细胞。“内体逃逸”是从内体逃逸到细胞溶质中的过程，是通过内吞作用渗透到细胞中的物质在细胞溶质中展现出活性所必需的。

虽然尚未清楚地发现内体逃逸机制，但迄今为止已知有三种内体逃逸的假说。

第一种假说是在内体膜中形成孔的机制。在这一假说中，内体膜中的物质(例如阳离子两亲性肽)与带负电荷的细胞脂质双层结合以引起内部应力或内部膜收缩，从而形成桶状壁孔或环形通道(jenssen等人,2006)，这被称为孔形成机制。

第二种假说是内体由于质子-海绵效应(proton-spongeeffect)而破裂的机制。在这一假说中，由于具有质子化氨基基团的物质的高缓冲作用，内体的渗透压可以增加使得内体膜可以降解(lin和engbersen,2008)。

在第三种假说中，在中性环境中维持亲水性线圈形状但在酸性环境(如内体)中变成疏水性螺旋结构的一个特定的基序与内体膜融合，使得病毒和毒素包括从内体逃逸的基序，这被称为脂质膜融合机制。已经提出这三种假说作为病毒蛋白和来自植物/细菌的毒性蛋白的内吞作用之后的内体逃逸机制，但是抗体中的此类内体逃逸机制还尚未被具体鉴别。

在上述内体逃逸机制中观察到的普遍现象是内体逃逸发生在酸性ph条件下，该酸性ph条件为内体和溶酶体环境。功能根据ph而改变的蛋白质具有根据ph而改变其结构的特性。带负电荷的氨基酸(天冬氨酸(d)和谷氨酸(e))和疏水性氨基酸(甲硫氨酸(m)、亮氨酸(l)和异亮氨酸(i))在中性ph条件下不发生相互作用。然而，随着ph降低，带负电荷的氨基酸的侧链中的羧酸(coo-)通过质子化变成疏水的(korte等人,1992)，并然后可以与周围的疏水性氨基酸发生疏水相互作用。结果，两个氨基酸之间的距离变得更近，并且蛋白质的总体结构和功能改变了。引起这种变化的现象被称为tanford转变(qin等人,1998)。

作为一个例子，氮转运酶nitrophorin4在中性ph条件下具有开放结构。然而，随着ph从中性ph(ph7.4)降低到弱酸性ph(ph6.0)，nitrophorin4的结构由于天冬氨酸和亮氨酸的疏水相互作用而变为封闭结构，并因此nitrophorin4起到输送氮的作用(dirusso等人,2012)。

然而，在抗体中尚未发现这种ph依赖性结构变化。特别地，在经历内吞作用的抗体中还尚未观察到这种变化。

作为一个例子，在常规抗体技术中用于诱导ph依赖性抗原结合的抗体工程改进技术是从引入cdr(互补决定区)的组氨酸(h)或引入包括组氨酸的随机突变的文库中筛选ph依赖性抗原结合抗体的方法(bonvinp等人,2015)。然而，这两种方法都不会引起结构变化，并且因为应该进行基于文库的筛选以便诱导ph依赖性抗原结合而具有局限性。

为了增加在细胞溶质中展现出其活性的物质的作用，位于细胞溶质中的物质的量应该最终增加。因此，已经进行了研究以增加内体逃逸能力。主要对细胞穿透肽(cpp)进行了此类研究。虽然有报道称一些细胞穿透肽通过内体逃逸途径定位于细胞溶质中，但尚未对精确的内体逃逸机制进行详细研究，并且已知由于内体逃逸效率非常低，只有约0.1％至4％的内吞肽定位于细胞溶质。

在该技术背景下，诸位发明人已经鉴定了内体逃逸基序，该内体逃逸基序能够增加穿透细胞并定位于细胞溶质中的细胞溶质穿透抗体(cytotransmab)的内体逃逸功效(choi等人,2014)，并且已经发现可以开发包括具有增加的从内体逃逸的能力的内体逃逸基序的轻链或重链可变区、以及包含该轻链或重链可变区的抗体或其抗原结合片段。

此外，诸位发明人已经发现通过将该内体逃逸基序移植到其他种类的轻链或重链可变区中，可以产生具有内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体，从而完成了本公开文本。

背景技术部分中公开的信息仅用于增强对本公开文本的背景的理解，并且因此可能不包含形成本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现要素：

技术问题

本公开文本的目的是提供具有内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段。

本公开文本的另一个目的是提供编码抗体或其抗原结合片段的核酸。

本公开文本的再另一个目的是提供包含上述核酸的载体、用上述载体转化的细胞、以及产生上述抗体或其抗原结合片段的方法。

本公开文本的又另一个目的是提供包含上述抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物。

本公开文本的另外的目的是提供用于将活性物质递送到细胞溶质中的组合物，该组合物包含上述细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段。

本公开文本的再另外的目的是提供用于产生上述细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段的方法。

技术方案

为了实现上述目的，本公开文本提供了细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区和/或重链可变区在其cdr3中包含由下式表示的序列：

x1-x2-x3-z1

其中x1-x2-x3是内体逃逸基序，并且x1、x2和x3中的每一个选自下组，该组由以下各项组成：色氨酸(w)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)和苯丙氨酸(f)；

z1选自下组，该组由以下各项组成：甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、组氨酸(h)、天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)；

包含z1的该轻链可变区和/或该重链可变区在内体酸性ph条件下诱导该抗体特性的变化；并且

该抗体通过该抗体特性的变化展现出从内体逃逸到细胞溶质中的能力。

在根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段中，轻链可变区和/或重链可变区的第一个氨基酸可以是天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)。

本公开文本还提供了编码上述细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段的核酸。

本公开文本还提供了包含上述核酸的载体。

本公开文本还提供了用上述载体转化的细胞。

本公开文本还提供了用于将活性物质递送到细胞溶质中的组合物，该组合物包含上述细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段。

本公开文本还提供了用于生产上述细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括将内体逃逸基序x1-x2-x3-z1(其中x1-x2-x3选自下组，该组由以下各项组成：色氨酸(w)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)和苯丙氨酸(f))移植到轻链和/或重链可变区的cdr3中的步骤。

有益效果

包含具有根据本公开文本的内体逃逸基序的轻链可变区和/或重链可变区的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段穿透活细胞并定位于细胞溶质中，并且最终在不必使用特殊的外部蛋白质递送系统的情况下该抗体或其抗原结合片段可以穿透活细胞并定位于细胞溶质中。

根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段是包含容易地与各种人轻链可变区或重链可变区(vh)相互作用并结合的轻链可变区或重链可变区的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段，并且具有从内体逃逸到细胞溶质中的能力。该抗体或其抗原结合片段可以穿透细胞并定位于细胞溶质中，并且对靶细胞不显示非特异性细胞毒性。

基于根据本公开文本的高效细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段的内体逃逸机制，可以进行用于改进内体逃逸能力的抗体文库和突变体的设计。

将在根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段中包括的内体逃逸基序引入其他抗体中，以便可以预期其赋予内体逃逸能力。

此外，根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段可以被用作将活性物质递送到活细胞的细胞溶质中的载体，并且还可以被用作用于治疗和预防疾病的药物组合物。

附图简述

图1显示了为了观察引入细胞中的细胞溶质穿透抗体(cytotransmab)tmab4或细胞穿透肽tat的转运过程和稳定性而进行的脉冲追踪实验和共聚焦显微镜观察。

图2a显示了在存在或不存在其抑制剂的情况下细胞溶质穿透抗体tmab4或细胞穿透肽tat的细胞溶质穿透能力的共聚焦显微镜观察结果。

图2b是显示对图2a中所示的共聚焦显微照片的fitc(绿色荧光)荧光定量的结果的条形图。

图2c显示了在存在或不存在其抑制剂的情况下使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察细胞溶质穿透抗体tmab4或细胞穿透肽tat的细胞溶质定位的结果。

图2d是显示对图2c中所示的共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果的条形图。

图3a显示了为了确认对乙酰肝素酶表达的sirna(短干扰rna)诱导的抑制而进行的蛋白质印迹分析的结果。

图3b显示了由对乙酰肝素酶表达的抑制引起的细胞溶质穿透抗体/溶酶体融合的共聚焦显微镜观察的结果。

图3c显示了为了确认由对乙酰肝素酶表达的抑制引起的细胞溶质穿透抗体的细胞溶质定位而进行的共聚焦显微镜观察的结果。

图4是显示范围从细胞溶质穿透抗体的细胞内化到细胞溶质中的抗体定位的整个运输过程的示意图。

图5显示了为了检测抗体是否可以根据ph通过细胞膜引入或者抗体是否可以诱导其他物质的细胞膜渗透通过共聚焦显微镜观察ramos细胞中荧光标记的细胞溶质穿透抗体的结果。

图6a显示了为了检测细胞溶质穿透抗体是否可以根据ph形成孔并且摄取不具有膜渗透能力的台盼蓝通过光学显微镜观察ramos细胞的结果。

图6b是定量比较已经摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

图7a显示了为了确认在ph5.5下由细胞溶质穿透抗体产生的细胞膜孔是否是暂时的和可逆的而进行的光学显微镜观察的结果。

图7b是定量比较已经摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

图8显示了在不同的ph下通过流式细胞术(facs)分析细胞溶质穿透抗体和对照抗体阿达木单抗的细胞膜结合的结果。

图9显示了在不同的ph下通过流式细胞术(facs)分析细胞溶质穿透抗体和对照抗体阿达木单抗的细胞膜触发器(flip-flop)诱导能力的结果。

图10是显示基于上述实验预期的细胞溶质穿透抗体的孔形成模型的示意图。

图11显示了基于细胞溶质穿透抗体的轻链可变区的wam建模结构来预测细胞溶质穿透抗体的ph依赖性结构变化的结果，并且显示了参与结构变化的氨基酸以及通过结构变化暴露的氨基酸。

图12是定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过分别用丙氨酸、谷氨酸和亮氨酸取代轻链可变区(vl)的第1个氨基酸天冬氨酸和第95个氨基酸甲硫氨酸而构建，该第1个氨基酸天冬氨酸和第95个氨基酸甲硫氨酸在酸性ph下诱导细胞溶质穿透抗体特性的变化。

图13是定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用丙氨酸取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的cdr3的特定氨基酸而构建，该特定氨基酸可能参与内体逃逸。

图14a显示了为了分析通过用人种系序列取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的cdr1和cdr2构建的突变体的细胞溶质穿透能力而进行的共聚焦显微镜检查的结果，该cdr1和cdr2与hspg受体结合并参与细胞溶质穿透能力。

图14b显示了定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用人种系序列取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的cdr1和cdr2构建，该cdr1和cdr2与hspg受体结合并参与细胞溶质穿透能力。

图15a显示了在对预期具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体进行纯化之后在还原或非还原条件下的12％sds-page分析的结果。

图15b显示了为了检测预期具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的细胞溶质穿透能力是否得以维持而进行的共聚焦显微镜检测的结果。

图16是定量比较已经通过细胞溶质穿透抗体野生型和预期具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

图17a显示了使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察细胞溶质穿透抗体野生型和预期具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的细胞溶质定位的结果。

图17b是显示对图17a中所示的共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果的条形图。

图18是显示当细胞溶质穿透抗体野生型和具有改进的内体逃逸能力的突变体定位于细胞溶质中时观察到通过增强的分离gfp互补(split-gfpcomplementation)产生的gfp荧光的过程的示意图。

图19显示了在对与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体野生型和具有改进的内体逃逸能力的与gfp11-sbp2融合的突变体进行纯化之后在还原或非还原条件下的12％sds-page分析的结果。

图20a显示了为了检测与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体野生型和具有改进的内体逃逸能力的与gfp11-sbp2融合的突变体通过增强的分离gfp互补产生的gfp荧光而进行的共聚焦显微镜检测的结果。

图20b是显示对图20a中所示的共聚焦显微照片的gfp荧光定量的结果的图。

图21a是显示为了分析通过用精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸(它们是具有与色氨酸相反特性的氨基酸)取代获得的突变体的细胞膜结合而进行的流式细胞术(facs)的结果的图。

图21b是定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸(它们是具有与色氨酸相反特性的氨基酸)取代获得。

图21c是显示使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察通过用精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸(它们是具有与色氨酸相反特性的氨基酸)取代获得的突变体的细胞溶质定位和对共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果的条形图。

图22a是显示构建完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体的过程的示意图，该抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体用于检测具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的活性。

图22b显示在对完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体进行纯化之后在还原或非还原条件下的12％sds-page分析的结果。

图22c显示了为了检测完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体是否与位于细胞溶质中的细胞骨架微管蛋白合并而进行的共聚焦显微镜检测的结果。

图23a是显示构建完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体的过程的示意图，该ras靶向细胞溶质穿透抗体用于检测具有改进的内体逃逸能力的突变体的活性。

图23b显示在对完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体进行纯化之后在还原或非还原条件下的12％sds-page分析的结果。

图23c显示了为了测量抗体对gppnhp-结合的k-rasg12d和gdp-结合的k-rasg12d(它们为k-ras突变体)的亲和力而进行的酶联免疫吸附测定的结果。

图24显示了为了检测完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体是否与细胞内h-rasg12v突变体合并而进行的共聚焦显微镜观察的结果。

图25a是显示定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞数量的结果的图，该突变体通过用各种氨基酸取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的第1个氨基酸天冬氨酸构建，该第1个氨基酸天冬氨酸在酸性ph5.5下诱导细胞溶质穿透抗体的特性的变化。

图25b是显示定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞数量的结果的图，该突变体通过用各种氨基酸取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的第95个氨基酸甲硫氨酸构建，该第95个氨基酸甲硫氨酸在酸性ph5.5下诱导细胞溶质穿透抗体的特性的变化。

图26a显示了如下图，该图显示定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量，该突变体出于响应于ph诱导另外的特性变化的目的而设计。

图26b显示了如下条形图，该条形图显示使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察出于响应于ph诱导另外的特性变化的目的而设计的突变体的细胞溶质定位和对共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果。

图27是定量比较通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过改变细胞溶质穿透抗体的轻链可变区的cdr3的氨基酸数量而获得。

图28a显示了构建完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的轻链可变区中)的过程。

图28b显示了为了检测完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的轻链可变区中)的hspg结合亲和力和细胞溶质穿透能力是否将被减少或消除而进行的荧光显微镜观察的结果。

图28c显示了定量比较通过完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的轻链可变区中)在酸性ph下摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

图29a显示了为了测量完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中将改进的内体逃逸基序引入常规治疗性抗体的轻链可变区中)对gppnhp-结合的k-rasg12d和gdp-结合的k-rasg12d(它们是k-ras突变体)的亲和力而进行的elisa的结果。

图29b显示了如下示意图，该示意图显示构建完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的与rgd10肽融合的轻链可变区中)的过程。

图29c显示了为了检测完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的与rgd10肽融合的轻链可变区中)是否将与细胞内活化的h-rasg12v突变体合并而进行的共聚焦显微镜检测的结果。

图30a显示了构建具有已经去除内体逃逸能力的轻链可变区和已经引入改进的内体逃逸基序的重链可变区的细胞溶质穿透抗体的过程。

图30b显示了定量比较已经通过具有已经去除内体逃逸能力的轻链可变区和已经引入改进的内体逃逸基序的重链可变区的细胞溶质穿透抗体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

图30c显示了为了观察具有已经去除内体逃逸能力的轻链可变区和已经引入改进的内体逃逸基序的重链可变区的与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体通过增强的分离gfp互补产生的gfp荧光而进行的共聚焦显微镜检查的结果。

图30d显示了为了观察具有已经去除内体逃逸能力的轻链可变区和已经引入改进的内体逃逸基序的重链可变区的细胞溶质穿透抗体的细胞溶质定位而使用钙黄绿素进行的共聚焦显微镜检查的结果。

图31a是定量比较通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用各种氨基酸取代细胞溶质穿透抗体的重链可变区(vh)的第1个氨基酸谷氨酸构建，该第1个氨基酸谷氨酸在酸性ph5.5下诱导抗体特性的变化。

图31b是定量比较通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用各种氨基酸取代细胞溶质穿透抗体的重链可变区(vh)的第102个氨基酸亮氨酸构建，该第102个氨基酸亮氨酸在酸性ph5.5下诱导抗体特性的变化。

图32a显示了定量比较已经通过完整igg形式细胞溶质穿透抗体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该完整igg形式细胞溶质穿透抗体具有引入了含有三个色氨酸残基的内体逃逸基序的轻链可变区和/或重链可变区。

图32b显示了如下条形图，该条形图显示使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察完整igg形式细胞溶质穿透抗体的细胞溶质定位和对共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果，该完整igg形式细胞溶质穿透抗体具有引入了含有三个色氨酸残基的内体逃逸基序的轻链可变区和/或重链可变区。

图33a显示了如下示意图，该示意图显示构建完整igg形式细胞溶质穿透抗体(其中已经在其重链可变区中引入改进的内体逃逸基序并且已经在与epcam靶向肽融合的常规治疗性抗体的轻链可变区中引入改进的内体逃逸基序)的过程。

图33b显示如下条形图，该条形图显示使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察完整igg形式细胞溶质穿透抗体(其中已经在其重链可变区中引入改进的内体逃逸基序并且已经在与epcam靶向肽融合的常规治疗性抗体的轻链可变区中引入改进的内体逃逸基序)的细胞溶质定位和对共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果。

图33c显示了定量比较已经通过完整igg形式细胞溶质穿透抗体(其中已经在其重链可变区中引入改进的内体逃逸基序并且已经在与epcam靶向肽融合的常规治疗性抗体的轻链可变区中引入改进的内体逃逸基序)根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

图34a是显示构建其中已经将改进的内体逃逸基序引入常规治疗性抗体的重链可变区中的完整igg形式细胞溶质穿透抗体的过程的示意图。

图34b是定量比较已经通过完整igg形式细胞溶质穿透抗体(其中已经将改进的内体逃逸基序引入常规治疗性抗体的重链可变区中)根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

图35是定量比较已经通过完整igg形式细胞溶质穿透抗体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该完整igg形式细胞溶质穿透抗体包含引入了天冬氨酸的轻链可变区和/或重链可变区。

图36a显示了通过ri1000(rockimager1000；自动蛋白质晶体图像分析系统)观察在指数g1条件下形成的ct-59fab的晶体的结果。

图36b显示了使用pymol程序细化和验证的ct-59的三维结构。第1个氨基酸天冬氨酸(d)和第95个氨基酸甲硫氨酸(m)以黄色显示，并且第92个至第94个氨基酸以橙色显示。

实施本发明的最佳方式

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法和将在下面描述的实验方法是本领域公知和常用的那些。

在一个方面，本公开文本涉及细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区和/或重链可变区在其cdr3中包含由下式表示的序列：

x1-x2-x3-z1

其中x1-x2-x3是内体逃逸基序，并且x1、x2和x3中的每一个选自下组，该组由以下各项组成：色氨酸(w)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)和苯丙氨酸(f)；

z1选自下组，该组由以下各项组成：甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、组氨酸(h)、天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)；

包含z1的该轻链可变区和/或该重链可变区在内体酸性ph条件下诱导该抗体特性的变化；并且

该抗体通过该抗体特性的变化展现出从内体逃逸到细胞溶质中的能力。

本公开文本中的“内体逃逸”可以意指通过内吞作用主动穿透活细胞，并然后在酸性条件下从内体逃逸到细胞溶质中。

本公开文本中的“内体逃逸基序”包括包含在酸性条件下具有诱导内体逃逸的特性的特定氨基酸序列的一维结构、以及从而形成的三维结构。“内体逃逸基序”可以与“具有内体逃逸能力的基序”互换使用。包含含有“内体逃逸基序”的轻链可变区(vl)或重链可变区(vh)的抗体能够“穿透细胞溶质”。“细胞溶质穿透抗体”意指通过内吞作用穿透细胞的抗体在酸性条件下从内体逃逸到细胞溶质中。“细胞溶质穿透抗体”可以与“具有细胞溶质穿透能力的抗体”互换使用。

在本公开文本中，包括在内体逃逸基序x1-x2-x3-z1中的z1可以位于轻链可变区的第95个氨基酸或重链可变区的第102个氨基酸(如通过kabat编号系统编号的)，并且是疏水性氨基酸(甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)或亮氨酸(l))、带负电荷的氨基酸(天冬氨酸(d)或谷氨酸(e))、或带正电荷的氨基酸(组氨酸(h))。根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体的轻链可变区或重链可变区的第1个氨基酸在内体酸性ph条件下可以与带负电荷的天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)和z1(其是轻链可变区的第95个氨基酸或重链可变区的第102个氨基酸)相互作用，从而诱导抗体特性的变化并且允许抗体具有从内体逃逸到细胞溶质中的能力。

在本公开文本中，细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和/或重链可变区的第1个氨基酸在内体酸性ph条件下可以与z1相互作用，以诱导细胞溶质穿透抗体特性的变化。

此外，随着ph7.4变成内体酸性ph5.5，内体逃逸基序的z1与轻链可变区和/或重链可变区的第1个氨基酸之间的相互作用发生变化。换句话说，当z1由疏水性氨基酸甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)或亮氨酸(l)或者带负电荷的氨基酸天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)构成时，带负电荷氨基酸的侧链中的羧酸在酸性条件下通过部分质子化变成疏水性的，并因此z1与天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)(其是轻链可变区或重链可变区的第1个氨基酸)发生疏水相互作用。

此外，关于通过内体逃逸基序的z1与轻链可变区或重链可变区的第1个氨基酸之间的相互作用诱导抗体特性的ph依赖性变化，当z1由疏水性氨基酸甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)或亮氨酸(l)构成时，它在中性ph条件下不与带负电荷的氨基酸天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)(其是轻链可变区或重链可变区的第1个氨基酸)相互作用。然而，随着ph降低，带负电荷的氨基酸通过质子化变成疏水性的，并因此与z1发生疏水相互作用。结果，两个氨基酸之间的距离变得更近，从而诱导蛋白质结构和功能的变化。这种现象被称为tanford转变。

此外，当z1由组氨酸(h)构成时，随着ph从7.4变成5.5，氨基酸侧链的净电荷变成阳性，并且z1与天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)(其是轻链可变区或重链可变区的第1个氨基酸)发生静电相互作用。

在本公开文本的实施例中，为了确认抗体特性的ph依赖性变化是否由轻链可变区的第1个和第95个氨基酸对诱导，使用丙氨酸取代突变体来分析内体逃逸能力。结果，丙氨酸取代突变没有显示出ph依赖性内体逃逸能力。此外，使用通过用20种不同的氨基酸取代第95个氨基酸获得的突变来分析内体逃逸能力，结果，其中根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体的轻链可变区的第95个氨基酸由甲硫氨酸(m)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)和组氨酸(h)构成的突变体显示出ph依赖性内体逃逸能力。

在本公开文本的实施例中，关于重链可变区的第1个和第102个氨基酸对，其诱导抗体特性的ph依赖性变化，其以与上述实施例相同的方式通过丙氨酸取代突变实验发现，使用通过用13种不同的氨基酸取代第102个氨基酸获得的突变来分析内体逃逸能力，结果，其中根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体的重链可变区的第102个氨基酸由甲硫氨酸(m)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)和组氨酸(h)构成的突变体显示出ph依赖性内体逃逸能力。

此外，在本公开文本的一个实施方案中，细胞溶质穿透抗体可以在x3与z1之间进一步包含由(a1-...-an)(其中n是从1至10范围内的整数)表示的氨基酸序列。在本公开文本的一个实施方案中，当细胞溶质穿透抗体在x3与z1之间进一步包含由(a1-...-an)(其中n是从1至10范围内的整数)表示的氨基酸序列时，可以促进内体逃逸基序特性的变化，同时cdr3的长度增加。

在本公开文本中，内体逃逸基序具有包括在轻链可变区；重链可变区；或者轻链可变区和重链可变区中的x1-x2-x3-z1的结构，并且x1、x2和x3中的每一个选自下组，该组由以下各项组成：色氨酸(w)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)和苯丙氨酸(f)。

在本公开文本中，内体逃逸基序x1-x2-x3可以在细胞内内体弱酸性ph(例如，5.5至6.5的ph，其是早期内体ph)下反应，并因此z1可以与轻链可变区或重链可变区的第1个氨基酸相互作用，从而改变抗体特性并显著增加抗体的内体逃逸效率。

在本公开文本中，内体逃逸基序x1、x2和x3选自下组，该组由以下各项组成：容易地与1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)(其是内体内膜的主要磷脂组分)的亲水性头部和疏水性尾部发生相互作用的氨基酸。

具体地，20种不同的氨基酸对1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)的平均结合活性按色氨酸(w)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、半胱氨酸(c)和甲硫氨酸(m)的顺序越来越高。

具体地，20种不同的氨基酸对1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)的亲水性头部的结合活性按精氨酸(r)、色氨酸(w)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、赖氨酸(k)和苯丙氨酸(f)的顺序越来越高。此外，20种不同的氨基酸对1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)的疏水性尾部的结合活性按色氨酸(w)、苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)和酪氨酸(y)的顺序越来越高。

在本公开文本中，构成内体逃逸基序的x1、x2和x3的氨基酸可以包括酪氨酸(y)和组氨酸(h)，其构成野生型细胞溶质穿透抗体。因此，这些氨基酸可以包括色氨酸(w)和苯丙氨酸(f)，其对1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)具有比酪氨酸(y)更高的平均结合亲和力。

在本公开文本的实施例中，通过文献检索检测了容易地与1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)发生相互作用的氨基酸。此外，将对亲水性头部和疏水性尾部具有高结合亲和力的色氨酸(w)引入内体逃逸基序的x1、x2和x3中，并且分析内体逃逸能力。结果，根据本公开文本的改进的细胞溶质穿透抗体显示出比分别在x1、x2和x3中包括酪氨酸(y)、酪氨酸(y)和组氨酸(h)的野生型细胞溶质穿透抗体更高的ph依赖性内体逃逸能力。

在另一个实施例中，为了检测与1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)的头部或尾部的相互作用是否对内体逃逸是重要的，通过在内体逃逸基序的x1、x2和x3中引入仅容易地与头部结合的精氨酸(r)、仅容易地与尾部结合的异亮氨酸(i)和显示出与脂质显著低的相互作用的甘氨酸(g)来构建突变体，并且分析内体逃逸能力。结果，除了根据本公开文本的引入了色氨酸(w)的细胞溶质穿透抗体之外的两种突变体全部都显示出显著降低的内体逃逸能力。这表明与脂质的亲水性头部和疏水性尾部的相互作用全部都参与内体逃逸。

在再另一个实施例中，轻链可变区的内体逃逸基序可以包含一个或多个色氨酸、或一个或两个色氨酸。

为了增加在细胞溶质中展现出其活性的物质的作用，位于细胞溶质中的物质的量应该最终增加。因此，已经进行了研究以增加内体逃逸能力。主要对细胞穿透肽(cpp)进行了此类研究。特别地，与脂质膜的相互作用对于通过细胞脂质膜是必需的，已经引入了增强这种相互作用的策略。作为一个实施例，将色氨酸添加到富含精氨酸的细胞溶质穿透肽的n末端和该肽的中间部分。

然而，尚未对抗体尝试这种方法。色氨酸(w)是显示出与1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)(其是细胞膜的主要磷脂组分)的亲水性头部和疏水性尾部发生高度相互作用的氨基酸。因此，它可以改进与内体内膜的相互作用并诱导内体逃逸。

具体地，在本公开文本的实施例中，轻链可变区和/或重链可变区的内体逃逸基序x1-x2-x3可以包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：w-w-w、w-w-h、w-y-w、y-w-w、w-y-h、和y-w-h(其中w是色氨酸、y是酪氨酸、h是组氨酸)。

在本公开文本的实施例中，据发现，轻链可变区和/或重链可变区的内体逃逸基序x1-x2-x3通过在内体酸性ph条件下诱导相互作用通过抗体特性的变化增加内体逃逸能力。

如本文所用，术语“内体酸性ph”是指6.0至4.5的ph范围，其满足早期内体和晚期内体ph条件并且其中天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)的侧链特性可能发生变化。

包含内体逃逸基序的轻链可变区的cdr1可以包含选自下组的一个或多个序列，该组由以下各项组成：

qqywwhmyt(seqidno:8)；

qqywywmyt(seqidno:9)；

qqyywwmyt(seqidno:10)；

qqywyhmyt(seqidno:11)；

qqyywhmyt(seqidno:12)；和

qqywwwmyt(seqidno:51)。

包含内体逃逸基序的轻链可变区可以包含与选自由例如seqidno:1至5、13至23、25至37、50、以及60至64组成的组的轻链可变区序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的序列。

即使当在重链可变区中包括内体逃逸基序时，也可以在相同水平上实现改进的内体逃逸效率。具体地，重链可变区在其cdr3中可以包括x1-x2-x3-z1(其中x1、x2和x3中的每一个选自下组，该组由以下各项组成：色氨酸(w)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)和苯丙氨酸(f))，并且z1在内体酸性ph条件下可以与重链可变区的第1个氨基酸相互作用，因此改变细胞溶质穿透抗体的特性并使得抗体能够具有从内体逃逸到细胞溶质中的能力。

包含内体逃逸基序的重链可变区的cdr3可以包含选自下组的一个或多个序列，该组由以下各项组成：seqidno:46至49、和53：

gwywmdl(seqidno:46)；

gwywfdl(seqidno:47)；

gwywgfdl(seqidno:48)；

ywywmdl(seqidno:49)；和

gwwwmdl(seqidno:53)。

该轻链可变区包含与选自由seqidno:1至5、13至23、25至37、50、以及60至64组成的组的轻链可变区序列具有至少80％同源性的序列。

包含内体逃逸基序的重链可变区可以包含与选自由例如seqidno:39至42、52、以及54至59组成的组的重链可变区序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的序列。

此外，在一个实施方案中，序列可以进一步包含与x1连接的z2，并因此可以由下式表示：

z2-x1-x2-x3-z1，

其中z2选自下组，该组由以下各项组成：谷氨酰胺(q)、亮氨酸(l)、组氨酸(h)。

如上所述，序列由z2-x1-x2-x3-z1表示，轻链可变区和/或重链可变区的第1个氨基酸在内体酸性ph条件下与z1和/或z2相互作用以诱导ph依赖性内体逃逸。

包含内体逃逸基序的轻链可变区的cdr1可以包含如下所示的seqidno:24的序列：

qhywywmyt(seqidno:24)。

如本文所用，“抗体”意在包括特异性地结合靶标的完整抗体形式以及抗体的抗原结合片段。

完整抗体是具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，并且每条轻链通过二硫键与重链连接。重链的恒定区具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(delta)(δ)和艾普西隆(epsilon)(ε)类型。子类具有伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)类型。轻链的恒定区具有卡帕(kappa)(κ)和兰布达(lambda)(λ)类型。

抗体的抗原结合片段或抗体片段是指具有抗原结合功能的片段，并且包括fab、f(ab′)、f(ab′)2、fv等。抗体片段的fab具有包括轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(ch1结构域)的结构，该结构具有一个抗原结合位点。fab′与fab的不同之处在于它具有在重链ch1结构域的c末端含有一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。f(ab′)2抗体是在当fab′的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键时产生。用于生成具有仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段的fv片段的重组技术描述于pct国际公开号wo88/001649、wo88/006630、wo88/07085,wo88/07086和wo88/09344。双链fv在重链可变区和轻链可变区之间具有非共价键。单链fv(scfv)经由肽接头通过共价键或直接在c-末端与重链可变区和轻链可变区连接。因此，单链fv(scfv)具有诸如二聚体的结构，其与双链fv类似。这种抗体片段可以使用蛋白质水解酶获得(例如，当用木瓜蛋白酶切割整个抗体时，可以获得fab，并且当用胃蛋白酶切割完整抗体时，可以获得f(ab′)2片断)，并且其还可以通过基因重组技术产生。

在一个实施方案中，根据本公开文本的抗体可以是fv形式(例如scfv)或完整抗体形式。根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体可以是igg、igm、iga、igd或ige类型。例如，它可以是igg1、igg2、igg3、igg4、igm、ige、iga1、iga5或igd类型。最优选地，它可以是完整igg形式单克隆抗体。

此外，重链恒定区可以选自伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和艾普西隆(ε)的任何一种同种型。子类具有伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)类型。轻链的恒定区具有卡帕(kappa)(κ)和兰布达(lambda)(λ)类型。

如本文所用，术语“重链”是指包含可变区结构域vh和三个恒定区结构域ch1、ch2和ch3的全长重链及其片段，所述可变区结构域vh包含具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列的氨基酸序列。如本文所用，术语“轻链”是指包含可变区结构域vl和恒定区结构域cl的全长重链及其片段，所述可变区结构域vl包含具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列的氨基酸序列。

在本公开文本中，抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链fv(scfv)、单链抗体、fab片段、f(ab')片段、二硫键连接的fv(sdfv)和抗独特型(抗id)抗体，以及这些抗体的表位结合片段，但不限于此。

“fv”片断是含有完全抗原识别和结合位点的抗体片段。这种区域包括重链可变结构域和轻链可变结构域，例如，与scfv基本上紧密共价结合的二聚体。

“fab”片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(ch1)。f(ab')2抗体片段通常包括通过铰链半胱氨酸在其羧基末端附近共价连接的一对fab片段。

“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl结构域。此类结构域在单个多肽链内。fv多肽可以进一步包括在vh结构域与vl结构域之间的多肽接头，以使得scfv可以形成用于抗原结合的所需结构。

单克隆抗体是指从基本上同源的抗体群体获得的抗体，即除可能以占据群体的个体抗体的痕量存在的天然存在的突变外，它们是相同的。单克隆抗体是高度特异性的并且针对单个抗原位点衍生。

“人源化”形式的非人(例如鼠类)抗体是嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其己由来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔和非人灵长类)的高变区(供体抗体)的残基替换，其具有特异性、亲和力和保持来自受体高变区的残基的能力。

“人抗体”是衍生自人免疫球蛋白的分子，并且意指构成抗体的所有氨基酸序列(包括互补决定区和结构区)由人免疫球蛋白构成。

重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体种类或子类的抗体中的对应序列部分相同或同源，而一个或多个剩余的链与源自另一物种或属于另一抗体种类或子类(“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及展现出所需的生物学活性的这种抗体的片段)的抗体中的对应序列相同或同源。

如本文所用，“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链区和重链区，其包含互补决定区(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)和框架区(fr)的氨基酸序列。vh是指重链的可变结构域。vl是指轻链的可变结构域。

“互补决定区”(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个cdr区，标识为cdr1、cdr2和cdr3。

“框架区”(fr)是除cdr残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个fr，标识为fr1、fr2、fr3和fr4。

在另一方面中，本公开文本涉及用于将活性物质递送到细胞溶质中的组合物，该组合物包含细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段。

活性物质可以是与抗体融合或键合的类型，并且活性物质可以是选自下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：例如，肽、蛋白质、毒素、抗体、抗体片段、rna、sirna、dna、小分子药物、纳米粒子和脂质体，但不限于此。

蛋白质可以是抗体、抗体片段、免疫球蛋白、肽、酶、生长因子、细胞因子、转录因子、毒素、抗原肽、激素、载体蛋白、运动功能蛋白、受体、信号传导蛋白、储存蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、内部蛋白、外部蛋白、分泌蛋白、病毒蛋白、糖蛋白、裂解蛋白、蛋白复合物、化学修饰蛋白等。

rna或核糖核酸基于核糖(一种戊糖)，是一种由核苷酸链组成的核酸，具有单链结构，并且通过一部分dna的转录形成。在一个实施方案中，rna可以选自下组，该组由以下各项组成：rrna、mrna、trna、mirna、snrna、snorna和arna，但不限于此。

sirna(小干扰rna)是由dsrna构成的小rna干扰分子，并且起到结合并降解具有靶序列的mrna的作用。它被用作疾病治疗剂或具有通过降解靶mrna抑制从靶mrna翻译的蛋白质的表达的活性。由于这种活性，它在本文中被广泛使用。

dna或脱氧核糖核酸是一种核酸，由包含通过磷酸连接的单糖脱氧核糖的骨架链连同两种类型的核碱基(嘌呤和嘧啶)构成，并且存储细胞的遗传信息。

如本文所用，术语“小分子药物”是指具有小于约1000da的分子量并且有对抗疾病的治疗剂活性的有机化合物、无机化合物或有机金属化合物。该术语在本文中以广义使用。本文中的小分子药物涵盖寡肽和具有小于约1000da分子量的其他生物分子。

在本公开文本中，纳米粒子是指包括直径在1与1,000nm之间范围内的物质的颗粒。纳米粒子可以是金属纳米粒子、由金属纳米粒子核和包封核的金属壳组成的金属/金属核壳复合物、由金属纳米粒子核和包封核的非金属壳组成的金属/非金属核壳、或由非金属纳米粒子核和包封核的金属壳组成的非金属/金属核壳复合物。根据一个实施方案，金属可以选自金、银、铜、铝、镍、钯、铂、磁性铁及其氧化物，但不限于此，并且非金属可以选自二氧化硅、聚苯乙烯、胶乳和丙烯酸酯类物质，但不限于此。

在本公开文本中，脂质体包括包封内部水性隔室的至少一个脂质双层，其能够自身结合。脂质体可以通过其膜类型和尺寸来表征。小单层囊泡(suv)可以具有单个膜，并且其直径可以在20nm与50nm之间的范围内。大单层囊泡(luv)的直径可以为至少50nm。寡层大囊泡和多层大囊泡可以具有多个(通常同心的)膜层，并且其直径可以为至少100nm。具有几个非同心膜(即包含在较大囊泡内的几个小囊泡)的脂质体被称为多泡囊泡。

术语“融合”或“结合”是指使具有相同或不同功能或结构的两个分子统一，并且融合的方法可以包括能够将肿瘤组织穿透肽与蛋白质、小分子药物、纳米粒子或脂质体结合的任何物理、化学或生物学方法。优选地，融合可以通过接头肽制备，并且例如，接头肽可以介导在本公开文本的抗体轻链可变区、抗体或其片段的不同位置处与生物活性分子的融合。

在再另一方面中，本公开文本提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含：上述细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段；以及将通过细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段递送到细胞溶质中的活性物质。

活性物质的使用可以赋予穿透细胞和定位于细胞溶质中的特性，而不影响抗体对抗原的高特异性和亲和力，并因此可以定位于目前基于小分子药物在疾病治疗中被分类为靶标的细胞溶质中，并且同时，可以展现出对肿瘤和疾病相关因子的治疗和诊断的高度作用，该因子通过蛋白质与蛋白质之间的宽且平的表面显示出结构上复杂的相互作用。

用于预防或治疗癌症的药物组合物的使用可以赋予使抗体能够穿透细胞并保留在细胞溶质中的特性，而不影响抗体对抗原的高特异性和亲和力，并因此该抗体可以定位于目前基于小分子药物在疾病治疗中被分类为靶标的细胞溶质中，并且同时，可以预期展现出对肿瘤和疾病相关因子的治疗和诊断的高度作用，该因子通过蛋白质与蛋白质之间的宽且平的表面显示出结构上复杂的相互作用。

在本公开文本的一个实施例中，药物组合物可以选择性地抑制kras突变体，该kras突变体是在各种常规肿瘤治疗剂的使用中的主要药物抗性相关因子；并且同时，可以与常规治疗剂组合使用，从而展现出有效的抗癌活性。

癌症可以选自下组，该组由以下各项组成：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼黑色素瘤、直肠癌、肛门癌、食管癌、小肠癌、内分泌癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴瘤、肝细胞瘤、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和头颈癌。

当将组合物制备成用于预防或治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物时，该组合物可以包括药学上可接受的载体。在组合物中含有的药学上可接受的载体通常用于配制品中。在组合物中包括的药学上可接受的载体的例子可以包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、金合欢树橡胶(acaciarubber)、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等，但不限于此。除了上述成分以外，药物组合物可以进一步包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

用于预防或治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物可以口服或肠胃外给予。这种肠胃外给予包括静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮给予、局部给予、鼻内给予、肺内给予、直肠内给予等。由于口服给予时蛋白或肽被消化，所以优选的是将用于口服给予的组合物配制成活性物质经包衣或被保护免于在胃中降解。另外，药物组合物可通过能够将活性物质转运至靶细胞的任何装置给予。

用于预防或治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物的适当剂量可以根据各种因素而变化，例如用于配制的方法、给予方法、年龄、体重、性别、患者的病理状态、食物、给予时间、给予途径、排泄率和反应灵敏度等。优选地，基于成人，组合物的适当剂量在0.001mg/kg和100mg/kg的范围内。如本文所用的术语“药学有效剂量”是指足以预防或治疗癌症或血管生成相关疾病的量。

可以根据本领域技术人员可以容易地实施的方法将组合物与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起配制，并且可以将该组合物以单位剂量形式提供或包封在多剂量小瓶中。此处，药物组合物的配制品可以是处于在油性或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液的形式，或者可以是提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊，并且可以进一步包括分散剂或稳定剂。另外，组合物可以单独给予或与其他治疗剂组合给予，并且可以与常规治疗剂依序或同时给予。同时，组合物包括抗体或抗原结合片段，并因此可以被配制成免疫脂质体。包括抗体的脂质体可以根据相关领域熟知的方法制备。免疫脂质体是包括磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，并且可以通过反相蒸发法制备。例如，抗体的fab'片段可以通过二硫化物交换反应与脂质体缀合。脂质体可以进一步包括化学治疗剂，例如阿霉素。

在又另一方面中，本公开文本涉及用于诊断癌症的药物组合物，其包含：上述细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段；以及将通过细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段递送到细胞溶质中的活性物质。

如本文所用的术语“诊断”是指证明病理生理学病症的存在或特征。本公开文本中的诊断是指证明癌症的发作和进展。

完整免疫球蛋白形式抗体及其片段可以与用于分子成像的荧光物质结合，以便通过图像诊断癌症。

用于分子成像的荧光物质是指所有产生荧光的物质。优选地，发射红色或近红外荧光，并且更优选地，发射具有高量子产率的荧光。然而，荧光不限于此。

优选地，用于分子成像的荧光物质是用于成像的荧光物质、荧光蛋白或其他物质，其可以与特异性地结合完整免疫球蛋白形式抗体及其片段的肿瘤组织穿透肽结合，但不限于此。

优选地，荧光物质是荧光素、bodypy、四甲基罗丹明、alexa、菁、别菁(allopicocyanine)或其衍生物，但不限于此。

优选地，荧光蛋白是dronpa蛋白、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、红色荧光蛋白(dsrfp)、cy5.5(其是呈现近红外荧光的菁荧光物质)、或其他荧光蛋白，但不限于此。

优选地，用于成像的其他物质是氧化铁、放射性同位素等，但不限于此，并且它们可以应用于诸如mr、pet等成像设备。

在进一步的另一方面中，本公开文本涉及编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸。

核酸是多核苷酸，并且如本文所用的术语“多核苷酸”是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。其包括rna基因组序列、dna(gdna和cdna)以及由其转录的rna序列。除非另有说明，否则其还包括天然多核苷酸的类似物。

多核苷酸不仅包括编码上述具有改进的内体逃逸能力的轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)的核苷酸序列，还包括其互补序列。互补序列包括与该核苷酸序列完全互补的序列以及与该核苷酸序列基本上互补的序列。例如，该互补序列可以包括如下序列，该序列可以在相关领域中已知的严格条件下与编码具有选自下组的任一序列的轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)的核苷酸序列杂交，该组由以下各项组成：seqidno:1至5、13至23、25至37、50、和60至64、以及seqidno:39至42、52、和54至59。

多核苷酸不仅包括编码上述轻链区(kds)的核苷酸序列，还包括其互补序列。互补序列包括与该核苷酸序列完全互补的序列以及与该核苷酸序列基本上互补的序列。例如，这意指可以在相关领域中已知的严格条件下与编码seqidno:1至seqidno:3中的任一者的氨基酸序列的核苷酸序列杂交的序列。

核酸可以被修饰。修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守取代或保守取代。编码氨基酸序列的核酸被理解为包括与该核苷酸序列具有实质同一性的核苷酸序列。实质同一性可以是指当对齐核苷酸序列以尽可能地对应于任何其他序列并且使用相关领域中通常使用的算法分析该对齐的序列时，具有至少80％的同源性、至少90％的同源性、或至少95％的同源性的序列。

编码该抗体的dna可以使用常规程序(例如，使用能够特异性地结合编码抗体的重链和轻链的dna的寡核苷酸探针)容易地分离或合成。

在再进一步的方面中，本公开文本涉及用于生产上述细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括将内体逃逸基序x1-x2-x3-z1(其中x1-x2-x3选自下组，该组由以下各项组成：色氨酸(w)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)和苯丙氨酸(f))移植到轻链和/或重链可变区的cdr3中的步骤。

本公开文本可以通过用具有改进的内体逃逸能力的轻链可变区(vl)取代常规抗体的轻链可变区(vl)并且用具有改进的内体逃逸能力的重链可变区(vh)取代常规抗体的重链可变区(vh)来提供具有细胞溶质穿透能力的抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，通过使用具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透轻链可变区(vl)和具有内体逃逸能力的细胞溶质穿透重链可变区来产生穿透细胞并定位于细胞溶质中的完整免疫球蛋白形式抗体的方法包括以下步骤：获得核酸，其中在包含轻链可变区(vl)的轻链中的轻链可变区(vl)和轻链恒定区被具有内体逃逸能力的轻链可变区(vl)取代或者重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)被具有内体逃逸能力的重链可变区(vh)取代，将该核酸克隆到载体中，并将该载体转化到宿主细胞中以表达该抗体或其抗原结合片段；并且回收该表达的抗体或其抗原结合片段。

上述方法使得可以产生具有增加的内体逃逸能力和细胞溶质穿透能力的完整免疫球蛋白形式抗体。此外，用表达包含能够识别细胞中的特定蛋白的重链可变区的重链的载体转化使得可以表达能够穿透细胞并定位于细胞溶质中以结合特定蛋白的抗体。载体可以是在单个载体中共表达重链和轻链的载体系统、或者在单独的载体中表达重链和轻链的载体系统。在后一种情况下，可以通过共转化和靶向转化将两种载体引入宿主细胞中。

在本公开文本中，载体可以是在单个载体中共表达重链和轻链的载体系统、或者在单独的载体中表达重链和轻链的载体系统。在后一种情况下，可以通过共转化和靶向转化将两种载体引入宿主细胞中。

如本文所用的术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的手段。例如，载体可以包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、和病毒载体(如腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体)。可以用作重组载体的载体可以通过操作在相关领域中常用的质粒(例如，psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列和puc19等)、噬菌体(例如，λgt4λb、λ-charon、λδz1和m13等)、或病毒(例如，cmv、sv40等)产生。

重组载体中的本公开文本的轻链可变区、轻链恒定区(cl)、重链可变区(vh)和重链恒定区(ch1-铰链-ch2-ch3)可以与启动子可操作地连接。如本文所用的术语“可操作地连接”意指核苷酸表达控制序列(例如启动子序列)和第二核苷酸序列之间的功能性连接。因此，控制序列可以控制第二核苷酸序列的转录和/或翻译。

通常可以将重组载体构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。作为用于表达的载体，可以使用在相关领域中通常用于表达来自植物、动物或微生物的外源蛋白的载体。可以通过相关领域中已知的各种方法构建重组载体。

可以将重组载体构建成使用原核细胞或真核细胞作为宿主的载体。例如，当所使用的载体是表达载体并使用原核细胞作为宿主时，该载体通常包括可以促进转录的强启动子(例如，plλ启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子等)、用于启动翻译的核糖体结合位点、和用于转录/翻译的终止序列。当载体使用真核细胞作为宿主时，在载体中包括的在真核细胞中运作的复制起点可以包括f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺病毒复制起点、aav复制起点、cmv复制起点和bbv复制起点等，但不限于此。此外，可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物细胞病毒的启动子(例如，腺病毒后期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子或hsv的tk启动子)，并且启动子通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。

本公开文本的另一方面提供了用重组载体转化的宿主细胞。

相关领域中已知的任何种类的宿主细胞都可以用作宿主细胞。原核细胞的例子包括属于芽孢杆菌属(bascillus)的菌株，例如大肠杆菌(e.coli)jm109、大肠杆菌bl21、大肠杆菌rr1、大肠杆菌le392、大肠杆菌b、大肠杆菌x1776、大肠杆菌w3110、枯草芽孢杆菌(bascillussubtilus)和苏云金芽孢杆菌(bascillusthuringiensis)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、肠道菌群和菌株例如粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)以及各种假单胞菌属(pseudomonas)物种等。此外，当载体被转化到真核细胞中时，可以使用宿主细胞例如酵母(酿酒酵母(saccharomycecerevisiae))、昆虫细胞、植物细胞、和动物细胞(例如sp2/0、cho(中国仓鼠卵巢)k1、chodg44、per.c6、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、huh7、3t3、rn、和mdck细胞系等)。

本公开文本的另一方面可以提供用于产生穿透细胞并定位于细胞溶质中的完整免疫球蛋白形式抗体的方法，该方法包括培养上述宿主细胞的步骤。

可以使用相关领域中熟知的插入方法将重组载体插入宿主细胞中。例如，当宿主细胞是原核细胞时，可以根据cacl2方法或电穿孔方法等进行转化，并且当宿主细胞是真核细胞时，可以根据显微注射方法，磷酸钙沉淀方法，电穿孔方法，脂质体介导的转化方法和基因轰击方法等将载体转化到宿主细胞中，但转化方法不限于此。当使用诸如大肠杆菌等微生物时，生产率高于使用动物细胞。然而，尽管由于糖基化它不适合用于产生完整ig形式抗体，但是它可以用于产生抗原结合片段例如fab和fv。

可以使用由所选择的标记表达的表型根据相关领域中熟知的方法容易地实施用于选择被转化的宿主细胞的方法。例如，当所选择的标记是特定的抗生素抗性基因时，转化体可以通过在含有抗生素的培养基中培养该转化体来容易地选择。

实施例

在下文中，将参考实施例进一步详细描述本公开文本。对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，而不应解释为限制或改变本公开文本的范围。

实施例1：细胞溶质穿透抗体(cytotransmab)的表达和纯化

为了阐明细胞溶质穿透抗体的内体逃逸机制并改进内体逃逸机制，对细胞溶质穿透抗体进行了纯化。

具体地，为了构建用于产生完整igg形式单克隆抗体的重链表达载体，将编码包含抗体重链可变区(人源化ht0vh；seqidno:38)和重链恒定区(ch1-铰链-ch2-ch3)的重链的dna(其具有与5'末端融合的分泌信号肽编码dna)通过noti/hindiii克隆到pcdna3.4载体(invitrogen)中。

此外，为了构建表达轻链的载体，将编码包含细胞溶质穿透轻链可变区(ht4vl；seqidno:65)和轻链恒定区(cl)的轻链的dna(其具有与5'末端融合的分泌信号肽编码dna)通过使用noti/hindiii克隆到pcdna3.4载体(invitrogen)中。

瞬时转染轻链和重链表达载体，并且表达和纯化蛋白质。在摇瓶中，用质粒和聚乙烯亚胺(pei)(polyscience)的混合物转染在无血清freestyle293表达培养基(invitrogen)中悬浮生长的hek293-f细胞。在摇瓶(corning)中转染200ml之后，将hek293-f细胞以2.0x10⁶个细胞/ml的密度接种到100ml培养基中，并以150rpm且在8％co2中进行培养。为了生产每种单克隆抗体，将合适的重链和轻链质粒稀释于10mlfreestyle293表达培养基(invitrogen)中(125μg重链、125μg轻链，总共250μg(2.5μg/ml))，并且将稀释液与含有750μg(7.5μg/ml)pei的10ml培养基混合，并且将混合物在室温下孵育10分钟。将孵育的培养基混合物添加到100ml所接种的细胞培养物中，然后将其在8％co2中以150rpm培养4小时，其后向细胞培养物中添加100mlfreestyle293表达培养基，随后培养6天。

根据标准方案，从收集的细胞培养上清液中纯化蛋白质。将抗体应用于proteinasepharose柱(gehealthcare)，并用pbs(ph7.4)洗涤。使用0.1m甘氨酸缓冲液(ph3.0)洗脱抗体，并然后立即用1mtris缓冲液中和。浓缩洗脱的抗体级分，同时通过透析用pbs(ph7.4)替换缓冲液。通过测量280nm处的吸光度和吸收系数来定量纯化的蛋白质。

实施例2：观察细胞溶质穿透抗体内吞作用之后的运输

观察到从开发的细胞溶质穿透抗体的内吞作用运输以定位到细胞溶质中。这可能是内体逃逸到细胞溶质中的机制的重要线索。

图1显示了为了观察引入细胞中的细胞溶质穿透抗体(cytotransmab)tmab4或细胞穿透肽tat的转运过程和稳定性而进行的脉冲追踪实验和共聚焦显微镜观察。

具体地，将盖片添加到24孔板上，并将每孔2.5x10⁴个hela细胞添加到0.5ml含10％fbs的培养基中，并在5％co2和37℃的条件下培养12小时。当细胞稳定后，用pcdna3.4-flag-rab11瞬时转染细胞。为了最大化瞬时转染的效率，使用opti-mem培养基(gibco)。将待瞬时转染的500ngpcdna3.4-flag-rab11与μlopti-mem培养基和2μllipofectamine2000(invitrogen，usa)在室温下在管中孵育20分钟，并然后添加到每个孔中。另外，向每个孔中添加450μl无抗生素的dmem培养基，然后将其在37℃下在5％co2中培养6小时，其后用500μl含10％fbs的dmem培养基替换培养基，随后孵育24小时。接下来，用0.5ml新鲜培养基中的3μmtmab4处理每个孔持续30分钟，并然后用pbs快速洗涤三次，并在37℃下在培养基中孵育0小时、2小时和6小时。此后，去除培养基，并且用pbs洗涤每个孔，并然后用弱酸性溶液(200mm甘氨酸、150mmnaclph2.5)除去附着于表面的蛋白质。在用pbs洗涤之后，将细胞在4％多聚甲醛中于25℃下固定10分钟。

在用pbs洗涤之后，将每个孔与含有0.1％皂苷、0.1％叠氮化钠和1％bsa的pbs缓冲液在25℃下孵育10分钟，以在细胞膜中形成孔。在用pbs洗涤之后，将每个孔与含有2％bsa的pbs缓冲液在25℃下孵育1小时，以消除非特异性结合。然后，用特异性地识别人fc的fitc(绿色荧光)或tritc(红色荧光)标记的抗体(西格玛公司(sigma))对细胞进行染色。将rab5与针对早期内体标记物rab5的抗rab5一起孵育。将每个孔与针对rab11的flag标签的抗flag抗体(循环内体标记物)在25℃下孵育1小时，并然后与tritc(红色荧光)或fitc(绿色荧光)标记的第二抗体在25℃下孵育1小时。为了观察晚期内体和溶酶体，在细胞固定前30分钟用1mm溶酶体红色示踪剂(lysotrackerred)dnd-99处理待培养的细胞。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。结果，表明与tat不同，tmab4位于早期内体中长达2小时，并然后未转运至溶酶体或循环内体中。

实施例3：评估在早期内体中酸化对内体逃逸的影响

为了获得本公开文本的细胞溶质穿透抗体从早期内体逃逸的更清楚的证据，使用抑制剂进行实验。

具体地，所使用的抑制剂是抑制从早期内体到晚期内体的成熟的渥曼青霉素，通过抑制atp酶氢泵阻止内体氧化的巴弗洛霉素、以及抑制从内体到内质网和高尔基体的转运的布雷菲德菌素a。

图2a显示了在存在或不存在其抑制剂的情况下根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体tmab4或细胞穿透肽tat的细胞溶质穿透能力的共聚焦显微镜观察结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。当细胞稳定时，将细胞与100nm渥曼青霉素、200nm巴弗洛霉素和7μm布雷菲德菌素a中的每一种孵育30分钟。接下来，在37℃下将细胞与pbs、2μmtmab4和2μmtat中的每一种孵育6小时。以与实施例2中所述相同的方式用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后进行细胞固定、细胞穿孔和阻断过程。将tmab4处理的细胞用特异性地识别人fc的fitc(绿色荧光)标记的抗体进行染色。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。在tmab4的情况下，仅在巴弗洛霉素处理的细胞中未观察到位于细胞溶质中的绿色荧光，并且出现斑点形状的荧光。

图2b是显示对图2a中所示的共聚焦显微照片的fitc(绿色荧光)荧光定量的结果的条形图。

具体地，使用imagej软件(美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth,usa))，在每种条件下选择20个细胞，并然后以图的形式显示所获得的平均荧光值。

图2c显示了在存在或不存在其抑制剂的情况下使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体tmab4或细胞穿透肽tat的细胞溶质定位的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞，并将其在无血清培养基中与200nm渥曼青霉素、200nm巴弗洛霉素和7μm布雷菲德菌素a中的每一种孵育30分钟。接下来，在37℃下将细胞与pbs、2μmtmab4和20μmtat中的每一种孵育6小时。在4小时之后，将含有pbs或抗体的每个孔用150μm钙黄绿素处理，并在37℃下孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式，用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。

用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。结果，出现绿色钙黄绿素荧光，表明钙黄绿素确实通过本公开文本的细胞溶质穿透抗体tmab4和tat从内体逃逸到细胞溶质中。然而，在tmab4的情况下，与用其他抑制剂处理的细胞不同，仅在巴弗洛霉素处理的细胞中不能观察到位于细胞溶质中的绿色钙黄绿素荧光。

图2d是显示对图2c中所示的共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果的条形图。

具体地，如图2d中所示，使用imagej软件(美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth,usa))，在每种条件下选择20个细胞，并然后以图的形式显示所获得的平均荧光值。

实施例4：评估在早期内体中的hspg降解对内体逃逸的影响

细胞溶质穿透抗体通过与细胞表面上的hspg结合而被内吞。此时，它与原乙酰肝素酶(pro-heparanase)一起被内吞。随着内体酸化原乙酰肝素酶被激活(gingis-velitski等人,2004)。活化的乙酰肝素酶降解hspg，并因此细胞溶质穿透抗体可以自由地定位于细胞溶质中。

图3a显示了为了确认对乙酰肝素酶表达的sirna(短干扰rna)诱导的抑制而进行的蛋白质印迹分析的结果。

具体地，将1x10⁴个hela细胞添加到6孔板的每个孔中，并在1ml含10％fbs的培养基中于37℃下在5％co2中培养12小时。在培养24小时之后，用sirna瞬时转染每个孔。对于瞬时转染，在室温下在管中将500ng的没有靶向能力的对照sirna和靶向抑制乙酰肝素酶表达的sirna中的每一种与500μlopti-mem培养基(gibco)和3.5μllipofectamine2000(invitrogen，usa)一起孵育20分钟，并然后添加到每个孔中。向每个孔中添加500μl不含抗生素的dmem培养基，然后将其在37℃下在5％co2中孵育6小时。接下来，将培养基预先添加1ml含10％fbs的dmem培养基，随后孵育72小时。

在孵育之后，将裂解缓冲液(10mmtris-hclph7.4、100mmnacl、1％sds、1mmedta、抑制剂混合物(西格玛公司))添加到每个孔中至细胞裂解物。使用bca蛋白质测定试剂盒(pierce)对细胞裂解物进行定量。将经过sds-page的凝胶转移到pvdf膜上，与抗体(santacruz)(其分别识别乙酰肝素酶和β-肌动蛋白)一起在25℃下孵育2小时，并然后与hrp缀合的第二抗体(santacruz)一起在25℃下孵育1小时，随后进行检测。使用imagequantlas4000mini(gehealthcare)进行分析。

图3b显示了由对乙酰肝素酶表达的抑制引起的细胞溶质穿透抗体/溶酶体融合的共聚焦显微镜观察的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备具有抑制的乙酰肝素酶表达的hela细胞和对照hela细胞。在37℃下将细胞用3μmtmab4和20μmfitc-tat中的每一种处理30分钟，用pbs快速洗涤三次，并然后在37℃下培养基中孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式，用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后进行细胞固定、细胞穿孔和阻断过程。

将tmab4处理的细胞用特异性地识别人fc的fitc(绿色荧光)标记的抗体进行染色。将细胞与针对溶酶体标记物lamp-1的抗lamp-1(santacruz)在25℃下孵育1小时，并与tritc(红色荧光)标记的第二抗体在25℃下孵育1小时。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。在tmab4的情况下，当乙酰肝素酶表达被抑制时，观察到与lamp-1的融合。

图3c显示了为了确认由对乙酰肝素酶表达的抑制引起的细胞溶质穿透抗体的细胞溶质定位而进行的共聚焦显微镜观察的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备具有抑制的乙酰肝素酶表达的hela细胞和对照hela细胞。在37℃下将细胞用2μmtmab4和20μmfitc-tat中的每一种处理6小时。在4小时之后，将含有pbs或抗体的每个孔用150μm钙黄绿素处理，并在37℃下孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式，用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。在具有抑制的乙酰肝素酶表达的细胞中，不能观察到tmab4定位于细胞溶质的钙黄绿素荧光。

图4是显示范围从根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体的细胞内化到细胞溶质中的抗体定位的整个运输过程的示意图。

实施例5：观察在不同ph下通过细胞膜引入细胞溶质穿透性完整igg形式单克隆抗体

为了使本公开文本的细胞溶质穿透抗体在内吞作用之后定位于细胞溶质中，内体逃逸过程是必需的。至今，还没有关于抗体内体逃逸的报道。为了阐明内体逃逸机制，在模拟的内体ph下进行了一项实验。

早期内体的内部磷脂层的组分类似于细胞膜的外部磷脂层的组分(bissig和gruenberg,2013)，并且磷脂层的主要组分是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)。因此，假设不表达hspg的ramos细胞的膜的外部磷脂层与早期内体的内部磷脂层相同，进行了一项实验。

图5显示了为了检测抗体是否可以根据ph通过细胞膜引入或者抗体是否可以诱导其他物质的细胞膜渗透通过共聚焦显微镜观察ramos细胞中荧光标记的细胞溶质穿透抗体的结果。

具体地，将盖片添加到24孔板上，并添加200μl的0.01％聚-l-赖氨酸溶液以使悬浮的ramos细胞附着到板上，随后在25℃下孵育20分钟。在用pbs洗涤之后，向每个孔中添加5x10⁴个ramos细胞，并在0.5ml含10％fbs的培养基中于37℃下孵育30分钟。在确认细胞粘附之后，在200μlph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4)或ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5)中，将细胞与10μmpbs和直接用荧光试剂dylight-488标记的tmab4、10μm未标记的tmab4和2μm直接用dylight-488标记的对照抗体阿达木单抗中的每一种在37℃下孵育2小时。用作对照抗体的阿达木单抗是靶向细胞外细胞因子的治疗性抗体。

以与实施例2中所述相同的方式，用pbs洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。在ph5.5下，观察到直接用dylight-488标记的tmab4的荧光。在ph5.5下，在用tmab4和直接用dylight-488标记的阿达木单抗处理的细胞中观察到绿色fitc荧光。已证实在酸性ph下通过细胞膜引入细胞溶质穿透抗体并且可以引入其他物质以及其自身。

此外，已证实即使从外部引入了物质，细胞膜的形态也得以维持。

实施例6：检测细胞溶质穿透抗体是否根据ph通过台盼蓝摄取形成孔

在已知的内体逃逸机制中，预期内体穿孔是最有希望的内体逃逸机制，通过该机制，完整igg形式物质可以从内体逃逸，同时维持内体的形态，如实验结果中所示。

与实施例5类似，进行实验以便观察当细胞溶质穿透抗体通过细胞膜时的细胞膜形态。

图6a显示了为了检测细胞溶质穿透抗体是否可以根据ph形成孔并且摄取不具有膜渗透能力的台盼蓝通过光学显微镜观察ramos细胞的结果。

ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4)或ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5)

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将5x10⁴个ramos细胞附着于24孔板的每个孔中。在确认细胞粘附之后，在200μlph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中，将细胞与tmab4以及1μm和10μm阿达木单抗中的每一种在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。

图6b是定量比较已经摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

具体地，对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。

如图6b中所示，仅在ph5.5下，用本公开文本的细胞溶质穿透抗体tmab4处理的细胞以浓度依赖性方式显示台盼蓝摄取。此外，据显示，在细胞溶质穿透抗体通过期间细胞膜的形态得以维持。

实施例7：观察通过细胞溶质穿透抗体的暂时性和可逆性孔形成

在已知通过内体逃逸机制显示出孔形成机制的常规肽的情况下，已知肽的α-螺旋结构形成通过细胞膜的孔。

然而，由于抗体不具有α-螺旋结构，因此通常认为它们几乎不可能形成通过细胞膜的孔。因此，假设在暂时性孔形成之后抗体将从内体逃逸，并然后细胞膜将可逆地恢复。为了证明这一假设，进行了一项实验。

图7a显示了为了确认在ph5.5下由细胞溶质穿透抗体产生的细胞膜孔是否是暂时的和可逆的而进行的光学显微镜观察的结果。

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将5x10⁴个ramos细胞附着于24孔板的每个孔中。在确认细胞粘附之后，将细胞与10μmtmab4在200μlph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5)中于37℃下孵育2小时，以便维持早期内体ph5.5。用新鲜缓冲液替换缓冲液，并将细胞孵育2小时，以便可以回收细胞。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。

图7b是定量比较已经摄取台盼蓝的细胞的数量的图。具体地，对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。如图7b中所示，在ph5.5下，用根据本公开文本的具有内体逃逸能力的tmab4处理的细胞确实在添加tmab4之后立即摄取台盼蓝，但是在培养基中经历恢复的细胞不摄取台盼蓝。换句话说，已证实通过细胞溶质穿透抗体的孔形成是暂时的和可逆的现象。

实施例8：观察在不同ph下细胞溶质穿透完整igg形式单克隆抗体的膜结合和脂质膜触发器

孔形成机制是在维持细胞膜的整体形态的同时形成孔并且物质通过该孔从内体逃逸到细胞溶质中的机制。对于孔形成，已知物质与内体的内部磷脂层相互作用，并然后通过触发器机制形成膜孔(h.d.herce等人,2009)。

因此，为了通过早期内体中的孔形成发生内体逃逸，抗体应首先通过内体酸化与细胞膜结合。为了确认这一点，进行了一项实验。

图8显示了在不同的ph下通过流式细胞术(facs)分析细胞溶质穿透抗体和对照抗体阿达木单抗的细胞膜结合的结果。

具体地，对于每个样品制备1x10⁵个ramos。用pbs洗涤细胞，并然后在ph7.4缓冲液(tbs、2％bsa、50mmhepesph7.4)(用于维持细胞溶质ph7.4)和ph5.5缓冲液(tbs、2％bsa、50mmmesph5.5)(用于维持早期内体ph)中的每一种中将细胞与5μmtmab4和5μm阿达木单抗中的每一种在4℃下孵育1小时。用各ph缓冲液洗涤细胞，并然后将用tmab4或阿达木单抗中的每一种处理的细胞与fitc(绿色荧光)标记的抗体(其特异性地识别人fc)在4℃下孵育30分钟。用pbs洗涤细胞，并然后通过流式细胞术进行分析。结果，表明在ph5.5下仅tmab4确实与细胞膜结合。

图9显示了在不同的ph下通过流式细胞术(facs)分析细胞溶质穿透抗体和对照抗体阿达木单抗的细胞膜触发器诱导能力的结果。

具体地，对于每个样品制备1x10⁵个ramos细胞。用pbs洗涤细胞，并然后在ph7.4缓冲液(tbs、2％bsa、50mmhepesph7.4)(用于维持细胞溶质ph7.4)和ph5.5缓冲液(tbs、2％bsa、50mmmesph5.5)(用于维持早期内体ph5.5)中的每一种中将细胞与5μmtmab4和5μm阿达木单抗中的每一种在4℃下孵育1小时。

用各ph缓冲液洗涤细胞，并然后与fitc(绿色荧光)标记的膜联蛋白-v在25℃下孵育15分钟。膜联蛋白-v是靶向磷脂酰丝氨酸(一种仅存在于细胞膜中的脂质)的物质，并且仅当细胞膜脂质触发器发生时，脂质可以暴露于外部并且膜联蛋白-v可以与其结合。在用pbs洗涤之后，通过流式细胞术分析细胞。结果证实，在ph5.5下膜联蛋白-v确实仅与tmab4结合。

图10是显示基于上述实验预期的细胞溶质穿透抗体的孔形成模型的示意图。

实施例9：预测特性ph依赖性变化的逻辑

为什么根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体根据ph显示出不同的细胞溶质穿透特性的原因被假定为是因为抗体残基之间相互作用的ph依赖性变化导致了特性的变化。

为了证明这一假设，进行了文献检索。结果证实，随着ph从7.4(中性ph)降低至5.0，氨基酸中的天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)通过质子化失去负电荷并变成疏水性的(korte等人,1992)。

具体地，已经变成疏水性的天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)与甲硫氨酸(m)、亮氨酸(l)和异亮氨酸(i)(其最初为疏水性氨基酸)发生疏水相互作用。周围氨基酸通过这种新形成的相互作用诱导结构改变的现象被定义为tanford转变(qin等人,1998)。为了确认这种特性ph依赖性变化，进行了一项实验(dirusso等人,2012)。

在作为细胞溶质穿透轻链可变区的ht4vl结构中，检测了疏水性氨基酸，甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)和亮氨酸(l)，其包围着组氨酸(h)、天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)，其可以在ph7.4与ph5.0之间显示出差异。

在这些氨基酸中，鉴定出两个氨基酸的侧链之间的距离小于的候选氨基酸，并且选择来自n末端的第1个和第95个氨基酸对作为能够显示tanford转变作用的候选氨基酸。

在第1个和第95个氨基酸对中，第95个氨基酸是存在于细胞溶质穿透轻链可变区ht4vl的序列vl-cdr3中的氨基酸。已证实第95个氨基酸可以通过与第1个氨基酸的相互作用通过诸如tanford转变等现象诱导vl-cdr3环结构的变化。

已证实，在细胞溶质穿透轻链可变区ht4vl中，被第1个和第95个氨基酸结构改变的vl-cdr3环的氨基酸包括非常高比例的酪氨酸(y)，其容易与1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)(其是早期内体的内部磷脂层的主要组分)发生相互作用(morita等人,2011)。

图11显示了基于细胞溶质穿透抗体的轻链可变区的wam建模结构来预测细胞溶质穿透抗体的ph依赖性结构变化的结果，并且显示了参与结构变化的氨基酸以及通过结构变化暴露的氨基酸。

为了证实由第1个和第95个氨基酸诱导的特性的ph依赖性变化和由该变化引起的内体逃逸，通过用丙氨酸(a)取代第1个和第95个氨基酸构建了突变体。

此外，为了证实由第1个和第95个氨基酸诱导的特性的ph依赖性变化和由该变化引起的内体逃逸，通过用与其具有相似特性的谷氨酸(e)和亮氨酸取代第1个和第95个氨基酸构建了突变体。

表1显示了使用重叠pcr技术构建的突变体的名称和序列。

[表1]

以与实施例1中所述相同的方式，进行了克隆、在hek293f细胞系中的表达和纯化。

实施例10：观察细胞溶质穿透抗体的特性的ph依赖性变化

图12是定量比较已经通过突变体(tmab4-d1a)、(tmab4-m95a)、(tmab4-d1e)、和(tmab4-m95l)在不同的ph下摄取台盼蓝的细胞的数量的图，这些突变体通过分别用丙氨酸(a)、丙氨酸(a)、谷氨酸(e)和亮氨酸(l)取代轻链可变区(vl)的第1个氨基酸天冬氨酸(d)、第95个氨基酸甲硫氨酸(m)、第1个氨基酸天冬氨酸(a)、和第95个氨基酸甲硫氨酸(m)(它们在酸性ph下参与诱导细胞溶质穿透抗体的结构变化的)。

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将ramos细胞附着于板上。然后，将细胞与10μm的tmab4、阿达木单抗、tmab4-d1a、tmab4-m95a、tmab4-d1e和tmab4-m95l中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4)(用于维持细胞溶质ph7.4)和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5)(用于维持早期内体ph5.5)中的每一种中在37℃下孵育2小时。

在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。

已证实与tmab4不同，突变体tmab4-d1a和tmab4-m95a显示出很少或没有台盼蓝摄取。tmab4-d1e和tmab4-m95l显示出类似于tmab4的台盼蓝摄取。这表明第1个氨基酸和第95个氨基酸在内体逃逸中起着重要作用。

实施例11：研究有助于细胞溶质穿透抗体的内体逃逸能力的氨基酸和基序

通过在上述实施例中获得的实验性实施例，发现抗体特性的ph依赖性变化通过与细胞溶质穿透抗体的第1个和第95个氨基酸的相互作用而发生，并且内体逃逸由特性变化诱导。

为了确认由特性的ph依赖性变化诱导的内体逃逸，通过用丙氨酸(a)取代预期与磷脂发生相互作用的vl-cdr3的氨基酸来构建突变体。

具体地，基于结构建模分析的结果，通过用丙氨酸(a)同时取代最可能暴露于表面的第92个、第93个和第94个氨基酸来构建突变体。

下表2显示了使用重叠pcr技术构建的突变体的名称和序列。

[表2]

以与实施例1中所述相同的方式，进行了克隆、在hek293f细胞系中的表达和纯化。

图13是定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用丙氨酸取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的cdr3的第92个、第93个和第94个氨基酸(其可能参与内体逃逸)来构建。

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将ramos细胞附着于板上。然后，将细胞与缓冲液和10μm的tmab4、tmab4-y91a、tmab4-y92a、tmab4-y93a、tmab4-h94a、tmab4-aaa和tmab4-y96a中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4)(用于维持细胞溶质ph7.4)和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5)(用于维持早期内体ph5.5)中的每一种中在37℃下孵育2小时。

在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。其表明，与tmab4相比，tmab4-y92a、tmab4-y93a和tmab4-h94a显示出显著降低的台盼蓝摄取。特别地，tmab4-aaa显示出很少或没有台盼蓝摄取。然而，tmab4-y91a和tmab4-y96a显示出类似于tmab4的台盼蓝摄取。这表明第92个、第93个和第94个氨基酸极大地促进了内体逃逸。

实施例12：确认细胞溶质穿透抗体轻链可变区(vl)的cdr1和cdr2对内体逃逸的贡献

上述实验性结果证明，轻链可变区(vl)的cdr3参与内体逃逸。然后，为了阐明参与内吞作用的轻链可变区(vl)的cdr1和cdr2对内体逃逸的影响，进行了一项实验。

在人种系序列中，轻链可变区(vl)的cdr1和cdr2被具有相同氨基酸数目或不包括参与内吞作用的cdr1的阳离子小块序列(cationicpatchsequence)的cdr序列取代。此时，已知对现有轻链可变区的稳定性有重要作用的氨基酸是保守的。

下表3显示了使用遗传合成构建的突变体的名称和序列。

[表3]

以与实施例1中所述相同的方式，进行了克隆、在hek293f细胞系中的表达和纯化。

图14a显示了为了分析通过用人种系序列取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的cdr1和cdr2构建的突变体的细胞溶质穿透能力而进行的共聚焦显微镜检查的结果，该cdr1和cdr2与hspg受体结合并参与细胞溶质穿透能力。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。当细胞稳定时，将细胞与pbs和2μmtmab4、tmab4-01、tmab4-02和tmab4-03中的每一种在37℃下孵育6小时。以与实施例2中所述相同的方式用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后进行细胞固定、细胞穿孔和阻断过程。

tmab4用特异性地识别人fc的alexa-488(绿色荧光)标记的抗体进行染色。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。与野生型tmab4相比，所有三种突变体都显示出细胞内荧光减少。特别地，在tmab4-03的情况下，观察到很少或没有观察到细胞内荧光。

图14b显示了定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用人种系序列取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的cdr1和cdr2构建，该cdr1和cdr2与hspg受体结合并参与细胞溶质穿透能力。

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将ramos细胞附着于板上。然后，将细胞与缓冲液和10μm的tmab4、tmab4-01、tmab4-02和tmab4-03中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4)(用于维持细胞溶质ph7.4)和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5)(用于维持早期内体ph5.5)中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。结果，突变体tmab4-01和tmab4-03显示出类似于tmab4的台盼蓝摄取。换句话说，已经证明，在轻链可变区中，涉及内吞作用的区域(vl-cdr1和vl-cdr2)与涉及内体逃逸的区域(vl-cdr3)有区别。

实施例13：细胞溶质穿透抗体的内体逃逸能力改进的逻辑

预期通过与细胞溶质穿透轻链可变区的第1个和第95个氨基酸相互作用引起的vl-cdr3特性的变化，第92个、第93个和第94个氨基酸增加对结合早期内体的内部磷脂膜的溶剂可接近性，这是内体逃逸的早期机制。这些氨基酸分别是酪氨酸(y)、酪氨酸(y)和组氨酸(h)。

这些氨基酸容易与1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)(其是早期内体的内部磷脂层的主要组分)发生相互作用。

为了确认由于ph条件的变化而预期被暴露的三个氨基酸与早期内体的内部磷脂层发生相互作用并参与内体逃逸并增加从内体逃逸的细胞溶质穿透抗体的比例，构建了第92个、第93个和第94个氨基酸的突变体。

对于突变体构建，进行了文献检索，结果，选择了容易与1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)发生相互作用的氨基酸(morita等人,2011)。进行突变体设计使得所选择的氨基酸被引入第92个、第93个和第94个氨基酸中。

具体地，20种不同的氨基酸对1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)的平均结合活性按色氨酸(w)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、半胱氨酸(c)和甲硫氨酸(m)的顺序越来越高。

具体地，20种不同的氨基酸对1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)的亲水性头部的结合活性按精氨酸(r)、色氨酸(w)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、赖氨酸(k)和苯丙氨酸(f)的顺序越来越高。此外，20种不同的氨基酸对1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)的疏水性尾部的结合活性按色氨酸(w)、苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)和酪氨酸(y)的顺序越来越高。

基于这样的结果，证实了色氨酸(w)是最容易与popc发生相互作用的氨基酸，该popc是早期内体的内部磷脂层的主要组分(morita等人,2011)。因此，在本公开文本中，采用了用色氨酸(w)取代一个或两个氨基酸的策略。

下面表4、表5和表6显示了预期改进具有细胞溶质穿透能力的人抗体的内体逃逸能力的所设计的突变体轻链可变区的序列。下面表4显示了根据kabat编号系统的人抗体的轻链可变区的全长序列，并且下面表5和表6显示了表4中所示抗体序列的cdr1和cdr2序列或者cdr3序列。

[表4]

[表5]

[表6]

实施例14：表达和纯化预期具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体并且确认细胞溶质穿透能力的维持

对于预期具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的动物细胞表达，如上文实施例1中所述构建表达轻链的载体。为此，将编码如下轻链的dna(其具有与5'末端融合的分泌信号肽编码dna)通过使用noti/hindiii克隆到pcdna3.4载体(invitrogen)中，该轻链包含细胞溶质穿透轻链可变区(ht4vl)或突变体抗体的轻链可变区(ht4-wwhvl、ht4-wywvl、ht4-ywwvl、ht4-wyhvl、ht4-ywhvl)和轻链恒定区(cl)。

接下来，将编码人源化ht0vh的动物表达载体和编码包含预期具有增加的内体逃逸能力的轻链可变区的轻链的构建的动物表达载体瞬时转染到hek293f蛋白表达细胞中。接下来，以与实施例1中所述相同的方式进行对预期具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的纯化。

图15a显示了在对预期具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体进行纯化之后在还原或非还原条件下的12％sds-page分析的结果。

具体地，在非还原条件下，观察到约150kda的分子量，并且在还原条件下，重链显示出50kda的分子量，并且轻链显示出25kda的分子量。这表明表达和纯化的预期具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体在溶液状态作为单体存在，并且不通过非天然二硫键形成二聚体或寡聚体。

图15b显示了为了检测预期具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的细胞溶质穿透能力是否得以维持而进行的共聚焦显微镜检测的结果。

具体地，以与上文实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。当细胞稳定时，将细胞与pbs和2μmtmab4、tmab4-wwh、tmab4-wyw、tmab4-yww、tmab4-wyh和tmab4-ywh中的每一种在37℃下孵育6小时。

以与实施例2中所述相同的方式用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后进行细胞固定、细胞穿孔和阻断过程。每种抗体用特异性地识别人fc的fitc(绿色荧光)标记的抗体进行染色。发现在所有五种突变体中，细胞溶质穿透能力得以维持。

实施例15：确认预期具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的ph依赖性

图16是定量比较已经通过细胞溶质穿透抗体野生型和预期具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将ramos细胞附着于板上。然后，将细胞与1μmtmab4、阿达木单抗、tmab4-wwh、tmab4-wyw、tmab4-yww、tmab4-wyh和tmab4-ywh中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。在五种突变体中，tmab4-wyw、tmab4-yww、tmab4-wyh和tmab4-ywh显示出增加的台盼蓝摄取，并且在它们中，tmab4-wyw显示出ph依赖性台盼蓝摄取。

选择显示出增加的ph依赖性台盼蓝摄取、同时保留了野生型抗体的细胞溶质穿透能力的tmab4-wyw作为最终克隆。

实施例16：确认具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的细胞溶质定位的改进

图17a显示了使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察细胞溶质穿透抗体野生型和预期具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的细胞溶质定位的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。将细胞与pbs或0.1μm、0.5μm和1μm的tmab4和tmab4-wyw中的每一种在无血清培养基中于37℃下孵育6小时。在4小时之后，将含有pbs或抗体的每个孔用150μm钙黄绿素处理，并在37℃下孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。已证实tmab4-wyw显示出绿色钙黄绿素荧光，即使在比tmab4更低的浓度下也具有更高的强度。

图17b是显示对图17a中所示的共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果的条形图。

具体地，使用imagej软件(美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth,usa))，在每种条件下选择20个细胞，并然后以图的形式显示所获得的平均荧光值。

实施例17：通过增强的分离gfp互补测定确认细胞溶质穿透单克隆抗体的细胞溶质定位

图18是显示当细胞溶质穿透抗体野生型和具有改进的内体逃逸能力的突变体定位于细胞溶质中时观察到通过增强的分离gfp互补(split-gfpcomplementation)产生的gfp荧光的过程的示意图。

具体地，使用增强的分离gfp互补系统来确认细胞溶质穿透抗体将定位于细胞溶质。当绿色荧光蛋白gfp被分离成片段1-10和片段11时，荧光特性被去除，并且当两个片段变得彼此更接近并且彼此组合时，荧光特性可以被恢复(cabantous等人,2005)。

基于该特性，gfp片段1-10在细胞溶质中表达，并且gfp片段11与细胞溶质穿透抗体的c末端融合。此外，对于gfp片段之间的互补，具有高亲和力的链霉亲和素和链霉亲和素结合肽2(sbp2)与gfp片段融合。因此，事实上gfp荧光表明细胞溶质穿透抗体定位于细胞溶质中。

实施例18：表达和纯化与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体

为了在动物细胞中表达与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体，通过三个ggggs接头将gfp11-sbp2遗传融合至重链的c末端。接下来，瞬时共转染编码细胞溶质穿透轻链或具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透轻链的动物表达载体和编码与gfp11-sbp2融合的重链的动物表达载体。接下来，以与实施例1中所述相同的方式进行对与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体的纯化。

图19显示了在对与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体野生型和具有改进的内体逃逸能力的与gfp11-sbp2融合的突变体进行纯化之后在还原或非还原条件下的12％sds-page分析的结果。

具体地，在非还原条件下，观察到约150kda的分子量，并且在还原条件下，重链显示出50kda的分子量，并且轻链显示出25kda的分子量。这表明表达和纯化的与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体在溶液状态作为单体存在，并且不通过非天然二硫键形成二聚体或寡聚体。

实施例19：检测与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体的gfp荧光与细胞溶质定位

图20a显示了为了检测与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体野生型和具有改进的内体逃逸能力的与gfp11-sbp2融合的突变体通过增强的分离gfp互补产生的gfp荧光而进行的共聚焦显微镜检测的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备稳定表达sa-gfp1-10的转化的hela细胞。当细胞稳定时，将细胞与pbs或0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm、1.6μm或3.2μm的tmab4-gfp11-sbp2和tmab4-wyw-gfp11-sbp2中的每一种在37℃下孵育6小时。

以与实施例2中所述相同的方式，用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。观察到tmab4-wyw显示出绿色gfp荧光，其在比tmab4更低的浓度下具有更高的强度。

图20b是显示对图20a中所示的共聚焦显微照片的gfp荧光定量的结果的图。

具体地，使用imagej软件(美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth,usa))，在每种条件下选择20个细胞，并然后以图的形式显示所获得的平均荧光值。

为了定量表达和比较与gfp11-sbp2融合的完整igg形式抗体和具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体的细胞溶质内浓度和内体逃逸效率，进行了一项实验。

下表7显示了与gfp11-sbp2融合的完整igg形式抗体和具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体的细胞溶质内浓度和内体逃逸效率。

[表7]

实施例20：深入分析具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体与脂质之间的相互作用

发现当野生型细胞溶质穿透抗体的轻链可变区cdr3的第92个和第94个氨基酸被色氨酸取代时，内体逃逸能力增加。

为了确定内体逃逸能力的这种增加是否是由于与脂质的任何部分的改进的相互作用，进行了一项实验。色氨酸(w)是容易与脂质的亲水性头部和疏水性尾部两者发生相互作用的氨基酸。当色氨酸被精氨酸(r)(其容易与亲水性头部发生相互作用)、异亮氨酸(i)(其容易与疏水性尾部发生相互作用)或甘氨酸(g)(其与脂质非常弱地发生相互作用)取代并且对活性进行比较时，可以看出与脂质的任何部分的相互作用起着重要作用。

为了深入分析具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体与脂质之间的相互作用，通过用精氨酸(r)、异亮氨酸(i)和甘氨酸(g)中的每一种取代色氨酸来构建突变体。

下表8显示了使用重叠pcr技术构建的突变体的名称和序列。

[表8]

以与实施例1中所述相同的方式，进行了克隆、在hek293f细胞系中的表达和纯化。

实施例21：深入分析细胞溶质穿透抗体与脂质之间的相互作用

图21a是显示为了分析通过用精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸(它们是具有与色氨酸相反特性的氨基酸)取代获得的突变体的细胞膜结合而进行的流式细胞术(facs)的结果的图。

具体地，对于每个孔制备1x10⁵个ramos细胞。用pbs洗涤细胞，并然后与3μmtmab4、tmab4-wyw、tmab4-ryr、tmab4-iyi和tmab4-gyg中的每一种在ph7.4缓冲液(tbs、2％bsa、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(tbs、2％bsa、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在4℃下孵育1小时。在用各ph缓冲液洗涤之后，将tmab4、tmab4-wyw、tmab4-ryr、tmab4-iyi和tmab4-gyg与fitc(绿色荧光)标记的抗体(其特异性地识别人fc)在4℃下孵育30分钟。在用pbs洗涤之后，通过流式细胞术分析细胞，并且结果发现，在ph5.5下仅tmab4确实与细胞膜结合。

图21b是定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸(它们是具有与色氨酸相反特性的氨基酸)取代获得。

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将ramos细胞附着于板上。然后，将细胞与1μmtmab4、tmab4-wyw、tmab4-ryr、tmab4-iyi和tmab4-gyg中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在4℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。结果，与tmab4-wyw相比，tmab4-ryr、tmab4-iyi和tmab4-gyg显示出减少的台盼蓝摄取。

图21c是显示使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察通过用精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸(它们是具有与色氨酸相反特性的氨基酸)取代获得的突变体的细胞溶质定位和对共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果的条形图。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。将细胞与0.5μmtmab4、tmab4-wyw、tmab4-ryr、tmab4-iyi和tmab4-gyg0.5μm中的每一种中在37℃下孵育6小时。在4小时之后，将含有pbs或抗体的每个孔用150μm钙黄绿素处理，并在37℃下孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式，用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。在用tmab4-ryr、tmab4-iyi或tmab4-gyg处理的细胞中，位于细胞溶质中的绿色钙黄绿素荧光弱于用tmab4-wyw处理的细胞中位于细胞溶质中的绿色钙黄绿素荧光。

因此，证实了与脂质的所有亲水性头部和疏水性尾部的相互作用参与内体逃逸，并且为此，用色氨酸取代增加了内体逃逸能力。

实施例22：表达和纯化完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体

具有增加的内体逃逸能力的突变体可以更有效地靶向位于细胞溶质中的蛋白质，因为位于细胞溶质中的抗体的量将增加。

图22a是显示构建完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体的过程的示意图，该抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体用于检测具有改进的内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体突变体的活性。

出于在动物细胞中表达完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体的目的，将编码特异性地结合细胞骨架微管蛋白的包含重链可变区和重链恒定区(ch1-铰链-ch2-ch3)的重链的dna(其具有与5'末端融合的分泌信号肽编码dna)通过使用noti/hindiii克隆到pcdna3.4载体(invitrogen)中(laurence等人,2011)。

接下来，将编码细胞溶质穿透轻链或具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透轻链的动物表达载体、和编码包含特异于微管蛋白的重链可变区的重链的构建的动物表达载体瞬时共转染到hek293f蛋白表达细胞中。接下来，以与实施例1中所述相同的方式进行对完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体的纯化。

图22b显示在对完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体进行纯化之后在还原或非还原条件下的12％sds-page分析的结果。

具体地，在非还原条件下，观察到约150kda的分子量，并且在还原条件下，重链显示出50kda的分子量，并且轻链显示出25kda的分子量。这表明表达和纯化的完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体在溶液状态作为单体存在，并且不通过非天然二硫键形成二聚体或寡聚体。

实施例23：确认完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体的细胞骨架微管蛋白特异性结合

图22c显示了为了检测完整igg形式抗微管蛋白细胞溶质穿透抗体是否与位于细胞溶质中的细胞骨架微管蛋白合并而进行的共聚焦显微镜检测的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。将细胞与pbs或3μmtut4和tut4-wyw中的每一种在500μl含10％fbs的培养基中于37℃下孵育6小时。以与实施例2中所述相同的方式用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后进行细胞固定、细胞穿孔和阻断过程。

将细胞骨架微管蛋白与抗微管蛋白抗体(santacruz)在25℃下孵育1小时，并与tritc(红色荧光)标记的第二抗体在25℃下孵育1小时。每种抗体用特异性地识别人fc的fitc(绿色荧光)标记的抗体进行染色。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。

如图22c中所示，绿色荧光tut4-wyw以纤维状形状与其中定位了红色荧光微管蛋白的细胞溶质部分合并，但tut4未与其合并。

实施例24：表达和纯化完整igg形式ras靶向细胞穿透抗体并且分析k-ras突变体亲和力

为了确认细胞溶质穿透抗体除了细胞骨架微管蛋白以外是否能够有效地靶向其他细胞溶质内蛋白，进行了一项实验。

图23a是显示构建完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体的过程的示意图，该ras靶向细胞溶质穿透抗体用于检测具有改进的内体逃逸能力的突变体的活性。

出于在动物细胞中表达完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体的目的，将编码包含与gtp-结合的k-ras特异性地结合的重链可变区(rt11vh)和重链恒定区(ch1-铰链-ch2-ch3)的重链的dna(其具有与5'末端融合的分泌信号编码dna)通过使用noti/hindiii克隆到pcdna3.4载体(invitrogen)中，如实施例5中所述。

接下来，将编码细胞溶质穿透轻链或具有增加的内体逃逸能力的细胞溶质穿透轻链的动物表达载体、和编码包含与gtp-结合的k-ras特异性地结合的重链可变区的重链的构建的动物表达载体瞬时共转染到hek293f蛋白表达细胞中。接下来，以与上述相同的方式进行对完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体的纯化。

图23b显示在对完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体进行纯化之后在还原或非还原条件下的12％sds-page分析的结果。

具体地，在非还原条件下，观察到约150kda的分子量，并且在还原条件下，重链显示出50kda的分子量，并且轻链显示出25kda的分子量。这表明表达和纯化的完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体在溶液状态作为单体存在，并且不通过非天然二硫键形成二聚体或寡聚体。

图23c显示了为了测量抗体对gppnhp-结合的k-rasg12d和gdp-结合的k-rasg12d(它们为k-ras突变体)的亲和力而进行的酶联免疫吸附测定的结果。

具体地，gtp非常容易水解，并因此难以维持gtp-结合的k-rasg12d的形态。因此，为了使k-ras能够具有活化的结构，如gtp，使用gppnhp(其是不可水解的gtp类似物)构建gtp-结合的k-rasg12d抗原。将作为靶分子的gppnhp-结合的k-rasg12d和gdp-结合的k-rasg12d中的每一种在96孔eia/ria板(costarcorning)中于37℃下孵育1小时，随后用0.1％pbst(0.1％tween20、ph7.4、137mmnacl、12mm磷酸盐、2.7mmkcl)(西格玛公司(sigma))洗涤三次，每次10分钟。将每个孔与5％pbss(5％脱脂乳、ph7.4、137mmnacl、12mm磷酸盐、2.7mmkcl)(西格玛公司)一起孵育1小时，并然后用0.1％pbst洗涤三次，持续10分钟。接下来，将每个孔与igg形式的细胞溶质穿透抗体(tmab4、rt11、和rt11-wyw)中的每一种孵育，并然后用0.1％pbst洗涤三次，持续10分钟。作为标记物抗体，使用山羊碱性磷酸酶缀合的抗人mab(西格玛公司)。用pnpp(对硝基苯基棕榈酸酯)(西格玛公司)处理每个孔，并测量405nm处的吸光度。

分析了对k-ras突变体的亲和力，并且结果表明，野生型rt11与突变体rt11-wyw之间的亲和力有很小差异或没有差异。用作阴性对照的tmab4不结合，并且所有克隆都不结合gdp-结合的k-ras。

实施例25：确认细胞中完整igg形式抗rascytotransmab与gtp-结合的k-ras之间的特异性结合

图24显示了为了检测完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体是否与细胞内h-rasg12v突变体合并而进行的共聚焦显微镜观察的结果。

具体地，将纤连蛋白(西格玛公司)涂覆在24孔板上，并然后向每个孔中添加0.5ml的表达mcherry(红色荧光)h-rasg12v的2x10⁴个nih3t3细胞的稀释液，并在37℃下在5％co2中孵育12小时。接下来，用2μmtmab4、rt11和rt11-wyw中的每一种处理细胞，并在37℃下孵育12小时。接下来，以与实施例中所述相同的方式对细胞进行染色，并用共聚焦显微镜进行观察。

如图24中所示，绿色荧光rt11或rt11-wyw与其中定位了红色荧光活化的ras的内部细胞膜合并，但tmab4未与其合并。

根据上述结果，发现完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体确实特异性地结合细胞中活化的ras。合并的程度以rt11-wyw和rt11的顺序越来越高。

实施例26：分析根据ph诱导结构变化的d1-m95的特性

为了更详细地分析轻链可变区(vl)的第1个氨基酸天冬氨酸(d)和第95个氨基酸甲硫氨酸(m)(其根据ph诱导细胞溶质穿透抗体特性的变化)的特性，通过用种系序列中存在的谷氨酸(e)、丙氨酸(a)和天冬酰胺(n)中的每一种取代抗体骨架中的第1个氨基酸，并且用所有20种氨基酸中的每一种取代cdr3中的第95个氨基酸来构建突变体。

当构建突变体时，第87个氨基酸酪氨酸被苯丙氨酸取代，以便增加被改进的内体逃逸基序降低的蛋白质表达产率。苯丙氨酸是可以容易地与位于重链可变区骨架中的芳香族环氨基酸和疏水性氨基酸发生相互作用的一种氨基酸，从而增强轻链可变区与重链可变区之间的界面。其中第87个氨基酸被苯丙氨酸取代并且在第92个、第93个和第94个氨基酸处具有改进的内体逃逸基序wyw的轻链可变区被命名为“ht4-3”。因此，将包含轻链可变区的细胞溶质穿透完整igg形式抗体命名为“tmab4-3”。

以与实施例1中所述相同的方式，将每种突变体进行克隆，在hek293f细胞系中表达，并纯化。

图25b是显示定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞数量的结果的图，该突变体通过用各种氨基酸取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的第95个氨基酸甲硫氨酸构建，该第95个氨基酸甲硫氨酸在酸性ph5.5下诱导细胞溶质穿透抗体的结构变化。

具体地，孵育不表达hspg受体的1x10⁴个贴壁细胞(pgsd-677)。在第二天，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与1μmtmab4-3、tmab4-3d1a、tmab4-3d1e和tmab4-3d1n中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4)(用于维持细胞溶质ph)和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5)(用于维持早期内体ph)中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。

结果，tmab4-3d1e显示出类似于野生型的台盼蓝摄取，并且tmab4-3d1a和tmab4-3d1n突变体显示出减少的台盼蓝摄取。

图25b是显示定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞数量的结果的图，该突变体通过用各种氨基酸取代细胞溶质穿透抗体的轻链可变区(vl)的第95个氨基酸甲硫氨酸构建，该第95个氨基酸甲硫氨酸在酸性ph5.5下诱导细胞溶质穿透抗体的结构变化。

具体地，以与实施例26中所述相同的方式制备pgsd-677细胞。然后，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与1μmtmab4-3和十九种tmab4-3突变体中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。

将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。结果，tmab4-3m95l、m95i和m95h显示出类似于tmab4-3的台盼蓝摄取，并且tmab4-3m95a、m95s、m95v、m95g和m95p突变体显示出减少的台盼蓝摄取。此外，tmab4-3m59d和m59e显示出增加的ph依赖性台盼蓝摄取，但是tmab4-3m95k和m95r突变体在中性ph下显示出增加的台盼蓝摄取。

因此，发现在具有长侧链的疏水性氨基酸、带负电荷的氨基酸和组氨酸(h)之间的相互作用对于在酸性ph下诱导结构变化是最有效的。

当轻链可变区的第95个氨基酸由疏水性氨基酸甲硫氨酸(m)、异亮氨酸(i)或亮氨酸(l)、或者带负电荷的氨基酸天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)构成时，预计带负电荷的氨基酸的侧链中的羧酸将通过部分质子化变成疏水性的，并因此第95个氨基酸将与天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)(其是轻链可变区或重链可变区的第1个氨基酸)发生疏水相互作用(duz等人,2011；dirusso等人,2012)。

此外，当轻链可变区的第95个氨基酸由组氨酸(h)构成时，预计随着ph从7.4变化到5.5，氨基酸侧链的净电荷将变成阳性的，并且第95个氨基酸将通过与天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)(其是轻链可变区或重链可变区的第1个氨基酸)的静电相互作用诱导内体逃逸。

实施例27：设计引入了“响应于ph诱导特性变化”的氨基酸的突变体

除了d1-m95以外，诸位发明人已经尝试引入能够通过根据ph改变它们的相互作用来诱导内体逃逸的氨基酸。

基于结构建模分析的结果，选择能够与第1个氨基酸天冬氨酸(d)发生相互作用的第90个和第91个氨基酸作为可能的候选物。为了使得能够在酸性ph条件下发生相互作用，第90个氨基酸被组氨酸替换(tmab4-3q90h)，并且第91个氨基酸被组氨酸取代(tmab4-3y91h)。

此外，能够另外与第2个疏水性氨基酸发生相互作用的第91个氨基酸被天冬氨酸取代(tmab4-3y91d)。

此外，第2个氨基酸也被带负电荷的谷氨酸(e)取代使得它可以与第1个带负电荷的氨基酸发生相互作用，并且第90个氨基酸被亮氨酸(l)取代(tmab4-3l2eq90l)使得它可以与第95个疏水性氨基酸发生相互作用。此外，第2个氨基酸也被谷氨酸(e)取代使得它可以与第1个带负电荷的氨基酸发生相互作用，并且第97个氨基酸被异亮氨酸(i)取代(tmab4-3l2et97i)使得它可以与第95个疏水性氨基酸发生相互作用。

下表9显示了使用重叠pcr技术构建的突变体的名称和序列。

[表9]

以与实施例1中所述相同的方式，将每种突变体进行克隆，在hek293f细胞系中表达，并纯化。

实施例28：确认引入了“响应于ph诱导特性变化”的氨基酸的突变体的内体逃逸能力的改进

图26a显示了如下图，该图显示定量比较已经通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量，该突变体出于“响应于ph诱导另外的特性变化”的目的而设计。

具体地，以与实施例26中所述相同的方式制备细胞。然后，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与0.5μm或1μm的七种突变体(包括tmab4-3、tmab4-3d1e-m95l等)中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。

结果，tmab4-3q90h突变体在0.5μm下显示出比tmab4-3更高的台盼蓝摄取。另外，使用显示出与野生型显著差异的tmab4-3q90h突变体，进行了一项实验。

图26b显示了如下条形图，该条形图显示使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察出于响应于ph诱导另外的特性变化的目的而设计的突变体的细胞溶质定位和对共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞，并且将细胞与0.5μm和1μm的tmab4-3和tmab4-3q90h中的每一种在37℃下孵育6小时。在4小时之后，将含有pbs或抗体的每个孔用150μm钙黄绿素处理，并在37℃下孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。

结果，与用tmab4-3处理的细胞相比，在用tmab4-3q90h处理的细胞中位于细胞溶质中的绿色钙黄绿素荧光增加了。因此，证实了除了细胞溶质穿透抗体的轻链可变区的第95个氨基酸以外，第90个氨基酸与第1个氨基酸发生相互作用并且通过相互作用的ph依赖性变化诱导内体逃逸。

下表10显示了通过根据ph诱导另外的特性变化而具有增加的从内体逃逸的能力的突变体的轻链可变区的cdr3序列。

[表10]

实施例29：研究在轻链可变区的不同cdr3长度下的内体逃逸能力

85％或更多的轻链可变区cdr3由9个氨基酸组成。取决于氨基酸的数量和组成，cdr3环结构改变。在本公开文本中，为了分析内体逃逸能力如何取决于氨基酸的数量和组成而改变，构建了包含由8个、10个或11个氨基酸组成的cdr3的突变体。

下表11显示了使用重叠pcr技术构建的突变体的名称和序列。

[表11]

以与实施例1中所述相同的方式，将每种突变体进行克隆，在hek293f细胞系中表达，并纯化。

图27是定量比较通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过改变细胞溶质穿透抗体的轻链可变区的cdr3的氨基酸数量而获得。

具体地，以与实施例26中所述相同的方式制备细胞。然后，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与1μm的七种突变体(包括tmab4-3、tmab4-3l8-1等)中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。

结果，与tmab4-3相比，随着氨基酸的数量增加，突变体在中性ph下显示出增加的台盼蓝摄取。认为原因如下。随着氨基酸的数量增加，整个cdr3环结构被拉伸，并且与细胞膜结合以便从内体逃逸的内体逃逸基序wyw暴露于外部，并因此即使在中性ph下台盼蓝摄取也增加。

此外，在实验结果中，已证实即使当第95个氨基酸(其通过相互作用的ph依赖性变化诱导内体逃逸)与第92个、第93个或第94个氨基酸(其通过与磷脂结合影响内体逃逸)之间的距离增加时，内体逃逸基序的特性也得以维持。

实施例30：向常规治疗性抗体的轻链可变区赋予改进的内体逃逸基序的可能性的逻辑

目前可商购的治疗性抗体包括许多种靶向细胞表面受体(特别是经历内吞作用的细胞表面受体)的单克隆抗体。然而，这些常规抗体的缺点在于在内吞作用之后它们与抗原的结合不破坏，并且这些抗体不位于细胞溶质中且由于它们没有内体逃逸能力而从细胞中释放出来。因此，如果可以将内体逃逸能力赋予经历内吞作用的这些受体靶向抗体，则优点在于这些抗体可以用于更广泛的应用中。

此外，使用可商购治疗性抗体的稳定骨架可以增加总体表达产率，并且当这些抗体对非肿瘤特异性受体hspg的亲和力被消除时，可以将肿瘤组织特异性赋予这些抗体。

为了赋予改进的内体逃逸基序，将经历内吞作用的受体靶向抗体的轻链可变区的序列与细胞溶质穿透抗体的轻链可变区的序列进行比较。结果，选择候选轻链可变区，其具有带负电荷的氨基酸作为第1个氨基酸并且其中可以影响cdr3环结构的骨架氨基酸与细胞溶质穿透抗体的那些相同。

通过用细胞溶质穿透抗体的cdr3序列取代候选轻链可变区的cdr3序列来构建突变体。

表12显示了使用基因合成技术构建的突变体的名称和序列。

[表12]

图28a显示了构建完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的轻链可变区中)的过程。

如图28a中所示，以与实施例1中所述相同的方式，进行轻链可变区的克隆，并且将所得的动物表达载体和编码包含与gtp-结合的k-ras特异性地结合的重链可变区的重链的动物表达载体瞬时共转染到hek293f蛋白表达细胞中。接下来，以与实施例1中所述相同的方式进行对所得的完整igg形式抗rascytotransmab的纯化。

实施例31：确认向常规治疗性抗体的轻链可变区赋予改进的内体逃逸基序的可能性

图28b显示了为了检测完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的轻链可变区中)的hspg结合亲和力和细胞溶质穿透能力是否将被减少或消除而进行的荧光显微镜观察的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。当细胞稳定时，将细胞与pbs或1μmrt11-3、rt11-neci-wyw、rt11-nimo-wyw、rt11-pani-wyw、rt11-pert-wyw、rt11-lumr-wyw和rt11-emib-wyw中的每一种在37℃下孵育6小时。

以与实施例2中所述相同的方式用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后进行细胞固定、细胞穿孔和阻断过程。每种抗体用特异性地识别人fc的fitc(绿色荧光)标记的抗体进行染色。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。结果，在包含赋予了改进的内体逃逸基序的单克隆抗体骨架的所有六种完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体中，未观察到荧光。

图28c显示了定量比较通过完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的轻链可变区中)在酸性ph下摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将ramos细胞附着于板上。然后，将细胞与1μmrt11-3、rt11-neci-wyw、rt11-nimo-wyw、rt11-pani-wyw、rt11-pert-wyw、rt11-lumr-wyw、和rt11-emib-wyw中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。

对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。结果，除了rt11-pert以外，包含赋予了改进的内体逃逸基序的治疗性抗体骨架的五种完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体显示出类似于rt11-3的台盼蓝摄取。

实施例32：确认完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(包含赋予了改进的内体逃逸基序的治疗性抗体骨架)与gtp-结合的k-ras之间的特异性结合的维持

图29a显示了为了测量完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的轻链可变区中)对gppnhp-结合的k-rasg12d和gdp-结合的k-rasg12d(它们是k-ras突变体)的亲和力而进行的elisa的结果。

具体地，将作为靶分子的gppnhp-结合的k-rasg12d和gdp-结合的k-rasg12d中的每一种在96孔eia/ria板(costarcorning)中于37℃下孵育1小时，随后用0.1％pbst(0.1％tween20、ph7.4、137mmnacl、12mm磷酸盐、2.7mmkcl)(西格玛公司(sigma))洗涤三次，持续10分钟。将每个孔与5％pbss(5％脱脂乳、ph7.4、137mmnacl、12mm磷酸盐、2.7mmkcl)(西格玛公司)一起孵育1小时，并然后用0.1％pbst洗涤三次，持续10分钟。接下来，将每个孔与igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(rt11-3、rt11-neci-wyw、rt11-nimo-wyw、rt11-pani-wyw、rt11-pert-wyw、rt11-lumr-wyw、rt11-emib-wyw)中的每一种孵育，并然后用0.1％pbst洗涤三次，持续10分钟。作为标记物抗体，使用山羊碱性磷酸酶缀合的抗人mab(西格玛公司)。用pnpp(对硝基苯基棕榈酸酯)(西格玛公司)处理每个孔，并测量405nm处的吸光度。

分析了对k-ras突变体的亲和力。结果，除了rt11-nimo以外，包含赋予了改进的内体逃逸基序的治疗性抗体骨架的五种完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体在亲和力方面显示出与rt11-3没有差异，并且所有克隆不与用作阴性对照的gdp-结合的k-ras结合。

图29b显示了如下示意图，该示意图显示构建完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的与rgd10肽融合的轻链可变区中)的过程。

因为赋予了改进的内体逃逸基序的完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体没有显示出细胞穿透能力，所以对在新生血管细胞和各种肿瘤中过表达的整联蛋白αvβ3特异的rgd10肽通过两个ggggs接头与轻链的n末端进行基因融合。rgd10肽具有与rgd4c肽类似的亲和力，但是其特征在于它具有由两个半胱氨酸残基形成的单个二硫键并且可以是基因融合的。

此外，基于对表达产率、内体逃逸能力和对ras的亲和力的分析的结果，将rgd10肽融合至rt11-pani-wyw和rt11-neci-wyw(其是优秀的候选抗体)中的每一种的轻链可变区的n末端。

图29c显示了为了检测完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体(其中改进的内体逃逸基序被引入常规治疗性抗体的与rgd10肽融合的轻链可变区中)是否将与细胞内活化的h-rasg12v突变体合并而进行的共聚焦显微镜检测的结果。

具体地，将0.5ml的2x10⁴个具有k-rasg12v突变的人结肠直肠癌sw480细胞的稀释液添加到24孔板的每个孔中，并与1μmrt11-i3、rt11-i-neci-wyw和rt11-i-pani-wyw中的每一种在37℃下在5％co2中孵育12小时。接下来，以与实施例2中所述相同的方式，进行抗体标记和细胞核染色，并且将细胞用ras标记的抗体在37℃下处理1小时。然后，细胞是第二抗体，并用共聚焦显微镜进行观察。

绿色荧光rt11-i3、rt11-i-neci-wyw和rt11-i-pani-wyw与其中定位红色荧光活化的ras的内部细胞膜合并。

上述实验结果表明，引入了改进的内体逃逸基序的完整igg形式ras靶向细胞溶质穿透抗体与细胞中活化的ras特异性结合。

实施例33：将改进的内体逃逸基序赋予重链可变区cdr的可能性的逻辑

重链可变区和轻链可变区在结构上是共同的，因为它们具有β-折叠结构作为骨架并且由三个具有环结构的cdr构成。因此，认为通过相互作用的ph依赖性变化诱导内体逃逸的轻链可变区的内体逃逸基序也可以应用于重链可变区。

该现象在重链可变区中是否可再现通过重链可变区的序列和三维结构进行了分析。结果，可以将内体逃逸基序以可以与重链可变区的第1个氨基酸谷氨酸(e)发生相互作用的距离移植到cdr3中。

野生型重链可变区的cdr3中的氨基酸数量为11，并且cdr3的环结构中心显著地暴露于表面。为此，认为在轻链可变区中发生的ph依赖性现象几乎不发生。为此，将cdr3的氨基酸数量减少到7或8，同时维持一部分的序列。

此外，认为能够在早期内体ph下与重链可变区的第1个氨基酸发生相互作用的氨基酸是重链可变区的第102个氨基酸，并且该氨基酸位于合适的距离。因此，该氨基酸被亮氨酸(l)取代。

通过将改进的内体逃逸基序引入重链可变区的cdr3中来构建突变体。

表13、表14和表15显示了通过将设计的内体逃逸基序移植到重链可变区中获得的重链可变区序列。下面表13显示了根据kabat编号系统的人抗体轻链可变区的全长序列，并且下面表14和表15显示了表13中所示抗体序列的cdr1和cdr2序列或者cdr3序列。

[表13]

[表14]

[表15]

图30a显示了构建具有去除了内体逃逸能力的轻链可变区和引入了改进的内体逃逸基序的重链可变区的细胞溶质穿透抗体的过程。

为了评估引入了改进的内体逃逸基序的重链可变区的内体逃逸能力，用aaa(三个连续的丙氨酸)取代参与内体逃逸的轻链可变区的第92个至第94个氨基酸(wyw)，从而消除其功能。以与实施例1中所述相同的方式，进行重链可变区的克隆，并将所得的重链连同包含已经去除内体逃逸基序的轻链可变区的轻链一起在hek293f细胞系中表达并纯化。

为了更清楚地命名包含引入了改进的内体逃逸基序的重链可变区的细胞溶质穿透抗体，将tmab4缩写为ct。换句话说，tmab4-aaa是ct-aaa。

实施例34：确认将改进的内体逃逸基序赋予重链可变区cdr的可能性

图30b显示了定量比较已经通过具有已经去除内体逃逸能力的轻链可变区和已经引入改进的内体逃逸基序的重链可变区的细胞溶质穿透抗体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

具体地，如图30b中所示，以与实施例5中所述相同的方式将ramos细胞附着于板上。然后，将细胞与1μmtmab4-wyw、tmab4-aaa、ct01-aaa、ct02-aaa、ct03-aaa和ct04-aaa中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。观察到ct01-aaa、ct02-aaa、ct03-aaa和ct04-aaa全部都显示出等于tmab4-3的约一半的台盼蓝摄取。然而，其表明ct04-aaa突变体即使在中性ph下也显示出台盼蓝摄取。

图30c显示了为了观察具有已经去除内体逃逸能力的轻链可变区和已经引入改进的内体逃逸基序的重链可变区的与gfp11-sbp2融合的细胞溶质穿透抗体通过增强的分离gfp互补产生的gfp荧光而进行的共聚焦显微镜检查的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备稳定表达sa-gfp1-10的转化的hela细胞。当细胞稳定时，将细胞与pbs和1.6μmct01-aaa-gfp11-sbp2、ct02-aaa-gfp11-sbp2、ct03-aaa-gfp11-sbp2和ct04-aaa-gfp11-sbp2中的每一种在37℃下孵育6小时。以与实施例2中所述相同的方式用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。结果，在具有ct01-aaa-gfp11-sbp2、ct02-aaa-gfp11-sbp2、ct03-aaa-gfp11-sbp2或ct04-aaa-gfp11-sbp2的细胞中观察到绿色荧光。

图30d显示了为了观察具有已经去除内体逃逸能力的轻链可变区和已经引入改进的内体逃逸基序的重链可变区的细胞溶质穿透抗体的细胞溶质定位而使用钙黄绿素进行的共聚焦显微镜检查的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。将细胞与0.2μm和1μmct01-aaa、ct02-aaa和ct03-aaa中的每一种在37℃下孵育6小时。在4小时之后，将含有pbs或抗体的每个孔用150μm钙黄绿素处理，并在37℃下孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式，用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。在用ct01-aaa或ct02-aaa处理的细胞中，位于细胞溶质中的绿色钙黄绿素荧光与用tmab4处理的细胞中的绿色钙黄绿素荧光相似。然而，在用ct03-aaa处理的细胞中，位于细胞溶质中的绿色钙黄绿素荧光弱于用ct处理的细胞中的绿色钙黄绿素荧光。

因此，证实了即使当将改进的内体逃逸基序赋予重链可变区时，抗体也可以从内体逃逸并最终定位于细胞溶质中。

实施例35：分析根据ph诱导结构变化的重链可变区e1-l102的特性

为了更详细地分析重链可变区的第1个氨基酸谷氨酸和第102个氨基酸亮氨酸(其根据ph诱导结构变化)，通过用在种系序列中存在的天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺中的每一种取代抗体骨架中的第1个氨基酸并且用轻链可变区的12个氨基酸中的每一个取代cdr3中的第102个氨基酸来构建突变体，该突变体在中性或酸性ph下显示出台盼蓝摄取。以与实施例中所述相同的方式，将每种突变体进行克隆，在hek293f细胞系中表达，并纯化。

图31a是定量比较通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用各种氨基酸取代细胞溶质穿透抗体的重链可变区(vh)的第1个氨基酸谷氨酸构建，该第1个氨基酸谷氨酸参与在酸性ph5.5下诱导抗体特性的结构变化。

具体地，以与实施例26中所述相同的方式将1x10⁴个pgsd-677细胞在24孔板中孵育。在第二天，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与1μmct01-aaa、ct01-aaae1a、ct01-aaae1d和ct01-aaae1q中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。结果，ct01-aaae1d显示出类似于野生型的台盼蓝摄取，并且ct01-aaae1a和ct01-aaae1q突变体显示出与野生型相比减少的台盼蓝摄取。

图31a是定量比较通过突变体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该突变体通过用各种氨基酸取代细胞溶质穿透抗体的重链可变区(vh)的第102个氨基酸亮氨酸构建，该第102个氨基酸亮氨酸参与在酸性ph5.5下诱导抗体的结构变化。

具体地，以与实施例26中所述相同的方式制备pgsd-677细胞。然后，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与1μm的ct01-aaa和十九种ct01-aaal102x突变体中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。结果，与ct01-aaa相比，ct01-aaal102i、l102m、和l102h显示出类似于野生型的台盼蓝摄取，并且ct01-aaal102k和l102r突变体在中性ph下显示出增加的台盼蓝摄取。

这表明具有长侧链的疏水性氨基酸、带负电荷的氨基酸和组氨酸(h)之间的相互作用是最有效的，因此与轻链可变区的第95个氨基酸一样，重链可变区的第102个氨基酸在早期内体ph5.5下通过相互作用的变化诱导内体逃逸。

实施例36：构建具有三个色氨酸残基的内体逃逸基序突变体

为了改进具有两个色氨酸残基的内体逃逸基序的内体逃逸能力，通过用色氨酸取代第92个至第94个氨基酸构建具有总共三个色氨酸残基的内体逃逸基序。

表16和表17显示了通过引入具有三个色氨酸残基的内体逃逸基序获得的轻链可变区突变体序列。具体地，下表16显示了根据kabat编号系统的人抗体轻链可变区的全长序列，并且下表17显示了表16中所示的抗体序列的cdr3序列。

[表16]

[表17]

表18和表19显示了通过引入具有三个色氨酸残基的内体逃逸基序获得的重链可变区突变体序列。具体地，下表18显示了根据kabat编号系统的人抗体轻链可变区的全长序列，并且下表19显示了表18中所示的抗体序列的cdr3序列。

[表18]

[表19]

为了评估重链可变区或包含具有三个色氨酸残基的内体逃逸基序的重链可变区的内体逃逸能力，这种重链可变区或重链可变区以及不包含内体逃逸基序的重链可变区或轻链可变区以与实施例1中所述相同的方式在hek293f细胞系中一起表达，并纯化。

实施例37：确认完整igg形式细胞溶质穿透抗体(包含引入了内体逃逸基序的重链可变区或轻链可变区，该内体逃逸基序具有两个或三个色氨酸残基)的内体逃逸能力的改进

作为用于改进内体逃逸能力的一种策略，将内体逃逸基序赋予重链可变区和轻链可变区两者。因此，单个完整igg形式细胞溶质穿透抗体包括总共四个内体逃逸基序。

将包含具有两个或三个色氨酸基序的内体逃逸基序的重链可变区和轻链可变区以与上述文实施例1中所述相同的方式一起在hek293f细胞系中表达，并纯化。

图32a显示了定量比较已经通过完整igg形式细胞溶质穿透抗体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该完整igg形式细胞溶质穿透抗体具有引入了含有三个色氨酸残基的内体逃逸基序的轻链可变区和/或重链可变区。

具体地，以与实施例26中所述相同的方式制备pgsd-677细胞。然后，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与0.5μm或1μm的ct-3、ct-3_www、ct01-aaa、ct01_www-aaa、和ct01-3、和ct01_www-3_www中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。

结果，与包含现有内体逃逸基序的ct-3、ct01-aaa和ct01-3相比，ct-3_www、ct01_www-aaa和ct01_www-3_www显示出显著增加的台盼蓝摄取。此外，与ct-3和ct01-aaa相比，在重链可变区和轻链可变区两者中都包含内体逃逸基序的ct01-3和ct01_www-3_www显示出更高的台盼蓝摄取。

图32b显示了如下条形图，该条形图显示使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察完整igg形式细胞溶质穿透抗体的细胞溶质定位和对共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果，该完整igg形式细胞溶质穿透抗体具有引入了含有三个色氨酸残基的内体逃逸基序的轻链可变区和/或重链可变区。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备hela细胞。将细胞与0.25μm、0.5μm和1μm的ct-3、ct-3_www、ct01-aaa、ct01_www-aaa、ct01-3、和ct01_www-3_www中的每一种在37℃下孵育6小时。在4小时之后，将含有pbs或抗体的每个孔用150μm钙黄绿素处理，并在37℃下孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式，将细胞用pbs和弱酸性溶液洗涤，并固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。

结果，与用包含现有内体逃逸基序的ct-3、ct01-aaa或ct01-3处理的细胞相比，用ct-3_www、ct01_www-aaa或ct01_www-3_www处理的细胞显示出位于细胞溶质中的更强的绿色钙黄绿素荧光。此外，与用ct-3或ct01-aaa处理的细胞相比，用在重链可变区和轻链可变区两者中都包含内体逃逸基序的ct01-3或ct01_www-3_www处理的细胞显示出位于细胞溶质中的更强的绿色钙黄绿素荧光。

已证实，与现有的内体逃逸基序相比，具有三个色氨酸基序的内体逃逸基序具有改进的内体逃逸基序，并且即使当将内体逃逸基序赋予重链可变区和轻链可变区时，内体逃逸能力也得到改进。

实施例38：确认完整igg形式细胞溶质穿透抗体(包含引入了改进的内体逃逸基序的重链可变区和具有治疗性抗体骨架(赋予了改进的内体逃逸能力)的轻链可变区)的内体逃逸能力的改进

为了确认当将内体逃逸基序赋予重链可变区和轻链可变区两者时内体逃逸能力得到改进，将引入了改进的内体逃逸基序的重链可变区和具有治疗性抗体骨架(赋予了内体逃逸能力)的轻链可变区在hek293f细胞系中一起表达并纯化。

具体地，包含引入了改进的内体逃逸基序的重链可变区和赋予了改进的内体能力的轻链可变区的完整igg形式细胞溶质穿透抗体没有显示出细胞穿透能力。为此，将在各种肿瘤(包括结肠直肠癌)的细胞膜表面上过表达的对epcam特异的epcam靶向环肽通过两个ggggs接头与抗体的n末端进行基因融合，使得该抗体可以穿透细胞(us2015/0246945a1)。

图33a显示了如下示意图，该示意图显示构建完整igg形式细胞溶质穿透抗体(其中已经在其重链可变区中引入改进的内体逃逸基序并且已经在与epcam靶向肽融合的常规治疗性抗体的轻链可变区中引入改进的内体逃逸基序)的过程。

具体地，以与实施例1中所述相同的方式，将编码包含引入了改进的内体逃逸基序的重链可变区的重链和包含赋予了改进的内体能力的单克隆抗体轻链可变区的轻链的动物表达载体瞬时共转染到hek293f蛋白表达细胞中。接下来，以与实施例1中所述相同的方式进行对完整igg形式细胞溶质穿透抗体的纯化。

图33b显示如下条形图，该条形图显示使用钙黄绿素通过共聚焦显微镜观察完整igg形式细胞溶质穿透抗体(其中已经在其重链可变区中引入改进的内体逃逸基序并且已经在与epcam靶向肽融合的常规治疗性抗体的轻链可变区中引入改进的内体逃逸基序)的细胞溶质定位和对共聚焦显微照片的钙黄绿素荧光定量的结果。

具体地，以与实施例2中所述相同的方式制备具有k-rasg13d突变的人结肠直肠癌hct116细胞。将细胞与0.1μm、0.25μm和0.5μm的ct-ep41和ct01-ep41中的每一种在37℃下孵育6小时。在4小时之后，将含有pbs或抗体的每个孔用150μm钙黄绿素处理，并在37℃下孵育2小时。以与实施例2中所述相同的方式，用pbs和弱酸性溶液洗涤细胞，并然后固定。用hoechst33342对细胞核进行蓝染色，并用共聚焦显微镜进行观察。在用不同浓度的ct01-ep41处理的细胞中，位于细胞溶质中的绿色钙黄绿素荧光强度强于用ct-ep41处理的细胞的绿色钙黄绿素荧光强度。

图33c显示了定量比较已经通过完整igg形式细胞溶质穿透抗体(其中已经在其重链可变区中引入改进的内体逃逸基序并且已经在与epcam靶向肽融合的常规治疗性抗体的轻链可变区中引入改进的内体逃逸基序)根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

具体地，以与实施例5中所述相同的方式将ramos细胞附着于板上。然后，将细胞与1μmct-ep41和ct01-ep410.5中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4)(用于维持细胞溶质ph7.4)和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5)(用于维持早期内体ph5.5)中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。对显示台盼蓝摄取的细胞数量进行计数，并将其表示为相对于细胞总数量的百分比。对总共400个或更多个细胞进行了计数，并以图的形式显示平均值。结果，与ct-ep41相比，ct01-ep41显示出台盼蓝摄取的浓度依赖性增加。

因此，证实了当将内体逃逸基序引入重链可变区和轻链可变区中的每一者中时，与当仅在轻链可变区中存在内体逃逸基序时相比，内体逃逸能力得到改进。

实施例39：向常规治疗性抗体的重链可变区赋予改进的内体逃逸基序的可能性的逻辑

类似于将内体逃逸基序赋予常规治疗性抗体的轻链可变区的逻辑，可以预期使用可商购治疗性抗体的稳定骨架来增加总体表达产率。为了检测内体逃逸基序是否可以作为单一基序运作，还将内体逃逸基序赋予常规治疗性抗体的重链可变区。

通过用细胞溶质穿透抗体的cdr3取代候选重链可变区的cdr3来构建突变体。

下表20显示了使用基因合成技术构建的突变体的名称和序列。

[表20]

图34a是显示构建其中已经将改进的内体逃逸基序引入常规治疗性抗体的重链可变区中的完整igg形式细胞溶质穿透抗体的过程的示意图。

以与实施例1中所述相同的方式，进行重链可变区的克隆，并且将包含引入了改进的内体逃逸基序的单克隆抗体轻链可变区的所得的重链和轻链一起在hek293f细胞系中表达并纯化。

实施例40：确认向单克隆抗体的重链可变区赋予改进的内体逃逸基序的可能性

图34b是定量比较已经通过完整igg形式细胞溶质穿透抗体(其中已经将改进的内体逃逸基序引入常规治疗性抗体的重链可变区中)根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图。

具体地，以与实施例26中所述相同的方式制备pgsd-677细胞。然后，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与0.5μm或1μm的ct-3、ct-3_www、ct01-aaa、ct01_www-aaa、和ct01-3、和ct01_www-3_www中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。所有突变体均显示出类似于ct01-ep41的台盼蓝摄取。

实施例41：构建引入了天冬氨酸的重链可变区和轻链可变区用于改进细胞溶质穿透抗体的特性

为了改进细胞溶质穿透抗体的内体逃逸能力，将内体逃逸基序引入重链可变区和轻链可变区中每一者的crd3中。由于内体逃逸基序的疏水性氨基酸(色氨酸(w)和酪氨酸(y))，细胞溶质穿透抗体变成疏水性的。为了抵消这种疏水性，通过用带负电荷的天冬氨酸取代与内体逃逸基序相邻的氨基酸来构建突变体。参考一些研究来构建突变体，这些研究中将天冬氨酸引入抗体可变区的骨架和cdr区中以增加抗体的总体稳定性并减少由抗体的高疏水性引起的蛋白质聚集(perchiacca等人,2011；dudgeon等人,2012)。

由于重链可变区的第32个、第33个和第58个氨基酸与重链可变区和轻链可变区中每一者的内体逃逸基序相邻，因此这些氨基酸被天冬氨酸取代。将所得的氨基酸命名为ct11vh(f32d、s33d)或ct12vh(f32d、s33d、y58d)。

由于轻链可变区的第27b个、第50个和第51个氨基酸与重链可变区和轻链可变区中每一者的内体逃逸基序相邻，因此这些氨基酸被天冬氨酸取代。将所得的氨基酸命名为ht4-60vl(l27bd)、ht4-61vl(w50d)、ht4-62vl(w50d、a51d)或ht4-63vl(l27bd、w50d、a51d)。

此处，用作突变体模板的重链可变区和轻链可变区是引入了内体逃逸基序同时在动物细胞表达系统中显示高产率的抗体可变区，并且这些区域被分别命名为ct01vh和ht4-59vl。

下面表21和表22显示了通过将天冬氨酸引入抗体可变区的骨架和cdr区中获得的重链可变区和轻链可变区突变体序列。

[表21]

[表22]

以与实施例1中所述相同的方式，进行每个重链可变区的克隆，并且将包含引入了改进的内体逃逸基序的单克隆抗体轻链可变区的所得的重链和轻链一起在hek293f细胞系中表达并纯化。

实施例42：确认完整igg形式细胞溶质穿透抗体(包含引入了天冬氨酸的重链可变区和/或轻链可变区)的内体逃逸能力的改进

图35是定量比较已经通过完整igg形式细胞溶质穿透抗体根据ph摄取台盼蓝的细胞的数量的图，该完整igg形式细胞溶质穿透抗体包含引入了天冬氨酸的轻链可变区和/或重链可变区。

具体地，以与实施例26中所述相同的方式制备pgsd-677细胞。然后，以与实施例5中所述相同的方式，将细胞与1μm的ct10-ep59、ct11-ep59、ct12-ep59、ct10-ep60、ct10-ep61、ct10-ep62、ct10-ep63、和ct12-ep63中的每一种在200μl的ph7.4缓冲液(hbss(welgene)、50mmhepesph7.4(细胞溶质ph))和ph5.5缓冲液(hbss(welgene)、50mmmesph5.5(早期内体ph))中的每一种中在37℃下孵育2小时。在用pbs小心洗涤之后，向每个孔中添加190μlpbs和10μl台盼蓝的200μl混合物，并用显微镜观察细胞。接下来，在用pbs小心洗涤后，将细胞通过向每个孔中添加50μl的1％sds(十二烷基硫酸钠)进行裂解。将细胞转移到96孔板中，并测量590nm处的吸光度。所有突变体均显示出类似于上述实施例中测试的ct01-ep41的台盼蓝摄取。这表明即使当引入了天冬氨酸时，内体逃逸能力也不会降低。将在稍后进行针对这些抗体的抗体稳定性实验。

实施例43：分析细胞溶质穿透抗体的结构

为了鉴定igg形式细胞溶质穿透抗体的结构，在内体酸性ph条件下具有内体逃逸能力的细胞溶质穿透抗体中，使用显示出非常高的生产产率的ct-59抗体。该抗体是分别包含ht0vh和ht4-59vl作为重链可变区和轻链可变区的igg形式细胞溶质穿透抗体。

为了鉴定三维结构，用木瓜蛋白酶处理使用hek293细胞产生的igg形式ct-59，并然后通过蛋白a柱和尺寸排阻色谱法纯化高纯度fab。接下来，在筛选缓冲液指数g1条件(0.2mnacl、0.1mtris，ph8.5，25％(w/v)peg3350)下使用mosquito-lcp系统形成用于结构鉴定的晶体。当细胞溶质穿透抗体与筛选缓冲液混合时，最终ph为8.1。

图36a显示了通过ri1000(rockimager1000；自动蛋白质晶体图像分析系统)观察在指数g1条件下形成的ct-59fab的晶体的结果。

在5c光束线(pohangacceleratorlaboratory(pal))下收集x射线衍射数据，并使用hkl2000包(hklresearchinc.,usa)进行分度和缩放，并然后通过分子置换(mr)方法获得ct-59fab的初始电子密度图。需要具有与ct-59相似的蛋白质的三维结构数据来使用mr方法，并且通过ffas站点(http://ffas.sanfordburnham.org/ffas-cgi/cgi/ffas.pl)获得的结构模型被用作模型。使用ccp4获得ct-59fab的初始相位信息。基于所获得的初始相位信息，使用coot(晶体学面向对象工具包(crystallographicobject-orientedtoolkit),http://www.biop.ox.ac.uk/coot/)进行模型构建操作，并且使用refmac5(http://www.ccp4.ac.uk/html/refmac5.html)和phenix(基于python的集成x光成像分层环境(python-basedhierarchicalenvironmentforintegratedxtallography)，http://www.phenix-online.org/)软件进行细化和验证操作(参见图36b)。

结果，在ph8.1的最终ph下，观察到具有的高分辨率的三维结构。发现ct-59的轻链可变区的第1个天冬氨酸(d)与轻链可变区的第95个甲硫氨酸(m)的侧链之间的距离为

工业适用性

包含具有根据本公开文本的内体逃逸基序的轻链可变区和/或重链可变区的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段穿透活细胞并定位于细胞溶质中，并且最终在不必使用特殊的外部蛋白质递送系统的情况下该抗体或其抗原结合片段可以穿透活细胞并定位于细胞溶质中。

根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段是包含容易地与各种人轻链可变区或重链可变区(vh)相互作用并结合的轻链可变区或重链可变区的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段，并且具有从内体逃逸到细胞溶质中的能力。该抗体或其抗原结合片段可以穿透细胞并定位于细胞溶质中，并且对靶细胞不显示非特异性细胞毒性。

基于根据本公开文本的高效细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段的内体逃逸机制，可以进行用于改进内体逃逸能力的抗体文库和突变体的设计。

将在根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段中包括的内体逃逸基序引入其他抗体中，以便可以预期其赋予内体逃逸能力。

此外，根据本公开文本的细胞溶质穿透抗体或其抗原结合片段可以被用作将活性物质递送到活细胞的细胞溶质中的载体，并且还可以被用作用于治疗和预防疾病的药物组合物。

尽管已经参考具体特征对本公开文本进行了详细描述，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅针对优选实施方案并不限制本公开文本的范围。因此，本公开的实质范围将由所附权利要求书及其等同物限定。

<110>奥隆制药

<120>细胞溶质穿透抗体及其用途

<130>pe05139a

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argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglngln

859095

tyrtrptyrtrpleumettyrthrpheglyglnglythrlysvalglu

100105110

ilelysarg

115

<210>29

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht4-3l10-3vl

<400>29

aspleuvalmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleupheasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglngln

859095

tyrtrptyrtrptyrmettyrthrpheglyglnglythrlysvalglu

100105110

ilelysarg

115

<210>30

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht4-3l11-1vl

<400>30

aspleuvalmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleupheasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglngln

859095

tyrtrptyrtrpleutyrmettyrthrpheglyglnglythrlysval

100105110

gluilelysarg

115

<210>31

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht4-3l11-2vl

<400>31

aspleuvalmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleupheasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglngln

859095

tyrprotrptyrtrppromettyrthrpheglyglnglythrlysval

100105110

gluilelysarg

115

<210>32

<211>108

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>necitumumab-wywvl

<400>32

gluilevalmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr

202530

leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile

354045

tyraspalaserasnargalathrglyileproalaargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro

65707580

gluaspphealavaltyrphecysglnglntyrtrptyrtrpmettyr

859095

thrpheglyglnglythrlysalagluilelysarg

100105

<210>33

<211>108

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>panitumumab-wywvl

<400>33

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysglnalaserglnaspileserasntyr

202530

leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyraspalaserasnleugluthrglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrphethrileserserleuglnpro

65707580

gluaspilealathrtyrphecysglnglntyrtrptyrtrpmettyr

859095

thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysarg

100105

<210>34

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>lumretuzumab-wywvl

<400>34

aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserserglnservalleuasnser

202530

glyasnglnlysasntyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrphecysglngln

859095

tyrtrptyrtrpmettyrthrpheglyglnglythrlysleugluile

100105110

lysarg

<210>35

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>nimotuzumab-wywvl

<400>35

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargserserglnasnilevalhisser

202530

asnglyasnthrtyrleuasptrptyrglnglnthrproglylysala

354045

prolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro

505560

serargpheserglyserglyserglythraspphethrphethrile

65707580

serserleuglnprogluaspilealathrtyrphecysglnglntyr

859095

trptyrtrpmettyrthrpheglyglnglythrlysleuglnilethr

100105110

arg

<210>36

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>emibetuzumab-wywvl

<400>36

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysservalserserservalserserile

202530

tyrleuhistrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleu

354045

iletyrserthrserasnleualaserglyvalproserargpheser

505560

glyserglyserglythraspphethrleuthrileserserleugln

65707580

progluaspphealathrtyrphecysglnglntyrtrptyrtrpmet

859095

tyrthrpheglyglyglythrlysvalgluilelysarg

100105

<210>37

<211>108

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pertuzumab-wywvl

<400>37

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysalaserglnaspvalserilegly

202530

valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyrseralasertyrargtyrthrglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro

65707580

gluaspphealathrtyrphecysglnglntyrtrptyrtrpmettyr

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

100105

<210>38

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0vh

<400>38

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileasnprotyrasnaspglyasntyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserarglysthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglyalatyrlysargglytyralametasptyrtrpglygln

100105110

glythrthrvalthrvalserser

115120

<210>39

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-01vh

<400>39

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileasnprotyrasnaspglyasntyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserarglysthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglytrptyrtrpmetaspleutrpglyglnglythrthrval

100105110

thrvalserser

115

<210>40

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-02vh

<400>40

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileasnprotyrasnaspglyasntyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserarglysthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglytrptyrtrppheaspleutrpglyglnglythrthrval

100105110

thrvalserser

115

<210>41

<211>117

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-03vh

<400>41

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileasnprotyrasnaspglyasntyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserarglysthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglytrptyrtrpglypheaspleutrpglyglnglythrthr

100105110

valthrvalserser

115

<210>42

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-04vh

<400>42

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileasnprotyrasnaspglyasntyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserarglysthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargtyrtrptyrtrpmetaspleutrpglyglnglythrthrval

100105110

thrvalserser

115

<210>43

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr1

<400>43

sertyrvalmethis

15

<210>44

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr2

<400>44

alaileasnprotyrasnaspglyasntyrtyralaaspservallys

151015

gly

<210>45

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0vh

<400>45

glyalaarglysargglytyralametasptyr

1510

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<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-01vh

<400>46

glytrptyrtrpmetaspleu

15

<210>47

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-02vh

<400>47

glytrptyrtrppheaspleu

15

<210>48

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-03vh

<400>48

glytrptyrtrpglypheaspleu

15

<210>49

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-04vh

<400>49

tyrtrptyrtrpmetaspleu

15

<210>50

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht4-3wwwvl

<400>50

aspleuvalmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleupheasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrphecysglngln

859095

tyrtrptrptrpmettyrthrpheglyglnglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

<210>51

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht43wwwvl

<400>51

glnglntyrtrptrptrpmettyrthr

15

<210>52

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-01wwwvh

<400>52

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileasnprotyrasnaspglyasntyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserarglysthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglytrptrptrpmetaspleutrpglyglnglythrthrval

100105110

thrvalserser

115

<210>53

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht0-01wwwvh

<400>53

glytrptrptrpmetaspleu

15

<210>54

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>humira-01vh

<400>54

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr

202530

alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralailethrtrpasnserglyhisileasptyralaaspserval

505560

gluglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysglytrptyrtrpmetaspleutrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>55

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>herceptin-01vh

<400>55

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglypheasnilelysaspthr

202530

tyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

alaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

serargglytrptyrtrpmetaspleutrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>56

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>avastin-01vh

<400>56

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrthrphethrasntyr

202530

glymetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

glytrpileasnthrtyrthrglygluprothrtyralaalaaspphe

505560

lysargargphethrpheserleuaspthrserlysserthralatyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysglytrptyrtrpmetaspleutrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>57

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ct10vh

<400>57

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheseraspphe

202530

sermetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

sertyrileserargthrserhisthrthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglytrptyrtrpmetaspleutrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>58

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ct11vh

<400>58

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethraspaspaspphe

202530

sermetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

sertyrileserargthrserhisthrthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglytrptyrtrpmetaspleutrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>59

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ct12vh

<400>59

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethraspaspaspphe

202530

sermetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

sertyrileserargthrserhisthrthrasptyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglytrptyrtrpmetaspleutrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>60

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht4-59vl

<400>60

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleuleuasnser

202530

argaspglylysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrphecysglngln

859095

tyrtrptyrtrpmettyrthrpheglyglnglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

<210>61

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht4-60vl

<400>61

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnseraspleuasnser

202530

argaspglylysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrphecysglngln

859095

tyrtrptyrtrpmettyrthrpheglyglnglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

<210>62

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht4-61vl

<400>62

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleuleuasnser

202530

argaspglylysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyraspalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrphecysglngln

859095

tyrtrptyrtrpmettyrthrpheglyglnglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

<210>63

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>ht4-62vl

<400>63

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleuleuasnser

202530

argaspglylysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

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505560

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alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

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lysarg

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<212>prt

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aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleupheasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

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alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglngln

859095

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lysarg

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lysarg