编码VEGF-A多肽的经修饰的RNA、配制品和关于它们的用途的制作方法

本披露涉及编码vegf-a多肽的经修饰的rna分子和包含该经修饰的rna的配制品。本披露的方面还涉及包含该经修饰的rna的配制品的制备和在治疗患有对vegf-a疗法有反应的疾病的受试者中的用途。2.背景血管内皮生长因子a(vegf-a)通路一般在控制心血管生理功能，特别是动脉生成中发挥核心作用。vegf-a的作用包括一氧化氮(no)信号传导的激活、血管通透性、肿瘤血管生成、动脉生成、内皮细胞复制以及多潜能心血管祖细胞的细胞命运转变。虽然通过小分子和抗体两者对vegf-a途径的抑制已经成为选定形式的癌症和黄斑变性的护理标准，但解锁扩张vegf-a途径以用于潜在治疗效果(包括放松平滑肌、促进新血管形成、以及潜在地逆转与糖尿病血管并发症相关的血管反应缺陷)的潜力仍然具有挑战性。以此，已经尝试了不同数量的方法以允许用以控制vegf-a在靶组织中的空间和时间表达的临床上易于处理的途径。然而，每种途径都有显著的缺点：全身vegf-a蛋白途径可导致明显的低血压，并且vegf-a迅速降解；病毒性包封的和裸的vegf-adna质粒对蛋白质表达的时间控制有限，并且体内表达的效率可以是高度可变的和非剂量依赖性的；腺病毒载体可以激活免疫系统；并且裸rna不稳定，转染水平低，且还可触发免疫激活。结果是这些限制约束了vegf-a作为治疗平台的适用性。在一些先前的研究中，治疗性rna(例如sirna)的体内使用已依赖于利用脂质-纳米粒子(lnp)来保护mrna免于降解以及有效转染。此外，在肝脏以外的器官中达到治疗水平的rnai治疗的尝试已经导致输注相关的超敏反应以及肝毒性，因此限制了其在其他器官系统中的疾病治疗的用途(鲁丁(rudin)cm等人，临床癌症研究(clin.cancerres.)，(2004)10，7244-7251)。此外，这些lnp的其他变体已经在选择的病例中临床用于治疗用途，但可引起剂量依赖性组织损伤(科埃略(coelho)t.等人，新英格兰医学杂志(nengljmed)，(2013)369，819-829)。一些基于脂质的核酸药物配制品的这种剂量依赖性毒性效应的实例包括输注相关反应，例如呼吸困难、缺氧、僵硬、背痛、低血压和肝损伤。此外，虽然阳离子脂质通常包括在rna治疗剂例如sirna的脂质配制品中，以改善rna包封和稳定性，但是一些这样的脂质可展现出剂量依赖性毒性，例如破坏膜结构的完整性、细胞裂解和坏死和/或以不希望的方式改变多种基因的表达(薛(xue)hy，当前药物设计(currpharmdes.)，(2015)21(22)：3140-7)。在临床前和临床水平，脂质复合物(lipoplex)的剂量依赖性全身毒性也已得到充分的记录。肝脏中枯否细胞捕获脂质复合物可触发炎症反应，其可对肝脏造成损害，并导致主要肝功能指标水平升高。白细胞减少和血小板减少也可发生(张(zhang)j.，先进药物递送评论(advdrugdelivrev.)，(2005)57(5)：689-698)。此外，脂质转染胺(lipofectamine)导致免疫/炎症反应和细胞死亡。因此，为了避免rna的潜在免疫原性和与一些lnp相关的剂量依赖性毒性，需要编码vegf-a多肽的经修饰的rna的供选择的较低毒性的配制品，以在治疗患有对vegf-a疗法有反应的疾病的受试者中以治疗上适当的水平递送经修饰的rna。3.概述本披露涉及编码vegf-a多肽的经修饰的rna分子和包含该经修饰的rna的配制品。还披露了这些配制品中的vegf-a修饰的rna针对蛋白质表达、产生毒性较小的治疗剂、以及提供可用于治疗患有对vegf-a疗法有反应的疾病的受试者的工具的所得益处。在以下段落中概述了本披露的某些实施例。此列表仅是示例性的，并且不是本披露提供的所有实施例的详尽列举。实施例1.一种包含经修饰的rna和缓冲液的组合物，该经修饰的rna优选编码seqidno:2的vegf-a多肽的具有seqidno:1的经修饰的rna，该缓冲液优选柠檬酸盐盐水缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液或氨丁三醇(tham)缓冲液，其中该缓冲液基本上不含二价阳离子。实施例2.一种包含药学上可接受量的经修饰的rna和缓冲液的配制品，该经修饰的rna优选编码seqidno:2的vegf-a多肽的具有seqidno:1的经修饰的rna，该缓冲液优选柠檬酸盐盐水缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液或氨丁三醇(tham)缓冲液，其中该缓冲液基本上不含二价阳离子。实施例3.如实施例2所述的配制品，其中所述基本上不含二价阳离子的缓冲液是柠檬酸盐盐水缓冲液。实施例4.如实施例3所述的配制品，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含钙和镁。实施例5.如实施例3所述的配制品，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。实施例6.如实施例2所述的配制品，进一步包含药学上可接受的赋形剂。实施例7.如实施例6所述的配制品，其中该药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。实施例8.一种治疗患有对vegf-a疗法有反应的疾病的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品。实施例9.如实施例8所述的方法，其中在所述组合物或配制品中基本上不含二价阳离子的缓冲液是柠檬酸盐盐水缓冲液。实施例10.如实施例9所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含钙和镁。实施例11.如实施例9所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。实施例12.如实施例8所述的方法，其中该配制品另外包含药学上可接受的赋形剂。实施例13.如实施例12所述的方法，其中该药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。实施例14.如实施例8所述的方法，其中该疾病选自具有减少或保留的射血分数的心力衰竭、肾脏疾病、涉及皮肤移植和组织移植的疾病、mi后心脏功能障碍、缺血性心脏病、来自创伤或手术的血管损伤、包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡、严重肢体缺血、肺动脉高压和外周动脉疾病。实施例15.如实施例8所述的方法，其中该疾病是具有减少或保留的射血分数的心力衰竭。实施例16.如实施例8所述的方法，其中该疾病是mi后心脏功能障碍。实施例17.如实施例8所述的方法，其中该疾病是缺血性心脏病。实施例18.如实施例8所述的方法，其中该疾病是来自创伤或手术的血管损伤。实施例19.如实施例8所述的方法，其中该疾病是包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡。实施例20.如实施例8所述的方法，其中该疾病是严重肢体缺血。实施例21.如实施例8所述的方法，其中该疾病是肺动脉高压。实施例22.如实施例8所述的方法，其中该疾病是外周动脉疾病。实施例23.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品是经肌内、皮内、皮下、心内或心外膜途径，通过门静脉导管、通过冠状窦导管和/或通过直接给予到待治疗的区域来给予至受试者。实施例24.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品是经肌内给予该受试者。实施例25.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品是经皮内给予该受试者。实施例26.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品是经皮下给予该受试者。实施例27.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品是经心内或心外膜给予该受试者，优选以固定剂量以多次给予来给予。实施例28.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品是通过门静脉导管给予该受试者，优选以固定剂量以多次给予来给予。实施例29.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品是通过冠状窦导管给予该受试者，优选以固定剂量以多次给予来给予。实施例30.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品是通过直接给予到待治疗的区域而给予该受试者，优选以固定剂量以多次给予来给予。实施例31.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例32.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例33.如实施例8所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例34.如实施例9所述的方法，其中与基于脂质的组合物或配制品相比，该具有柠檬酸盐盐水缓冲液的组合物或配制品对于该受试者的毒性更低。实施例35.一种用于调节哺乳动物细胞、组织或受试者中的生理过程的方法，该方法包括使所述哺乳动物细胞、组织或受试者与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。实施例36.如实施例35所述的方法，其中该调节选自诱导血管生成、刺激血管细胞增殖、增加心外膜衍生的祖细胞的增殖和/或改变心外膜衍生的祖细胞的命运、上调内皮化、诱导心脏再生、增加组织移植物的血管再生以用于伤口愈合、改善血管功能、增加组织灌注和新血管形成、减少瘢痕组织和改善心脏功能。实施例37.如实施例35所述的方法，其中该调节包括诱导血管生成。实施例38.如实施例35所述的方法，其中该调节包括刺激血管细胞增殖。实施例39.如实施例35所述的方法，其中该调节包括增加心外膜衍生的祖细胞的增殖和/或改变心外膜衍生的祖细胞的命运。实施例40.如实施例35所述的方法，其中该调节包括上调内皮化。实施例41.如实施例35所述的方法，其中该调节包括诱导心脏再生。实施例42.如实施例35所述的方法，其中该调节包括增加组织移植物的血管再生以用于伤口愈合。实施例43.如实施例35所述的方法，其中该调节包括改善血管功能。实施例44.如实施例35所述的方法，其中该调节包括增加组织灌注和新血管形成。实施例45.如实施例35所述的方法，其中该调节包括减少瘢痕组织。实施例46.如实施例35所述的方法，其中该调节包括改善心脏功能。实施例47.如实施例35所述的方法，其中在所述组合物或配制品中基本上不含二价阳离子的缓冲液是柠檬酸盐盐水缓冲液。实施例48.如实施例47所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含钙和镁。实施例49.如实施例47所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。实施例50.如实施例35所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例51.如实施例35所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例52.如实施例35所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例53.一种在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a的方法，该方法包括使所述哺乳动物细胞或组织与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。实施例54.如实施例53所述的方法，其中在所述组合物或配制品中基本上不含二价阳离子的缓冲液是柠檬酸盐盐水缓冲液。实施例55.如实施例54所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含钙和镁。实施例56.如实施例54所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。实施例57.如实施例53所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例58.如实施例53所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例59.如实施例53所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例60.一种在受试者中产生vegf-a的方法，该方法包括向所述受试者给予根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品。实施例61.如实施例60所述的方法，其中在所述组合物或配制品中基本上不含二价阳离子的缓冲液是柠檬酸盐盐水缓冲液。实施例62.如实施例61所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含钙和镁。实施例63.如实施例61所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。实施例64.如实施例60所述的方法，其中该配制品另外包含药学上可接受的赋形剂。实施例65.如实施例64所述的方法，其中该药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。实施例66.如实施例60所述的方法，其中该受试者患有对vegf-a疗法有反应的疾病。实施例67.如实施例66所述的方法，其中该疾病选自具有减少或保留的射血分数的心力衰竭、肾脏疾病、涉及皮肤移植和组织移植的疾病、mi后心脏功能障碍、缺血性心脏病、来自创伤或手术的血管损伤、包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡、严重肢体缺血、肺动脉高压和外周动脉疾病。实施例68.如实施例66所述的方法，其中该疾病是具有减少或保留的射血分数的心力衰竭。实施例69.如实施例66所述的方法，其中该疾病是mi后心脏功能障碍。实施例70.如实施例66所述的方法，其中该疾病是缺血性心脏病。实施例71.如实施例66所述的方法，其中该疾病是来自创伤或手术的血管损伤。实施例72.如实施例66所述的方法，其中该疾病是包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡。实施例73.如实施例66所述的方法，其中该疾病是严重肢体缺血。实施例74.如实施例66所述的方法，其中该疾病是肺动脉高压。实施例75.如实施例66所述的方法，其中该疾病是外周动脉疾病。实施例76.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品是经肌内、皮内、皮下、心内或心外膜途径，通过门静脉导管、通过冠状窦导管和/或通过直接给予到待治疗的区域来给予至受试者。实施例77.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品是经肌内给予该受试者。实施例78.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品是经皮内给予该受试者。实施例79.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品是经皮下给予该受试者。实施例80.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品是经心内或心外膜给予该受试者，优选以固定剂量以多次给予来给予。实施例81.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品是通过门静脉导管给予该受试者，优选以固定剂量以多次给予来给予。实施例82.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品是通过冠状窦导管给予该受试者，优选以固定剂量以多次给予来给予。实施例83.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品是通过直接给予到待治疗的区域而给予该受试者，优选以固定剂量以多次给予来给予。实施例84.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例85.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例86.如实施例60所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例87.一种制备组合物或配制品的方法，该方法包括将经修饰的rna与缓冲液组合到该组合物或配制品中，该经修饰的rna优选编码seqidno:2的vegf-a多肽的具有seqidno:1的经修饰的rna，该缓冲液优选柠檬酸盐盐水缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液或氨丁三醇(tham)缓冲液，其中该缓冲液基本上不含二价阳离子，并且其中该组合物或配制品对于治疗患有对vegf-a疗法有反应的疾病的受试者是有效的。实施例88.如实施例87所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含钙和镁。实施例89.如实施例87所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。实施例90.如实施例87所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例91.如实施例87所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例92.如实施例87所述的方法，其中该组合物或配制品包含优选配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的该经修饰的rna。实施例93.如实施例87所述的方法，其中与基于脂质的组合物或配制品相比，该具有柠檬酸盐盐水缓冲液的组合物或配制品对于该受试者的毒性更低。实施例94.一种降低受试者中vegf-a治疗的毒性的方法，该方法包括将经修饰的rna与缓冲液配制成组合物或配制品，该经修饰的rna优选编码seqidno:2的vegf-a多肽的具有seqidno:1的经修饰的rna，该盐水优选柠檬酸盐盐水缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液或氨丁三醇(tham)缓冲液，其中该缓冲液基本上不含二价阳离子。实施例95.如实施例94所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含钙和镁。实施例96.如实施例94所述的方法，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。实施例97.一种包含用于产生经修饰的rna的体外转录模板的核酸序列，该经修饰的rna优选编码seqidno:2的vegf-a多肽的具有seqidno:1的经修饰的rna。实施例98.一种用于增加哺乳动物组织或受试者中伤口愈合的方法，该方法包括使所述哺乳动物组织或受试者与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。实施例99.一种用于诱导哺乳动物组织或受试者中新生血管形成的方法，该方法包括使所述哺乳动物组织或受试者与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。实施例100.一种用于诱导哺乳动物组织或受试者中血管生成的方法，该方法包括使所述哺乳动物组织或受试者与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。实施例101.一种用于诱导哺乳动物组织或受试者中血管舒张的方法，该方法包括使所述哺乳动物组织或受试者与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。实施例102.一种用于诱导哺乳动物组织或受试者中血流上调的方法，该方法包括使所述哺乳动物组织或受试者与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。实施例103.一种用于增加哺乳动物组织或受试者中毛细血管和/或小动脉密度的方法，该方法包括使所述哺乳动物组织或受试者与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。实施例104.一种用于减轻哺乳动物组织或受试者中的纤维化的方法，该方法包括使所述哺乳动物组织或受试者与根据实施例1所述的组合物和/或根据实施例2-7中任一项所述的配制品接触。4.附图说明本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明的目的。附图并不旨在以任何方式限制本传授内容的范围。图1a和1b：实例中使用的vegf-a修饰rna的结构(图1a)和序列(seqidno:1，图1b)。图2a、2b和2c：更高剂量的经修饰的rna的转染导致在人主动脉平滑肌细胞中产生更多的vegf-a蛋白(图2a)。在人主动脉平滑肌细胞中用经修饰的rna转染后产生vegf-a蛋白的时间历程(图2b)。在用经修饰的rna转染后，小鼠心脏成纤维细胞(图2c，左图)和猪内皮细胞(图2c，右图)中的vegf-a蛋白质产生。图3a、3b和3c：由vegf-a修饰的rna产生的vegf-a蛋白诱导人内皮细胞中vegfr2的磷酸化(图3a)以及人内皮细胞中的下游信号传导通路enos(图3b)和小鼠心脏成纤维细胞中的akt(图3c)的活化。图4a、4b和4c：由vegf-a修饰的rna产生的vegf-a蛋白影响血管生成过程中的几个关键步骤。由vegf-a修饰的rna产生的vegf-a蛋白增加培养的人内皮细胞的增殖(图4a)和迁移(图4b)。由vegf-a修饰的rna产生的vegf-a蛋白增加具有涂覆了内皮细胞的珠粒的3d培养物中的血管生成芽形成(图4c)。图5a、5b和5c：来自涂覆有内皮细胞并用对照培养基(图5a)或具有经修饰的rna产生的vegf-a的条件培养基(图5b)处理的珠粒的血管生成芽形成的图像。来自涂覆有内皮细胞并用经修饰的rna产生的vegf-a处理的珠粒的血管生成芽形成的放大视图(图5c)。图6a、6b和6c：指示在柠檬酸盐盐水(图6a)、配制在脂质转染胺(100μg，图6b)或柠檬酸盐盐水缓冲液(150μg，图6c)中的lacz修饰的rna的50μl心内注射之后小鼠心脏中产生的β-半乳糖苷酶的x-gal染色的比较。图7：对在磷酸盐缓冲盐水(pbs，n＝3)、柠檬酸盐盐水(c/s，n＝6)或氨丁三醇aka2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(tham，n＝3)中配制的萤火虫荧光素酶修饰的rna的心内注射之后小鼠心脏中产生的荧光素酶蛋白质的评估。pbs、c/s和tham缓冲液(n＝2/组)用作阴性对照。图8a、8b、8c和8d：在初试大鼠中在15μg(圆)、150μg(正方形)或1800μg(三角形)的用柠檬酸盐盐水配制的vegf-a修饰的rna的心内注射后的不同时间点，vegf-a蛋白的心脏水平(图8a)。患有心肌梗塞和心内注射了柠檬酸盐/盐水或vegf-a修饰的rna(150或1800μg，配制在柠檬酸盐/盐水中)的大鼠的左心室射血分数和梗塞尺寸(为左心室质量的％)的比较。在诱导梗塞和注射后8天通过心脏磁共振成像评估射血分数(图8b)和梗塞尺寸(图8c)。诱导心肌梗塞并且心内注射柠檬酸盐/盐水或配制于柠檬酸盐/盐水中的vegf-a修饰的rna后一天，从大鼠抽取的静脉血中的心肌肌钙蛋白i(tni)的水平(图8d)。图9a和9b：自心外膜注射了lacz修饰的rna(在3个单独的注射部位100μg)的哥廷根小型猪的左心室游离壁收获的代表性样品。注射后6小时收获组织，并x-gal染色18小时。对应地，左侧样品显示了用配制在脂质转染胺(图9a)中的lacz修饰的rna注射的组织中的染色，以及用配制在柠檬酸盐/盐水中的lacz修饰的rna注射的右侧样品组织的情况(图9b)。图10：在哥廷根小型猪中，心外膜注射不同剂量的vegf-a修饰的rna后6小时，猪左心室组织样品中的人vegf-a蛋白。图11a、11b、11c、11d、11e、11f和11g：在柠檬酸盐盐水缓冲液中lacz和荧光素酶修饰的rna心脏转染和翻译。用柠檬酸盐盐水缓冲液将75μglacz修饰的rna注射到小鼠心脏中。在心脏左心室的大约10％(图11a、图11c和图11d中的代表性图像)中发现β-半乳糖苷酶的产生。x-gal染色的放大视图，其显示注射lacz修饰的rna后心脏中的β-半乳糖苷酶的产生(图11b)。将荧光素酶修饰的rna注射到心脏中。用荧光素酶探针进行的rna原位杂交揭示在注射部位的心肌中存在荧光素酶修饰的rna(图11e)。用荧光素酶探针进行的rna原位杂交的放大视图，其显示荧光素酶修饰的rna的存在(图11f)。免疫组织化学揭示注射荧光素酶修饰的rna后注射部位心肌中的荧光素酶蛋白表达(图11g)。图12a、12b和12c：经修饰的rna随着柠檬酸盐/盐水缓冲液注射到心脏后的vegf-a蛋白表达是可饱和的，并且在多个物种间具有类似的药代动力学。在小鼠中单次心脏注射配制于柠檬酸盐盐水缓冲液(ntb)中的vegf-a修饰的rna(对比脂质转染胺(lnp))后，72小时内的vegf-a蛋白质药代动力学(图12a)。渐增给予柠檬酸盐盐水中的vegf-a修饰的rna后，vegf-a蛋白水平的跨物种比较(图12b)。通过渐增剂量的vegf-a修饰的rna产生的vegf-a蛋白的大鼠药代动力学。在72小时产生的vegf-a蛋白的曲线下面积(auc)测量(图12c)。图13a和13b：在小鼠、大鼠和猪中，心内注射人vegf-a修饰的rna后人vegf-a蛋白产生的评估。在心内注射配制在柠檬酸盐/盐水中的100μgvegf-a修饰的rna后，在小鼠(实心正方形)、大鼠(实心星形)和猪(实心圆)心脏中产生的vegf-a蛋白的多少和时间曲线(图13a中为0至72小时；而图13b中为0至192小时)。显示为几何均值±sd。图14：人vegf-a修饰的rna和重组人vegf-a对经受心肌梗塞的小型猪的左心室射血分数(ef)的影响。在左前降支冠状动脉的永久性闭塞之前(bf)和之后(af)进行ef的连续评估。对一个单独组的猪进行无冠状动脉闭塞的假手术(空心圆，n＝5)。然后在闭塞后7天(7daf)和再次2个月后(2moaf)进行研究药物注射时对ef的随后评估。在7daf的情况，将猪分别随机接受柠檬酸盐/盐水(实心正方形，n＝8)或总剂量为1mg(实心圆，n＝8)或10mg(实心三角形，n＝8)的vegf-a修饰的rna或配制在自组装纳米纤维(实心菱形，n＝5))中的重组人vegf-a蛋白的20次心外膜注射(每次100μl)。*：p<0.05相对于2moaf柠檬酸盐/盐水对照组；**：p<0.01相对于2moaf柠檬酸盐/盐水对照组；p<0.001比较从7daf直到2moaf的变化；p<0.0001比较从7daf直到2moaf的变化。图15：人vegf-a修饰的rna和重组人vegf-a对经受心肌梗塞的小型猪中随时间的推移最高左心室压力发展(dp/dtmax)的影响。使小型猪经受左前降支冠状动脉的永久性闭塞以诱导心肌梗塞。对一个单独组的猪进行无冠状动脉闭塞的假手术(空心圆，n＝5)。七天后，将梗塞的猪随机盲法心外膜注射柠檬酸盐/盐水运载体(2ml，实心正方形)、1mg(实心圆)或10mg(实心三角形)vegf-a修饰的rna或配制在自组装纳米纤维中的重组人vegf-a蛋白(200ng)(实心菱形)。剂量/容积作为在梗塞周围区域的20次单独注射(每次100μl)给予。注射后2个月侵入式测量左心室功能。显示了个体数据和均值±sem。图16：人vegf-a修饰的rna和重组人vegf-a对经受心肌梗塞的小型猪中随时间的推移最小左心室压力发展(dp/dtmin)的影响。使小型猪经受左前降支冠状动脉的永久性闭塞以诱导心肌梗塞。对一个单独组的猪进行无冠状动脉闭塞的假手术(空心圆，n＝5)。七天后，将梗塞的猪随机盲法心外膜注射柠檬酸盐/盐水运载体(2ml，实心正方形)、1mg(实心圆)或10mg(实心三角形)vegf-a修饰的rna或配制在自组装纳米纤维中的重组人vegf-a蛋白(200ng)(实心菱形)。剂量/容积作为在梗塞周围区域的20次单独注射(每次100μl)给予。注射后2个月侵入式测量左心室功能。显示了个体数据和均值±sem。图17：人vegf-a修饰的rna和重组人vegf-a对经受心肌梗塞的小型猪的收缩功能(收缩力，espvr)的影响。使小型猪经受左前降支冠状动脉的永久性闭塞以诱导心肌梗塞。对一个单独组的猪进行无冠状动脉闭塞的假手术(空心圆，n＝5)。七天后，将梗塞的猪随机盲法心外膜注射柠檬酸盐/盐水运载体(2ml，实心正方形)、1mg(实心圆)或10mg(实心三角形)vegf-a修饰的rna或配制在自组装纳米纤维中的重组人vegf-a蛋白(200ng)(实心菱形)。剂量/容积作为在梗塞周围区域的20次单独注射(每次100μl)给予。注射后2个月侵入式测量左心室功能。显示了个体数据和均值±sem。图18：人vegf-a修饰的rna和重组人vegf-a对经受心肌梗塞的小型猪的舒张功能(依从性，edpvr)的影响。使小型猪经受左前降支冠状动脉的永久性闭塞以诱导心肌梗塞。对一个单独组的猪进行无冠状动脉闭塞的假手术(空心圆，n＝5)。七天后，将梗塞的猪随机盲法心外膜注射柠檬酸盐/盐水运载体(2ml，实心正方形)、1mg(实心圆)或10mg(实心三角形)vegf-a修饰的rna或配制在自组装纳米纤维中的重组人vegf-a蛋白(200ng)(实心菱形)。剂量/容积作为在梗塞周围区域的20次单独注射(每次100μl)给予。注射后2个月侵入式测量左心室功能。显示了个体数据和均值±sem。图19：人vegf-a修饰的rna和重组人vegf-a对经受心肌梗塞的小型猪的前负荷补充搏功(prsw)的影响。使小型猪经受左前降支冠状动脉的永久性闭塞以诱导心肌梗塞。对一个单独组的猪进行无冠状动脉闭塞的假手术(空心圆，n＝5)。七天后，将梗塞的猪随机盲法心外膜注射柠檬酸盐/盐水运载体(2ml，实心正方形)、1mg(实心圆)或10mg(实心三角形)vegf-a修饰的rna或配制在自组装纳米纤维中的重组人vegf-a蛋白(200ng)(实心菱形)。剂量/容积作为在梗塞周围区域的20次单独注射(每次100μl)给予。注射后2个月侵入式测量左心室功能。显示了个体数据和均值±sem。图20a、20b和20c：人vegf-a修饰的rna和重组人vegf-a对经受心肌梗塞的小型猪的梗塞尺寸的影响。梗塞尺寸呈现为心外膜注射柠檬酸盐/盐水(实心正方形)或者1mg(实心圆)或10mg(实心三角形)vegf-a修饰的rna或配制在自组装纳米纤维中的重组人vegf-a蛋白(200ng)(实心菱形)的小型猪中的总体左心室梗塞尺寸(切片2、3、4和5，图20a)、中左心室梗塞尺寸(切片3和4，图20b)和正中左心室梗塞尺寸(切片4，图20c)。在通过左前降支冠状动脉的永久性闭塞诱导心肌梗塞后7天给予注射。注射后2个月测量梗塞尺寸。显示为均值±sem。图21：实例14的试验1期间小鼠的身体质量。在每个成像时间点记录每只小鼠的身体质量。呈现的数据为均值±sem，黑色条：运载体单次注射，阴影线条：运载体双次注射，灰色条：vegf-a修饰的rna单次注射，横线条：vegf-a修饰的rna双次注射，*：p<0.05针对双次相对于单次注射运载体。图22：在实例14的试验1中小鼠的禁食和非空腹血糖测量。在第0天，在4小时禁食期后测量血糖。在第18天，测量非空腹血糖。呈现的数据为均值±sem，黑色条：运载体单次注射，阴影线条：运载体双次注射，灰色条：vegf-a修饰的rna单次注射，横线条：vegf-a修饰的rna双次注射，*：p<0.05针对vegf-a修饰的rna单次注射相对于运载体单次注射。图23：实例14中试验1的伤口愈合曲线。将来自三名观察者的中值的平均归一化开放伤口面积针对手术后天数绘图。呈现的数据为均值±sem，*p<0.05针对分别在第6天进行的vegf-a修饰的rna双次注射(空心正方形)相对于运载体单次(实心圆)和双次(空心圆)注射以及分别在第10天进行的vegf-a修饰的rna双次注射相对于运载体双次注射。实心正方形：vegf-a修饰的rna单次注射。图24：来自实例14中试验1的伤口愈合曲线的三次样条插值。构建三次样条插值以接近到25％、50％和75％闭合的时间，如水平灰色虚线所证明的。呈现的数据是来自三名观察员的中值的归一化开放伤口面积的均值。φ：p<0.05针对vegf-a修饰的rna双次注射(空心正方形)相对于运载体单次注射(实心圆)#：p<0.05针对vegf-a修饰的rna双次注射相对于运载体双次注射(空心圆)。实心正方形：vegf-a修饰的rna单次注射。图25：实例14中试验1的时间点之间的伤口愈合百分比。使用归一化伤口面积数据在每个时间点之间计算伤口闭合的平均百分比。呈现的数据为均值±sem；*p<0.05针对第3天至第6天vegf-a修饰的rna双次注射(横线条)分别相对于运载体双次(阴影线条)和单次注射(黑色条)的更高伤口闭合平均百分比，并且针对第10天至第13天vegf-a修饰的rna单次注射(灰色条)分别相对于运载体双次和单次注射的更低伤口闭合平均值。图26：实例14试验1中苏木精和伊红染色的伤口切片的代表性图像。a：运载体单次注射，b：运载体双次注射，c：vegf-a修饰的rna单次注射，d：vegf-a修饰的rna双次注射。图27：实例14试验1中cd31染色的伤口切片的代表性图像。箭头指示强cd31染色的区域。a)单次运载体，b)双次运载体，c)单次vegf-a修饰的rna，d)双次vegf-a修饰的rna。图28：实例14中试验1中的cd31染色的量化。图a至d是代表性的获得图像，并且图e至h是cd31阳性染色(棕色通道)的代表性阈值图像。a和e：单次运载体，b和f：双次运载体，c和g：单次vegf-a修饰的rna，d和h：双次vegf-a修饰的rna，i：cd31染色(黑色像素覆盖的区域)的面积百分比的定量。黑色条：运载体单次注射，阴影线条：运载体双次注射，灰色条：vegf-a修饰的rna单次注射，横线条：vegf-a修饰的rna双次注射。图29：实例14中用蛋白质印迹进行的下游vegf信号传导分析(试验1)。上图：来自在第0天接受单剂量运载体、在第0天和第3天接受双剂量运载体、第0天接受单剂量的vegf-a修饰的rna、以及在第0和第3天接受双剂量的vegf-a修饰的rna的小鼠的第18天样品的pakt和akt印迹。下图：pakt/akt的定量比值在治疗组间未显示统计学差异。左条：运载体单次注射，左中条：运载体双次注射，右中条：单次vegf-a修饰的rna注射，右条；双次vegf-a修饰的rna注射。图30：来自实例14中试验1第18天收获的小鼠伤口中的pvegfr2、vegfr2和vegf-a的蛋白质印迹分析。上图：来自在第0天接受单剂量运载体、在第0天和第3天接受双剂量运载体、第0天接受单剂量的vegf-a修饰的rna、以及在第0和第3天接受双剂量的vegf-a修饰的rna的小鼠的第18天样品的pvegfr2、vegfr2和vegfa印迹。下图：pvegfr2/vegfr2的定量比值在治疗组间未显示统计学差异。左条：运载体单次注射，左中条：运载体双次注射，右中条：单次vegf-a修饰的rna注射，右条；双次vegf-a修饰的rna注射。图31：实例14的试验2期间小鼠的身体质量。在每个成像时间点记录每只小鼠的身体质量。呈现的数据为均值±sem。左条：运载体双次注射，右条：vegf-a修饰的rna双次注射。图32：在实例14的试验2中小鼠的禁食血糖和非空腹血糖。在第0天，在4小时禁食期后测量血糖。在第18天，测量非空腹血糖。呈现的数据为均值±sem。左条：运载体双次注射，右条：vegf-a修饰的rna双次注射。图33：氧敏感纳米粒子的体内应用示意图。a)纳米粒子在全层皮肤伤口中的应用。激发时，纳米粒子发出强的室温荧光(b)和强的氧依赖性磷光(c)。比率法图像由荧光和磷光之间的比例构成，以报告伤口床内氧的相对水平(d)。图34：实例14试验2中伤口床内相对氧合水平的比率法图像。每个时间点双次运载体(上半部分)和双次vegf-a修饰的rna(下半部分)处理的伤口的代表性亮视野和比率法图像。伤口边界以黑色勾勒出来。图35：通过来自伤口床中的氧敏感性纳米粒子的荧光和磷光的图像分析来定量氧合。计算伤口床的每个原始荧光到磷光图像的灰度均值。呈现的数据为均值±sem，*p<0.05针对vegf-a修饰的rna双次注射(右条)相对于运载体双次注射(左条)的灰度均值。图36：实例14中试验2的伤口愈合曲线。将来自三名独立的观察者的中值的平均归一化开放伤口面积针对手术后天数绘图。呈现的数据为均值±sem，*p<0.05针对分别在第6天进行的vegf-a修饰的rna双次注射(空心正方形)相对于运载体双次注射(空心圆)的更小开放伤口面积。对应地，曲线下面积为运载体双次注射641.31和vegf-a修饰的rna双次注射604.35。图37：来自实例14中试验2的伤口愈合曲线的三次样条插值。构建三次样条插值以接近到25％、50％和75％闭合的时间，如灰色虚线所证明的。呈现的数据是来自三名观察员的中值的归一化开放伤口面积的均值。#：p<0.05针对vegf-a修饰的rna双次注射(空心正方形)相对于双次运载体注射(空心圆)。图38：实例14中试验2的时间点之间的伤口愈合百分比。使用归一化伤口面积数据在每个时间点之间计算伤口闭合的平均百分比。呈现的数据为均值±sem；*p<0.05针对第3天至第6天vegf-a修饰的rna双次注射(右条)相对于运载体双次注射(左条)的更高伤口闭合平均百分比。图39：小鼠耳朵中对高剂量vegf-a修饰的rna的血管反应的光声显微镜检查。第一排：血管结构；第二排：so2(％)；第三排：血流速度(mm/s)。虚线圆：注射部位。第3排中的箭头：具有显著上调的血流的血管。第一排之上的标签指示皮内注射vegf-a修饰的rna(100μg)后的时间。图40：皮内注射高剂量vegf-a修饰的rna的小鼠耳中的新血管形成和血管生成。在皮内注射100μgvegf-a修饰的rna的小鼠耳中的新血管(由箭头标记，第二排)和血管生成的放大图像。放大区域由第一排中的虚线正方形指示。第一排之上的标签指示皮内注射vegf-a修饰的rna(100μg)后的时间。图41：小鼠耳朵中对低剂量vegf-a修饰的rna的血管反应的光声显微镜检查。第一排：血管结构；第二排：so2(％)；第三排：血流速度(mm/s)。虚线圆：注射部位。第一排之上的标签指示皮内注射vegf-a修饰的rna(10μg)后的时间。图42：小鼠耳朵中对人重组vegf-a蛋白的血管反应的光声显微镜检查。第一排：血管结构；第二排：so2(％)；第三排：血流速度(mm/s)。虚线圆：注射部位。第一排之上的标签指示皮内注射人重组vegf-a蛋白(1μg)后的时间。第三排箭头指示了具有明显流量上调的血管。图43：小鼠耳朵中对柠檬酸盐/盐水的血管反应的光声显微镜检查。第一排：血管结构；第二排：so2(％)；第三排：血流速度(mm/s)。虚线圆：注射部位。第一排之上的标签指示皮内注射柠檬酸盐/盐水(10μl)后的时间。图44：vegf-a修饰的rna、人重组vegf-a蛋白和柠檬酸盐/盐水对小鼠耳中血管反应的影响。由皮内注射vegf-a修饰的rna(100μg，实心正方形)、人重组vegf-a蛋白(1μg，实心三角形)或柠檬酸盐/盐水(10μl，实心圆)诱导的小鼠耳中的急性和长期血管反应(左图为血管直径且右图为容积血流量)的定量分析。显示的值为均值±sd，n＝3只/组。图45：小鼠耳中注射vegf-a修饰的rna后对微血管流量和氧饱和度的影响。将vegf-a修饰的rna(100μg)皮内注射入小鼠耳中。在注射前(基线)和7天后评估微血管流量(图a)和氧饱和度(图b)。图46：小鼠耳中注射重组人vegf-a蛋白后对微血管流量和氧饱和度的影响。将重组人vegf-a蛋白(1μg)皮内注射入小鼠耳中。在注射前(基线)和7天后评估微血管流量(图a)和氧饱和度(图b)。图47：小鼠耳中注射柠檬酸盐/盐水运载体后对微血管流量和氧饱和度的影响。将柠檬酸盐/盐水运载体(10μg)皮内注射入小鼠耳中。在注射前(基线)和7天后评估微血管流量(图a)和氧饱和度(图b)。图48a和图48b：图48a中示出了实例16的实验设计。48b中示出了实例16的vegf-a修饰的rna注射的布局。图49：来自皮内注射vegf-a修饰的rna的兔的微量透析洗脱物中的人vegf-a浓度。来自皮内插入兔后腿的100kda微量透析探针的洗脱物中的人vegf-a浓度。呈现的值是均值±sem。在t＝0h开始微量透析，并且在t＝1h时给予4次vegf-a修饰的rna注射(每次50μg)的id注射。点划线表示定量下限(lloq，33.4pg/ml)。每只兔子插入两只探针，n＝4只兔子。图50a、图50b和图50c：体内向患心肌梗塞的猪心内注射人vegf-a修饰的rna后对毛细血管密度(图50a)、小动脉密度(图50b)和纤维化(图50c)的影响。使小型猪经受左前降支冠状动脉的永久性结扎，并在7天后，心外膜注射vegf-a修饰的rna(1mg，实心灰条(n＝8)或10mg，阴影线条(n＝8))或柠檬酸盐/盐水(实心黑条，n＝8)。一个单独组的动物进行假手术(冠状动脉未结扎并且未给予心外膜注射(空心条，n＝5))。结扎两个月后，终结动物，并收获心脏组织以评估梗塞周围(边界)区域中的毛细血管密度(图50a)。显示为均值±sem。*：p<0.05和***：p<0.001，相对于柠檬酸盐/盐水处理的动物(单向anova和邓尼特事后检验(dunnett’sposttest))。在图50b中，结扎两个月后，终结动物，并收获心脏组织以评估梗塞周围(边界)区域中的小动脉密度。显示为均值±sem。**：p<0.0，相对于柠檬酸盐/盐水处理的动物(单向anova和邓尼特事后检验(dunnett’sposttest))。在图50c中，结扎两个月后，终结动物，并收获心脏组织以评估远离梗塞区域的纤维化(胶原蛋白沉积)。显示为均值±sem。*：p<0.05和**：p<0.01，相对于柠檬酸盐/盐水处理的动物(单向anova和邓尼特事后检验(dunnett’sposttest))。图51：在人主动脉平滑肌细胞(haosmc，空心圆)和衍生自诱导多能细胞的人心肌细胞(hips-cm，实心三角形)中，vegf-a修饰的rna转染后人vegf-a蛋白生产的时间曲线。显示的数据为均值±sem。图52a和图52b：图52a示出了在正常非梗塞小鼠心脏(对照)中和在组织收获前3、7或14天经历左前降支冠状动脉永久闭塞的心脏中，作为心外膜衍生细胞(epdc)的标志物的维耳姆瘤1转录因子(wt-1)的免疫组织化学。箭头指示wt-1表达。图52b示出了在正常非梗塞小鼠心脏(对照)中和在组织收获前3、7或14天经历左前降支冠状动脉永久闭塞的心脏中wt-1+细胞发生的评分。mi：心肌梗塞。*：p<0.05，***：p<0.001，相对于每个研究组中对照，n＝3-5。5.详细说明将引用的所有参考文献以其全文通过引用结合在此。本披露所属领域的技术人员可从前文描述和相关附图中获益进而想出本文阐述的披露内容的许多改进形式和其他实施例。因此，应当理解本披露不限于披露的具体实施例，改进和其他实施例旨在包括于所附权利要求书的范围内。尽管其中使用特殊术语，它们仅以通用和描述性意义而非限制目的使用。单位、前缀以及符号可以其si公认的形式来表示。除非另有指明，对应地，核酸以5’至3’方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸可以在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由iupac-iub生物化学命名委员会(iupac-iubbiochemicalnomenclaturecommission)推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过它们的普遍公认的单字母代码而被提及。以下定义的术语总体上参照说明书而更完整地定义。5.1.定义除非另外确切定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。除非另有说明，本文采用或考虑的技术是本领域普通技术人员熟知的标准方法。除非另外说明，本披露的实践将使用本领域技术范围内的微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学以及重组dna技术的常规技术。这些材料、方法、和实例仅是说明性的并且不是限制性的。以下通过说明的方式呈现，并非意在限制本披露的范围。在一些实施例中，在说明书中阐述的数字参数(权利要求全部并入其中)是近似值，其可以根据由特定实施例寻求获得的期望性质而变化。在一些实施例中，这些数值参数应该按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术来解释。虽然阐述本披露的一些实施例的广泛范围的数字范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可能地精确地报道。在本披露的一些实施例中呈现的数值可含有由其各自测试测量中发现的标准偏差必然导致的某些误差。本文中对数值范围的描述仅旨在用作逐个提及落入该范围内的各个独立值的一种简化方法。除非在本文中另有说明，否则将各个独立的值并入说明书中，就如同在本文中对它进行了逐个描述一样。为方便，这里收集了在整个申请(包括本说明书、实例和所附权利要求书)中使用的某些术语。除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。如本文使用的，术语“给予”是指通过使得药物组合物或药物配制品至少部分定位在期望的部位或组织位置的方法或途径，将包含至少一种经修饰的rna的药物组合物或药物配制品置入受试者中。在一些实施例中，包含经修饰的rna的药物组合物或药物配制品可以通过导致受试者有效治疗的任何适当途径给予，即给药导致递送至受试者的期望位置或组织，其中至少一部分由经修饰的rna表达的蛋白质位于期望的靶组织或靶细胞位置处。可以肌内、经动脉、腹膜内、静脉内、动脉内、皮下、心室内、皮内、心内、经心外膜，通过门静脉导管、通过冠状窦导管和/或直接给予到待治疗的区域中进行给药。药物组合物是针对每种给予途径特别配制的，得到给药特异性药物配制品。本文使用的术语“组合物”通常被理解为构成某物的至少两个部分或元素的组合。例如，本文使用的组合物通常包含根据本披露的至少一种多核苷酸、主要构建体或经修饰的rna以及合适的载体或赋形剂。术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有那一个或多个步骤，并且还可以涵盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物不限于仅具有那一个或多个特征并且可以涵盖其他未列出的特征。在此描述的所有方法可以按任何适合的顺序进行，除非在此另外指示或明显地与上下文矛盾。本文关于某些实施例提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本披露，而不对另外要求保护的本披露范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本披露所必需的。术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤“以及实质上不影响(要求保护的发明的)一个或多个基本和新颖特征的那些”。关于herz，537f.2d549,551-52,190uspq461,463(ccpa1976)(原文中的重点)(现有技术的液压流体需要一种分散剂，上诉人认为其被排除在限于“基本上由(某些部件)组成”的功能流体的权利要求之外。术语“由……组成”是指如在此所述的组合物、方法、及其对应的组分，其排除在该实施例的这个说明中没有描述的任何要素。术语“疾病”或“障碍”在本文中可互换使用，并且是指身体或一些器官状态的任何交替，中断或干扰功能的表现和/或引起患病的人或与人接触的那些诸如不适、功能障碍、危难、或甚至死亡的症状。疾病或障碍也可与瘟热、病态(ailing)、小病(ailment)、病疾(malady)、患病(sickness)、病(illness)、抱怨、不舒服或感染有关。如本文使用的，术语“对vegf-a疗法有反应的疾病”是指在给予包含vegf-a蛋白的药物组合物或药物配制品或能够产生vegf-a蛋白的试剂例如本文披露的经修饰的rna之后显示一种或多种症状或临床标志物的改善的障碍。可替代地，如果给予包含vegf-a蛋白的药物组合物或药物配制品或能够产生vegf-a蛋白的试剂会减少或停止疾病的进展，则该疾病对vegf-a疗法是“有反应的”。有益或所希望的临床结果包括但不限于一个或多个症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定化(即未恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、以及减轻(无论是部分减轻还是全部减轻)。如本文使用的，术语“二价阳离子”是指具有正价2的离子物质。例如，镁离子mg2+和钙离子ca2+是二价阳离子。“剂型”是其中产生和分配药物(例如，经修饰的rna)的物理形式，例如片剂(包衣、延迟释放、可分散等)、胶囊、软膏、或注射剂(粉末、溶液)。短语“药物产品”是指通常含有活性药物成分(例如经修饰的rna)但不一定与非活性成分相关联的成品剂型，例如片剂、胶囊、溶液等。本文使用的术语“有效量”是指足以减少疾病或障碍的至少一种或多种症状或提供期望的效果的治疗剂(例如修饰的rna)、药物组合物或药物配制品的量。例如，当给予具有心血管病症或者其他疾病或障碍的典型受试者时，该量可以是影响与心脏功能障碍或其他障碍相关的症状或临床标志物的治疗性或预防性显著降低的量。如本文使用的，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从dna序列产生rna模板(例如通过转录)；(2)rna转录物的加工(例如通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’末端加工)；(3)将rna翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。本文使用的术语“配制品”或“药物配制品”是指包含含有活性药物成分(例如经修饰的rna)以及药学上可接受的载体/稀释剂/赋形剂的药物混合物或溶液且适合于经由特定给药途径给予哺乳动物(例如，有需要的人)的组合物类型。例如，本文使用的“配制品”可被特别配制成包括适合的递送剂和/或其他药学上可接受的载体，以用于经由多种途径诸如经由肌内、皮内、皮下或心内途径中的一种或多种，通过门静脉导管、通过冠状窦导管、和/或通过直接给予到待治疗的区域来给予。“配制品”因此可以被理解为特别配制用于特定给药途径的组合物。配制品可以是以特定剂型存在的组合物。如本文使用的，术语“经修饰的rna”是指与腺苷(a)((2r,3r,4s,5r)-2-(6-氨基-9h-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)氧杂戊环-3,4-二醇)、鸟苷(g)(2-氨基-9-[3,4-二羟基-5-(羟基甲基)氧杂戊环-2-基]-3h-嘌呤-6-酮)、胞苷(c)(4-氨基-1-[3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2-酮)和尿苷(u)(1-[(3r,4s,5r)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)氧杂戊环-2-基]嘧啶-2,4-二酮)相比，或与rna分子中的amp、gmp、cmp和ump或其一部分相比，包含一处、两处或多于两处核苷修饰的rna分子。在本说明书的其他地方提供了核苷修饰的非限制性实例。另外，当特定要求保护的rna的核苷酸序列与天然存在的rna分子的序列相同时，经修饰的rna被理解为是具有与天然对应物存在的那些不同的至少一处修饰的rna分子。差异可在于核苷/核苷酸的化学变化或序列内该变化的位置。在一个实施例中，经修饰的rna是经修饰的信使rna(或“经修饰的mrna”)。如本文使用的，术语“调节生理过程”是指活生物及其部分如细胞或组织的不同功能和物理或化学操作的调节。例如，对于其中vegf-a起着核心作用的生理过程，调节可以包括诱导血管生成、刺激血管细胞增殖、增加心外膜衍生的祖细胞的增殖和/或改变心外膜衍生的祖细胞的命运、上调内皮化、诱导心脏再生、增加组织移植物的血管再生以用于伤口愈合、改善血管功能、增加组织灌注和新血管形成、减少瘢痕组织、增加前负荷补充搏功(prsw)、增加最高压发展、增加肌力功能、增加左心室射血分数(lvef)、减少与心脏功能障碍相关的生物标志物(例如，nt-probnp，bnp，hstnt和hstni)水平、减少梗塞尺寸、减少心脏组织的纤维化和/或改善心脏功能。如本文使用的，术语“核酸”在其最广泛的意义上包括包含通过磷酸二酯键连接的核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物通常称为寡核苷酸或多核苷酸，这取决于大小。术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本文中也可互换使用。本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围，适合用于与人类和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。药物审批机构(例如ema，us-fda)提供指导并审批药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型。实例可列在药典中。术语“药学上可接受的赋形剂”在本文中用于指代选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物的药学上可接受的物质。在一些实施例中，该溶剂是水性溶剂。如本文使用的，“多肽”意指很多时候由肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然的)的聚合物。如本文使用的，该术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽以及肽。多肽可以是单分子或者可以是多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽例如抗体或胰岛素，并且可以缔合或连接。最常见的二硫键见于多链多肽中。术语多肽还可以适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的一种人工化学类似物。如本文使用的，“蛋白质”是基本上由20个氨基酸中的任何氨基酸组成的聚合物。虽然“多肽”通常用于提及相对较大的多肽，而“肽”通常用于提及小多肽，但本领域中这些术语的使用重叠并且是变化的。本文中术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”有时可以互换使用。如本文使用的，术语“重组体”是指通过使用已经通过引入“异源核酸”或改变天然核酸进行遗传操作的核酸，蛋白质从原核或真核表达系统衍生。术语“统计学上显著”或“显著”是指统计学显著性。这个术语是指统计学证据表明有差异。当零假设实际为真时，可以将其定义为作出拒绝零假设的决策的概率。通常使用p值进行决策。可以使用本领域众所周知的具有显著重要性的任何其他量度。术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指用此处所述的方法和组合物向其提供治疗(包括预防性治疗)的动物，例如人。对于治疗对特定的动物如人类受试者是特异性的那些病症或疾病状态，术语受试者是指该特定的动物。术语“基本上不含”是指其中组合物或配制品不具有显著量的特定元素的情况。例如，“基本上不含”二价阳离子的组合物或配制品含有很少或没有二价阳离子。如本文使用的，“患有”疾病、障碍、和/或病症的受试者或个体已经诊断为或显示出疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状。在一些实施例中，受试者可有患疾病、障碍和/或病症的风险。术语“组织”是指一起执行某些特定功能的类似特化细胞的组或层。术语“组织特异性”是指来自特定组织的细胞的来源或定义特征。如本文使用的，术语“治疗(treat或treatment或treating)”是指治疗性治疗，其中目的是预防或减缓疾病的发展，例如减缓心脏疾病的发展，或减少血管病症、疾病或障碍(例如以不充分或不期望的心脏功能为特征的任何障碍)的至少一种不利影响或症状。应当理解的是，本披露不限于在此所述的特定方法、方案、以及试剂等等，并且本身可以变化。在此所使用的术语的目的仅在于描述特定的实施例，并且不意在限制本披露的范围，本披露的范围仅由权利要求书限定。5.2.编码vegf-a多肽的经修饰的rna它在治疗剂、诊断剂、试剂和生物测定能够在细胞内(无论是体外、体内、原位或离体)递送核酸例如核糖核酸(rna)例如以引起核酸的细胞内翻译和所编码的感兴趣多肽的产生的领域中具有极大意义。天然存在的rna由四种碱基核糖核苷酸：atp、ctp、utp和gtp合成，但可含有转录后修饰的核苷酸。此外，已经在rna中鉴定了大约一百种不同的核苷修饰(罗森希(rozenski)，j，克雷恩(crain)，p和麦克洛斯基(mccloskey)，j.，rna修饰数据库(thernamodificationdatabase)：1999更新，核酸研究(nuclacidsres)，(1999)27：196-197)。根据本披露，优选地修饰这些rna以避免本领域其他rna分子的缺陷(例如，激活先天免疫应答并在给予时快速降解)。因此，这些多核苷酸被称为经修饰的rna。在一些实施例中，经修饰的rna在给予受试者时避免了先天免疫应答。在一些实施例中，与未经修饰的rna相比，经修饰的rna的半衰期延长。在优选的实施例中，该rna分子是信使rna(mrna)。如本文使用的，术语“信使rna”(mrna)是指编码感兴趣的多肽并且能够体外、体内、原位或离体翻译产生所编码的感兴趣多肽的任何多核苷酸。如图1a所示，传统上，mrna分子的基本组分至少包括编码区、5’非翻译区(utr)、3’非翻译区(utr)、5’帽和聚(a)尾。基于这种野生型模块化结构，本披露通过提供保持模块化组织但包含一个或多个赋予多核苷酸有用性质的结构修饰和/或化学修饰或者改变(在一些实施例中，包括缺乏对细胞(其中引入多核苷酸)的先天免疫应答的实质诱导)的多核苷酸或初级rna构建体来扩展传统mrna分子的功能范围。经修饰的rna可以包括相对于标准rna核苷酸链，对例如糖、核碱基(例如，核碱基的一个或多个修饰，例如通过用任选取代的氨基、任选取代的硫基、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤素(例如氯或氟)替换或取代嘧啶核碱基的原子))或核苷间键(例如，对磷酸二酯骨架的一个或多个修饰)的任何有用的修饰。经修饰的rna可任选地包括其他试剂(例如rnai诱导剂、rnai试剂、sirna、shrna、mirna、反义rna、核酶、催化dna、trna、诱导三螺旋形成的rna、适配体、载体等)。美国专利申请公开号2014/0073687披露了具有若干有用修饰的示例性的经修饰的rna，这些修饰例如至少一个或多个选自以下项的经修饰的核苷：5-甲基胞苷(5mc)、n6-甲基腺苷(m6a)、3,2’-o-二甲基尿苷(m4u)、2-硫尿苷(s2u)、2’-氟尿苷、假尿苷、2’-o-甲基尿苷(um)、2’脱氧尿苷(2’du)、4-硫尿苷(s4u)、5-甲基尿苷(m5u)、2’-o-甲基腺苷(m6a)、n6,2’-o-二甲基腺苷(m6am)、n6,n6,2’-o-三甲基腺苷(m62am)、2’-o-甲基胞苷(cm)、7-甲基鸟苷(m7g)、2’-o-甲基鸟苷(gm)、n2,7-二甲基鸟苷(m-2,7g)、n2,n2,7-三甲基鸟苷(m-2,2,7g)。在2014年10月7日提交的美国专利申请公开号2015/0051268和2014年2月3日提交的美国专利号9,061,059中描述了另外的修饰。因此，这些修饰全部通过引用以其全部内容结合在此。本文描述了其他修饰。作为非限制性实例，在一些实施例中，经修饰的rna可包括例如经修饰以形成n1-甲基-假ump的至少一个一磷酸尿苷(ump)。在一些实施例中，n1-甲基-假ump代替ump，以0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的ump百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有ump已经被n1-甲基-假ump替代。在一些实施例中，经修饰的rna可以(进一步)包括例如经修饰以形成甲基-cmp的至少一个一磷酸胞苷(cmp)。在一些实施例中，甲基-cmp代替cmp，以选自0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的cmp百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有cmp已经被5-甲基-cmp替代。在一些实施例中，经修饰的rna可以(进一步)包括例如经修饰以形成n6-甲基-amp的至少一个一磷酸腺苷(amp)。在一些实施例中，n6-甲基-amp代替amp，以选自0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的amp百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有amp已经被n6-甲基-amp替代。在一些实施例中，经修饰的rna可以(进一步)包括例如经修饰以形成7-甲基-gmp的至少一个一磷酸鸟苷(gmp)。在一些实施例中，7-甲基-gmp代替gmp，以选自0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的gmp百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有gmp已经被7-甲基-gmp替代。在一些实施例中，经修饰的rna可以(进一步)包括例如选自以下项的至少一个或多个经修饰的核苷：5-甲基胞苷(5mc)、n6-甲基腺苷(m6a)、3,2’-o-二甲基尿苷(m4u)、2-硫尿苷(s2u)、2’-氟尿苷、假尿苷、2’-o-甲基尿苷(um)、2’脱氧尿苷(2’du)、4-硫尿苷(s4u)、5-甲基尿苷(m5u)、2’-o-甲基腺苷(m6a)、n6,2’-o-二甲基腺苷(m6am)、n6,n6,2’-o-三甲基腺苷(m62am)、2’-o-甲基胞苷(cm)、7-甲基鸟苷(m7g)、2’-o-甲基鸟苷(gm)、n2,7-二甲基鸟苷(m-2,7g)、n2,n2,7-三甲基鸟苷(m-2,2,7g)以及n1-甲基-假尿苷，或其任何组合。每种可能性和组合代表本披露独立的实施例。在一些实施例中，经修饰的rna包含对5’帽的修饰，例如5’二鸟苷帽。在一些实施例中，经修饰的rna包含对编码区的修饰。在一些实施例中，经修饰的rna包含对5’utr的修饰。在一些实施例中，经修饰的rna包含对3’utr的修饰。在一些实施例中，经修饰的rna包含对聚(a)尾的修饰。在一些实施例中，经修饰的rna包含对编码区、5’帽、5’utrl、3’utr或聚(a)尾的修饰的任何组合。在一些实施例中，经修饰的rna可任选地用碱性磷酸酶处理。在一些实施例中，经修饰的rna编码血管内皮生长因子(vegf)多肽，即一般在控制心血管生理功能中(并且特别在动脉生成中)起核心作用的vegf蛋白的大家族中的任何一个(福尔摩斯(holmes)di等人，基因组生物学(genomebiol.)，(2005)6(2)：209)。vegf的作用还包括一氧化氮(no)信号传导的激活、血管通透性、发育性和产后血管生成、肿瘤血管生成、动脉生成、内皮细胞复制以及多潜能心血管祖细胞的细胞命运转变。本领域技术人员将理解，对于任何特定的vegf基因，可存在一种或多种变体或同种型。根据本披露的vegf-a多肽的非限制性实例列于表1中。本领域技术人员将理解，表1中披露的序列含有潜在的侧翼区。这些在每个核苷酸序列中编码到开放阅读框的5’(上游)或3’(下游)。通过教示核苷酸参考序列明确且具体地披露了开放阅读框。还可以通过利用一个或多个可用数据库或算法来进一步表征5’和3’侧翼区。数据库已经注释了包含在ncbi序列的侧翼区中的这些特征，并且这些在本领域中是可用的。表1：智人vegf-amrna同种型。本领域技术人员将理解，可以根据表1中列出的vegf-amrna同种型设计编码vegf-a多肽例如人vegf-a多肽的rna分子。本领域普通技术人员通常熟悉剩余vegf家族成员的多种同种型。在一个实施例中，本披露提供编码vegf-a多肽(例如seqidno:2)的经修饰的rna。在一些实施例中，经修饰的rna编码vegf-a多肽，其中经修饰的rna包含seqidno:1。在一些实施例中，经修饰的rna还包含5’帽、5’utr、3’utr、聚(a)尾或其任何组合。在一些实施例中，5’帽、5’utr、3’utr、聚(a)尾或其任何组合可以包括一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，编码vegf-a多肽的经修饰的rna可以具有如图1b所描绘的结构，其为seqidno:1。在一些实施例中，经修饰的rna编码vegf多肽，其中经修饰的rna包含seqidno:1的核酸序列内的一个或多个经修饰的ump核苷酸。在一些实施例中，编码vegf-a多肽的经修饰的rna可以包括，例如，至少一个ump被修饰以形成n1-甲基-假ump。在一些实施例中，n1-甲基-假ump代替ump，以选自0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的ump百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有ump已经被n1-甲基-假ump替代。在一些实施例中，经修饰的rna编码vegf多肽，其中经修饰的rna(进一步)包含seqidno:1的核酸序列内的一个或多个cmp修饰的核苷酸。在一些实施例中，编码vegf-a多肽的经修饰的rna可以包括，例如，至少一个cmp被修饰以形成甲基-ccp。在一些实施例中，甲基-cmp代替cmp，以选自0.1％、2％、3％、4％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的cmp百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有cmp已经被5-甲基-cmp替代。在一些实施例中，经修饰的rna编码vegf多肽，其中经修饰的rna(进一步)包含seqidno:1的核酸序列内的一个或多个amp修饰的核苷酸。在一些实施例中，编码vegf-a多肽的经修饰的rna可以包括，例如，至少一个amp被修饰以形成n6-甲基-amp。在一些实施例中，n6-甲基-amp代替amp，以选自0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的amp百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有amp已经被n6-甲基-amp替代。在一些实施例中，经修饰的rna编码vegf多肽，其中经修饰的rna(进一步)包含seqidno:1的核酸序列内的一个或多个经修饰的gmp核苷酸。在一些实施例中，经修饰的rna可以包括，例如，至少一个gmp被修饰以形成7-甲基-gmp。在一些实施例中，7-甲基-gmp代替gmp，以选自0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％和100％的gmp百分比存在于序列中。在一些实施例中，所有gmp已经被7-甲基-gmp替代。在一些实施例中，经修饰的rna编码vegf多肽，其中经修饰的rna(进一步)包含seqidno:1的核酸序列内的一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，编码vegf-a多肽的经修饰的rna可以包括例如选自以下项的至少一个或多个经修饰的核苷：5-甲基胞苷(5mc)、n6-甲基腺苷(m6a)、3,2’-o-二甲基尿苷(m4u)、2-硫尿苷(s2u)、2’-氟尿苷、假尿苷、2’-o-甲基尿苷(um)、2’脱氧尿苷(2’du)、4-硫尿苷(s4u)、5-甲基尿苷(m5u)、2’-o-甲基腺苷(m6a)、n6,2’-o-二甲基腺苷(m6am)、n6,n6,2’-o-三甲基腺苷(m62am)、2’-o-甲基胞苷(cm)、7-甲基鸟苷(m7g)、2’-o-甲基鸟苷(gm)、n2,7-二甲基鸟苷(m-2,7g)、n2,n2,7-三甲基鸟苷(m-2,2,7g)以及n1-甲基-假尿苷，或其任何组合。每种可能性和组合代表本披露独立的实施例。5.3.包含经修饰的rna的组合物一些实施例涉及包含披露的经修饰的rna的组合物，包括特定配制品。在一些实施例中，配制品包含药学上有效量的一种或多种经修饰的rna。在一些实施例中，药物组合物可包含基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子)中的至少一种或多种经修饰的rna。通常，脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子可用于改善多核苷酸、初级构建体或经修饰的rna定向的蛋白质生产的功效，因为这些配制品可能能够通过多核苷酸、初级构建体或经修饰的rna增加细胞转染；和/或增加编码蛋白的翻译。一个这样的实例涉及使用脂质包封来实现多聚复合物质粒dna的有效系统递送(海斯(heyes)等人，分子疗法(molther.)(2007)15：713-720；通过引用以其全部内容结合在此)。脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子也可用于增加多核苷酸、初级构建体或经修饰的rna的稳定性。因此，在一些实施例中，经修饰的rna的药物组合物包括脂质体。脂质体是人工制备的囊泡，其主要可以由脂质双层组成，并且可以用作给予营养物和药物配制品的递送运载体。脂质体可以具有不同的大小，例如但不限于直径可以是数百纳米并且可以含有由狭窄水性区室隔开的一系列同心双层的多层囊泡(mlv)、直径可以小于50nm的小单室囊泡(suv)、以及直径可以在50和500nm之间的大单层囊泡(luv)。脂质体设计可以包括但不限于调理素或配体，以改善脂质体与不健康组织的连接或以便激活事件，例如但不限于胞吞。为了改善药物组合物的递送，脂质体可以含有低或高ph。在一些实施例中，经修饰的rna的药物组合物包括脂质复合物，例如但不限于来自静默治疗公司(silencetherapeutics)(伦敦，英国)的atuplextm系统、dacc系统、dbtc系统和其他sirna-脂质复合物技术，来自(剑桥，麻萨诸塞州)的stemfecttm以及聚乙烯亚胺(pei)或基于鱼精蛋白的靶向和非靶向核酸递送(阿莱库(aleku)等人，癌症研究(cancerres.)，(2008)68：9788-9798；斯特鲁姆柏格(strumberg)等人，国际临床药物治疗杂志(intjclinpharmacolther)，(2012)50：76-78；桑特尔(santel)等人，基因疗法(genether.)，(2006)13：1222-1234；桑特尔(santel)等人，基因疗法(genether.)，(2006)13：1360-1370；格特比尔(gutbier)等人，肺病药物治疗(pulmpharmacol.ther.)，(2010)23：334-344；考夫曼(kaufmann)等人，微血管研究(microvascres)，(2010)80：286-293；魏德(weide)等人，免疫治疗杂志(jimmunother.)，(2009)32：498-507；魏德(weide)等人，免疫治疗杂志(j.immunother.)，(2008)31：180-188；帕斯科洛(pascolo)，生物疗法的专家意见(expertopin.biol.ther)4：1285-1294；夫廷-莫雷克泽科(fotin-mleczek)等人，免疫治疗杂志(j.immunother)，(2011)34：1-15；宋(song)等人，自然生物技术(naturebiotechnol.)，(2005)23：709-717；皮尔(peer)等人，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa.)，(2007)6；104：4095-4100；德富热罗莱(defougerolles)，人类基因疗法(humgenether.)，(2008)19：125-132；所有这些通过引用以其全部内容结合在此)。在一些实施例中，经修饰的rna的药物组合物包括固体脂质纳米粒子。固体脂质纳米粒子(sln)可以是平均直径在10至1000nm之间的球形。sln具有可溶解亲脂性分子并可用表面活性剂和/或乳化剂稳定的固体脂质核心基质。在另一个实施例中，脂质纳米粒子可以是自组装脂质-聚合物纳米粒子(参见张(zhang)等人，acs纳米(acsnano)，2008，2(8)，第1696-1702页；通过引用以其全部内容结合在此)。在美国专利申请公开号2015/0051268中讨论了另外的基于脂质的组合物；将其通过引用以其全部内容结合在此。因此，在一些实施例中，根据本披露的经修饰的rna的药物配制品如在美国专利申请公开号2015/0051268中所讨论的基于脂质的配制品来配制。在本披露的一些实施例中，经修饰的rna的药物配制品不包括任何基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子)，并且在本文中称为裸rna配制品。wo2012/103985已经提出，裸rna仅在二价阳离子(优选钙)的存在下配制时，才能渗透细胞。此外，其他研究已经提出并表明需要钙来将裸rna分子引入动物组织体内(沃尔夫(wolff)j.a.等人，科学(science)，(1999)，247，1465-1468)。类似地，普罗布斯特(probst)等人显示在体内注射裸rna强烈依赖于注射液中钙的存在(普罗布斯特(probst)j.等人，基因疗法(genether.)，(2007)14，1175-1180)。因此，这些关于将裸rna递送到细胞和组织中的研究强烈地提出在配制品中需要钙。然而，在本披露的一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液配制裸的经修饰的rna。例如，经修饰的rna可以用基本上不含二价阳离子的ph7.4pbs缓冲液配制。在一些实施例中，经修饰的rna可以用基本上不含钙或镁的ph7.4pbs缓冲液配制。在一些实施例中，经修饰的rna可以用不含钙或镁的ph7.4pbs缓冲液配制。在一些实施例中，用柠檬酸盐盐水缓冲液配制裸的经修饰的rna。例如，经修饰的rna可以用基本上不含二价阳离子的ph7.0柠檬酸盐盐水缓冲液配制。在一些实施例中，经修饰的rna可以用基本上不含钙或镁的ph7.0柠檬酸盐盐水缓冲液配制。在一些实施例中，经修饰的rna可以用不含钙或镁的ph7.0柠檬酸盐盐水缓冲液配制。例如，可以用ph7.0柠檬酸盐盐水缓冲液(含有10mmol/l柠檬酸盐、130mmol/l氯化钠，于hyclone水中)配制经修饰的rna，其中柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。在一些实施例中，用氨丁三醇(tham)缓冲液配制裸的经修饰的rna。例如，经修饰的rna可以用基本上不含二价阳离子的ph8.0tham缓冲液配制。在一些实施例中，经修饰的rna可以用基本上不含钙或镁的tham缓冲液配制。在一些实施例中，经修饰的rna可以用不含钙或镁的ph8.0tham缓冲液配制。例如，经修饰的rna可以用ph8.0tham缓冲液(氨丁三醇aka2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇，300mmol/ltris-hcl)配制，其中tham缓冲液不含钙或镁。在一些实施例中，当适合于所希望的具体剂型时，裸rna药物配制品可以另外包含药学上可接受的赋形剂，其如本文使用的，包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体运载体、分散体或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。赋形剂还可以包括但不限于聚合物、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、纳米粒子模拟物及其组合。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见雷明顿：药学科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)，第22版，艾伦(allen)，劳埃德(loyd)v.，jr编辑，医药出版社(pharmaceuticalpress)；通过引用以其全部内容结合在此)。可以在本披露的范围内考虑使用常规赋形剂介质，除非任何常规的赋形剂介质可能与一种物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不期望的生物效应或另外以有害的方式与药物组合物的一种或多种任何其他组分相互作用。在一些实施例中，裸rna配制品包含药学上有效量的一种或多种经修饰的rna，其中该配制品包含磷酸盐缓冲盐水缓冲液，并且还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，该药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。在一些实施例中，该溶剂是水性溶剂。在一些实施例中，该溶剂是非水性溶剂。在一些实施例中，裸rna配制品包含药学上有效量的一种或多种经修饰的rna，其中该配制品包含tham缓冲液，并且还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，该药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。在一些实施例中，该溶剂是水性溶剂。在一些实施例中，裸rna配制品包含药学上有效量的一种或多种经修饰的rna，其中该配制品包含柠檬酸盐盐水缓冲液，并且还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，该药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。在一些实施例中，该溶剂是水性溶剂。在某些实施例中，包含根据本披露的经修饰的rna的配制品处于基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子)、磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中，浓度在0.1和1μg/μl之间。在一些实施例中，将包含根据本披露的经修饰的rna的配制品配制于基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子)、磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中，浓度在1和10μg/μl之间。在一些实施例中，将包含根据本披露的经修饰的rna的配制品配制于基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子)、磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中，浓度在10和50μg/μl之间。在优选的实施例中，包含根据本披露的经修饰的rna的裸rna配制品包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，与基于脂质的配制品相比，配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的包含编码vegf-a多肽的经修饰的rna的裸rna配制品对受试者的毒性更低。5.4.治疗患有对vegf-a疗法有反应的疾病的受试者具有vegf-a表达不足的受试者可患有许多血管疾病，包括但不限于具有减少或保留的射血分数的心力衰竭、肾脏疾病、涉及皮肤移植和组织移植的疾病、mi后心脏功能障碍、缺血性心脏病、来自创伤或手术的血管损伤、包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡、严重肢体缺血、肺动脉高压和外周动脉疾病。本披露的目的是通过直接给予编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna分子来治疗患有对vegf-a疗法有反应的疾病的受试者。在一些实施例中，裸vegf-arna是在没有脂质和钙的柠檬酸盐盐水缓冲液中给予受试者。通常，引入细胞中的外源性核酸诱导先天免疫应答，导致干扰素(ifn)产生和细胞死亡。然而，经修饰的rna已经克服了这些问题中的至少一些，并且对治疗剂、诊断剂、试剂和生物测定在细胞内(无论是体内或离体)递送核酸例如核糖核酸(rna)例如以引起核酸的细胞内翻译和所编码的蛋白质的产生具有极大意义。经修饰的rna和从本文所述的经修饰的rna翻译的蛋白质可用作治疗剂。例如，此处所述的经修饰的rna可以给予受试者，其中经修饰的rna被翻译以产生受试者中任何vegf家族成员的治疗性蛋白质或其片段。提供了用于治疗人和其他哺乳动物中的疾病或病症的方法。此处所述的针对vegf-a的所有配制品可以与任何其他vegf家族成员一致地使用。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的组合物和特定配制品可用于治疗以下疾病，诸如具有减少或保留的射血分数的心力衰竭、肾脏疾病、涉及皮肤移植和组织移植的疾病、mi后心脏功能障碍、缺血性心脏病、来自创伤或手术的血管损伤、包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡、治愈伤口如撕裂、严重肢体缺血、肺动脉高压和外周动脉疾病。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗具有减少或保留的射血分数的心力衰竭。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗mi后心脏功能障碍。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗缺血性心脏病。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗外伤或手术中的血管损伤。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于伤口治愈，例如治愈撕裂。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于严重肢体缺血。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗肺动脉高压。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗外周动脉疾病。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗肾脏疾病。在一些实施例中，包含编码vegf-a多肽的一种或多种经修饰的rna的配制品可用于治疗涉及皮肤移植和组织移植的疾病。本披露的其他方面涉及将包含经修饰的rna的配制品给予有需要的受试者。可以肌内、经动脉、腹膜内、静脉内、动脉内、皮下、心室内、皮内、心内、经心外膜，通过门静脉导管、通过冠状窦导管和/或直接给予到待治疗的区域中进行给药。然而，本披露还涵盖通过考虑到药物递送科学中可能进展的任何适当途径来递送裸的经修饰的rna分子或经修饰的rna复合物和/或其药物、预防或诊断配制品。作为非限制性实例，在一些实施例中，向受试者给予根据本发明的配制品是经肌内、皮内、皮下、心内或心外膜途径，通过门静脉导管、通过冠状窦导管和/或通过直接给予到待治疗的区域。在一些实施例中，将配制品肌内给予该受试者。在一些实施例中，将配制品皮内给予该受试者。在一些实施例中，将配制品皮下给予该受试者。在一些实施例中，向受试者给予该配制品是经心内进行，优选以固定剂量以多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予来给予。在一些实施例中，向受试者给予该配制品是通过门静脉导管进行，优选以固定剂量以多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予来给予。在一些实施例中，向受试者给予该配制品是通过冠状窦导管进行，优选以固定剂量以多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予来给予。在一些实施例中，向受试者给予该配制品是通过直接给予到待治疗的区域进行，优选以固定剂量以多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予来给予。例如，向受试者给予该配制品是通过在开放性心脏手术期间直接注射到损伤区域进行，优选以固定剂量以多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予来给予。在一些实施例中，向受试者给予该配制品是经心外膜进行，优选以固定剂量以多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予来给予。例如，在经历冠状动脉旁路移植(cabg)的患者中，向该患者给予该配制品是从心脏的外侧进行，优选以固定剂量以多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予来给予。在本段的每个实施例中，“多次给予”可以彼此间隔短的(1-5分钟)、中等(6-30分钟)或长(超过30分钟，数小时或甚至数天)的时间间隔。可以使用对治疗疾病、障碍和/或病症有效的任何给予量将配制品给予受试者。根据受试者的物种、年龄、和一般状况、疾病的严重性、特定配制品、其给予方式、其活动模式等，所需的确切量将根据受试者的不同而不同。然而，将理解的是，配制品的总每日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的特定药学有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的疾病和疾病的严重性；所采用的特定化合物的活性；所采用的特定配制品；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别及饮食；给药时间、给药途径、以及采用的特定化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的特定化合物组合使用或同时使用的药物(例如，经修饰的rna)；以及医疗领域公知的类似因素。在某些实施例中，将根据本披露的配制品给予受试者，其中该配制品包含基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子)。在其他实施例中，将裸的经修饰的rna在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中进行给予。在其他实施例中，在不存在二价阳离子(包括钙)的情况下给予裸的经修饰的rna。在优选的实施例中，用于心内或皮内给予的包含经修饰的rna的配制品被配制在不含钙或镁的柠檬酸盐盐水缓冲液中。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的经修饰的rna。在某些实施例中，可以按照足以递送每天约0.0001mg/kg至约100mg/kg、从约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、从约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、从约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、从约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、从约0.01mg/kg至约50mg/kg、从约0.1mg/kg至约40mg/kg、从约0.5mg/kg至约30mg/kg、从约0.01mg/kg至约10mg/kg、从约0.1mg/kg至约10mg/kg、或从约1mg/kg至约25mg/kg经修饰的rna/受试者体重的剂量水平给予根据本发明的配制品，每天一次或多次，以获得所期望的治疗或预防效果。可以每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或作为单一剂量一次，以单次剂量或多次给药，在24小时时间内按秒、分钟或小时给予所需剂量。在某些实施例中，所需剂量可以使用多次给药进行递送(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次给药)。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按固定剂量水平给予。例如，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量给予约0.1mg至约1mg的固定剂量水平。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量给予约1mg至约10mg的固定剂量水平。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量给予约10mg至约25mg的固定剂量水平。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量给予约25mg至约50mg的固定剂量水平。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量给予约50mg至约100mg的固定剂量水平。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量给予约0.1至约25mg的固定剂量水平。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按固定剂量给予，优选多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予。例如，在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量0.1mg固定剂量给予，优选多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量1mg固定剂量给予，优选多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量10mg固定剂量给予，优选多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量25mg固定剂量给予，优选多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量50mg固定剂量给予，优选多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予。在一些实施例中，根据本披露的配制品可以按每次给药或每个总剂量100mg固定剂量给予，优选多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予。在一些实施例中，将根据本披露的配制品给予受试者，其中与基于脂质的配制品相比，配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的包含编码vegf-a多肽的裸的经修饰的rna的配制品对受试者的毒性更低。根据本披露的配制品中归因于rna递送的毒性的评估可以通过本领域熟知的方法进行评价。例如，阳离子脂质典型包括在rna治疗剂的脂质配制品中以改善rna包封和稳定性。然而，一些阳离子脂质可以以剂量依赖的方式破坏膜结构的完整性，引起细胞裂解和坏死，和/或以不期望的方式改变多种基因的表达(薛(xue)hy，当前药物设计(currpharmdes.)，(2015)21(22)：3140-7；其全部内容通过引用结合在此)。因此，可以通过测量归因于根据本披露的配制品中rna递送的细胞裂解和坏死程度和/或多种基因表达的改变来评估毒性实例。在临床前和临床水平上，一些脂质复合物的全身剂量依赖性毒性已得到充分记录。肝脏中枯否细胞捕获一些脂质复合物可触发炎症反应，其可能对肝脏造成损害，并导致主要肝功能指标水平升高。白细胞减少和血小板减少也可发生(张(zhang)j.，先进药物递送评论(advdrugdelivrev.)，(2005)57(5)：689-698；其全部内容通过引用结合在此)。因此，可以通过测量归因于根据本披露的配制品中rna递送的炎症反应来评估毒性实例。此外，可以通过测量输注相关反应如呼吸困难、缺氧、僵硬、背痛、低血压和肝损伤来评估毒性实例。如果一种或多种症状或临床标志物被减少，则患有血管疾病的受试者对治疗“有反应”。可替代地，如果疾病的进展减慢或停止，则治疗是起作用的。例如，心脏衰竭(hf)发生在心脏虚弱并且没有充满血液或不能泵足够的血液以满足身体对血液和氧气的需要时。同样地，患缺血性心脏病(ihd)的患者具有由心脏动脉狭窄引起的心脏问题。当动脉狭窄时，较少血液和氧气到达心脏肌肉。作为微血管功能障碍、功能性血管丧失和/或心脏组织损失的结果，患者通常会发展mi后心脏功能障碍。此外，血管结构最常因穿透伤或外科手术受损。糖尿病损害伤口愈合的许多成分，并且具有糖尿病性伤口愈合的患者通常由于血管功能障碍而改变血流量。因此，患有包括糖尿病溃疡的皮肤溃疡的患者通常具有减少或延迟的愈合。严重肢体缺血(cli)是动脉的严重阻塞，其显著减少向着四肢(手、脚和腿)的血流，并已进展到严重疼痛并且甚至皮肤溃疡、疮或坏疽的点。肺动脉高压(ph或phtn)是肺动脉、肺静脉或肺毛细血管(共同称为肺血管结构)中血压升高，导致气短、眩晕、昏厥、腿部肿胀和其他症状。外周动脉疾病(pad)是腿、胃、手臂和头部的外周动脉变窄-最常见于腿部动脉。基于各种身体检查常规临床诊断这些病症，通过超声心动图、血液检查、磁共振成像(mri)心电图和其他合适的测试证实。例如，显著的血管损伤的诊断有赖于紧密身体检查和成像测试。因此，如果患者通过身体检查显示较不严重的症状和/或从超声心动图、血液检查、mri、心电图或任何其他合适和/或常规检查得到测试结果改善，则对这些病症中的任何一种的治疗在发挥作用。在一些实施例中，患有血管疾病的受试者患有心肌梗塞。在一些实施例中，受试者在用本文披露的配制品治疗之前约一个月内遭受心肌梗塞。在一些实施例中，随着时间的推移，心肌梗塞触发心外膜衍生细胞(epdc)的激活。在一些实施例中，在心肌梗塞后数天(优选在epdc活化的峰值时期)用本文披露的配制品对患有心肌梗塞的受试者进行治疗。在一些实施例中，在心肌梗塞后约7天用本文披露的配制品对患有心肌梗塞的受试者进行治疗。在一些实施例中，在心肌梗塞后约10天、心肌梗塞后2周、心肌梗塞后3周、或心肌梗塞后6周用本文披露的配制品对患有心肌梗塞的受试者进行治疗。在一些实施例中，用此处所述的组合物或配制品进行的治疗包括治疗具有降低的射血分数的心肌梗塞。在其他实施例中，治疗包括治疗具有保留的射血分数的心力衰竭。在一些实施例中，该组合物或配制品是在健康和梗塞组织之间的边界区注射。在一些实施例中，患有血管疾病的受试者还患有冠状动脉疾病、高血压、糖尿病、心房颤动、瓣膜性心脏病、心肌病或感染。在一些实施例中，患有血管疾病的受试者患有左心室功能障碍。在一些实施例中，受试者具有小于约40％的左心室射血分数(lvef)。在一些实施例中，受试者具有小于约45％的lvef。在一些实施例中，受试者患有具有减少或保留的射血分数的心力衰竭。在一些实施例中，具有减少或保留的射血分数的心力衰竭的受试者被分类为纽约心脏协会功能分类(nyhafc)指南的ii-iv期。在一些实施例中，受试者有升高水平的指示具有降低或保留的射血分数的心力衰竭的一种或多种生物标志物(例如，nt-probnp、bnp、hstnt或hstni)。在一些实施例中，受试者具有升高的bnp(b型利尿钠肽)水平。在一些实施例中，受试者具有约100pg/ml的bnp水平。在一些实施例中，受试者具有约100-300pg/ml之间的bnp水平。在一些实施例中，受试者具有约300-600pg/ml的bnp水平。在一些实施例中，受试者具有约600pg/ml的bnp水平。在一些实施例中，受试者具有约600-900pg/ml之间的bnp水平。在一些实施例中，受试者具有升高的nt-probnp(n末端prob型利尿钠肽)水平。在一些实施例中，受试者具有约450pg/ml的nt-probnp水平。在一些实施例中，受试者小于50岁且具有约450pg/ml的nt-probnp水平。在一些实施例中，受试者具有约900pg/ml的nt-probnp水平。在一些实施例中，受试者在约50和75岁之间且具有约900pg/ml的nt-probnp水平。在一些实施例中，受试者具有至少1800pg/ml的nt-probnp水平。在一些实施例中，受试者约75岁且具有约1800pg/ml的nt-probnp水平。在一些实施例中，受试者具有升高的hstnt(高灵敏度肌钙蛋白t)水平。在一些实施例中，受试者具有升高的hstni(高灵敏度肌钙蛋白i)水平。在一些实施例中，受试者在用本文的配制品治疗前约一个月内已经遭受心肌梗塞，lvef小于约45％。在一些实施例中，受试者患具有减少或保留的射血分数的慢性缺血性心力衰竭，lvef小于约40％，nt-probnp水平至少约600pg/ml，并被分类为nyhafc指南上的ii-iv期。另外，血管功能的分子测量可用于评估一般病理生理学的改善。这些测量的实例包括增强的一氧化氮(no)可用性，增加的血管生成/动脉生成以及心脏组织中的干细胞募集。因此，如果患者在这些测量中显示出改善的分子功能，则患有血管疾病的患者对治疗“有反应”。5.5.调节哺乳动物细胞、组织或受试者中的生理过程本披露的另一方面涉及给予包含编码vegf-a多肽的经修饰的rna的组合物或特定配制品，用于调节哺乳动物细胞、组织或受试者中的生理过程。在一些实施例中，用于调节哺乳动物细胞、组织或受试者中的生理过程的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。作为非限制性实例，生理过程的调节可以包括诱导血管生成、刺激血管细胞增殖、增加心外膜衍生的祖细胞的增殖和/或改变心外膜衍生的祖细胞的命运、上调内皮化、诱导心脏再生、增加组织移植物的血管再生以用于伤口愈合、改善血管功能、增加组织灌注和新血管形成、减少瘢痕组织、增加前负荷补充搏功、增加最高压发展、增加肌力功能、增加左心室射血分数(例如，约5％至10％)、减少与心脏功能障碍相关的生物标志物(例如，nt-probnp，bnp，hstnt和hstni)水平、减少梗塞尺寸、减少心脏组织的纤维化和/或改善心脏功能。在与将本文所披露的经修饰的rna与细胞、组织或受试者接触相联系时，本文所使用的术语“接触(contacting或contact)”包括使得经修饰的rna与细胞、组织或受试者碰触或非常紧密接近。因此，在一些实施例中，短语“接触”是指暴露方法，其可以是直接或间接的。在一种方法中，这种接触包括通过本领域熟知的任何方法将组合物直接注射到细胞、组织或受试者中。在另一个实施例中，接触还涵盖间接接触，例如通过围绕组织的局部介质，或经由本领域已知的任何途径。每种可能性代表本披露独立的实施例。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中诱导血管生成的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对诱导血管生成的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见例如洛佩斯(lopez)jj等人，心血管研究(cardiovasc.res)，(1998)40，272-281；加利亚诺(galiano)r.d.等人，美国病理学杂志(amjpathol.)(2004)164，1935-1947；林(lin)y.d.等人，科学转化医学期刊(scitranslmed.)，(2012)4(146)：146ra109；桑吉(zangi)l.等人，自然生物技术(natbiotechnol.)，(2013)10，898-907；这些所有都通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中刺激血管细胞增殖的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对刺激血管细胞增殖的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见，例如，加利亚诺(galiano)r.d.等人，美国病理学杂志(amjpathol)(2004)164，1935-1947；其全部内容通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中增加心外膜衍生的祖细胞的增殖和/或改变心外膜衍生的祖细胞的命运的方法包括使哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对增加心外膜衍生的祖细胞的增殖和/或改变心外膜衍生的祖细胞的命运的影响可以通过本领域公知的方法来评价(参见，例如，桑吉(zangi)l.等人，自然生物技术(natbiotechnol.)，(2013)10，898-907；其全部内容通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中上调内皮化的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对上调内皮化的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见，例如，加利亚诺(galiano)r.d.等人，美国病理学杂志(amjpathol)(2004)164，1935-1947；其全部内容通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中诱导心脏再生的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对诱导心脏再生的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见，例如，桑吉(zangi)l.等人，自然生物技术(natbiotechnol.)，(2013)10，898-907；林(lin)y.d.等人，科学转化医学期刊(scitranslmed.)，(2012)4(146)：146ra109；这二者都通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中增加组织移植物的血管再生以用于伤口愈合的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对增加组织移植物的血管再生以用于伤口愈合的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见，例如，遠山(tohyama)h.等人，长庚医学杂志(changgungmedj)，(2009)32，133-139；陈(chen)j.等人，实验治疗医学(expthermed)，(2012)4，430-434；这二者都通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中改善血管功能的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对改善血管功能的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见，例如，洛佩斯(lopez)jj等人，心血管研究(cardiovasc.res)，(1998)40，272-281；蒂奥(tio)r.a.等人，人类基因疗法(humgenether.)，(1999)10，2953-2960；萨托(sato)k.等人，美国心脏病学会杂志(jamcollcardiol.)，(2001)37，616-23；这些所有都通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中增加组织灌注和新血管形成的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对增加组织灌注和新血管形成的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见例如，芝阿皮尼(chiappini)c.等人，自然材料(natmater)，(2015)14，532-539；林(lin)y.d.等人，科学转化医学期刊(scitranslmed.)，(2012)4(146)：146ra109；桑吉(zangi)l.等人，自然生物技术(natbiotechnol.)，(2013)10，898-907；这些所有都通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中减少瘢痕组织的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对减少瘢痕组织的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见，例如，罗萨诺(rosano)jm等人，心血管工程和技术(cardiovascengtechnol.)，(2012)3，237-247；加利亚诺(galiano)r.d.等人，美国病理学杂志(amjpathol)(2004)164，1935-1947；林(lin)y.d.等人，科学转化医学期刊(scitranslmed.)，(2012)4(146)：146ra109；桑吉(zangi)l.等人，自然生物技术(natbiotechnol.)(2013)10，898-907；这些所有都通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中改善心脏功能的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对改善心脏功能的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见，例如，罗萨诺(rosano)jm等人，心血管工程和技术(cardiovascengtechnol.)，(2012)3，237-247；林(lin)y.d.等人，科学转化医学期刊(scitranslmed.)，(2012)4(146)：146ra109；桑吉(zangi)l.等人，自然生物技术(natbiotechnol.)，(2013)10，898-907；这些所有都通过引用结合在此)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中增加前负荷补充搏功(prsw)的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对增加前负荷补充搏功的影响可以通过本领域熟知的方法进行评价(参见，例如，费内丽(fenely)等人，jacc，(1992)，19(7)：1522-30)。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中增加最高压发展的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对增加最高压发展的影响可以通过本领域熟知的方法例如左心室造影、冠状动脉造影、超声心动图、mri扫描、ct扫描、门控心肌spec扫描或门控心肌pet扫描进行评价。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中增加肌力功能的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对增加肌力功能的影响可以通过本领域熟知的方法例如左心室造影、冠状动脉造影、超声心动图、mri扫描、ct扫描、门控心肌spec扫描或门控心肌pet扫描进行评价。在一些实施例中，用于在哺乳动物心脏细胞或组织或受试者中增加左心室射血分数(lvef)的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。经修饰的rna对增加左心室射血分数的影响可以通过本领域熟知的方法例如左心室造影、冠状动脉造影、超声心动图、mri扫描、ct扫描、门控心肌spec扫描或门控心肌pet扫描进行评价。在一些实施例中，lvef增加约4％和10％之间。在一些实施例中，lvef增加约5％和8％之间。在一些实施例中，在哺乳动物细胞、组织或受试者中减少与心脏功能障碍相关的一种或多种生物标志物(例如，nt-probnp，bnp，hstnt和hstni)的方法包括使哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中减少梗塞尺寸的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。在一些实施例中，梗塞尺寸被减少。在一些实施例中，梗塞被消除。经修饰的rna对梗塞尺寸的影响可以通过本领域熟知的方法例如左心室造影、冠状动脉造影、超声心动图、mri扫描、ct扫描、门控心肌spec扫描或门控心肌pet扫描进行评价。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞、组织或受试者中减少纤维化的方法包括将哺乳动物细胞、组织或受试者与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，将组合物配制在磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。在一些实施例中，纤维化减少。在一些实施例中，纤维化被消除。经修饰的rna对纤维化的影响可以通过本领域熟知的方法例如左心室造影、冠状动脉造影、超声心动图、mri扫描、ct扫描、门控心肌spec扫描或门控心肌pet扫描进行评价。5.6.在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a本披露的另一方面涉及给予包含编码vegf-a多肽的经修饰的rna的组合物或特定配制品，用于哺乳动物细胞或组织中的体内、体外、原位或离体蛋白质表达。一些实施例涉及用于在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a的方法，该方法包括将哺乳动物细胞或组织在体内、体外或离体与包含经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a的方法包括将哺乳动物细胞或组织与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a的方法包括将哺乳动物细胞或组织与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触，其中该组合物配制于磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液中。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的组合物包含柠檬酸盐盐水缓冲液。在一些实施例中，该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a的方法包括将哺乳动物细胞或组织与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触，其中该组合物包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该组合物包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该组合物包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a的方法包括使哺乳动物细胞或组织与包含根据本披露的经修饰的rna的组合物接触，其中该组合物配制在基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子)中。在一些实施例中，用于在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a的方法包括将哺乳动物细胞或组织与配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的包含经修饰的rna的组合物接触，其中与基于脂质的配制品相比，该组合物对于受试者的毒性更低。5.7.在受试者中产生vegf-a的方法一些实施例涉及在受试者中产生vegf-a的方法，该方法包括向受试者给予包含根据本披露的经修饰的rna的组合物或特定配制品。作为非限制性实例，在一些实施例中，在受试者中产生vegf-a的方法包括向受试者给予根据本披露的包含经修饰的rna的配制品。在一些实施例中，配制品配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中。在一些实施例中，该配制品进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，该配制品进一步包含药学上可接受的赋形剂，其选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。在一些实施例中，该溶剂是水性溶剂。在一些实施例中，该配制品还包含药学上可接受的赋形剂，其选自脂质、类脂质(lipidoid)、脂质体、脂质纳米粒子、脂质复合物及其混合物。在一些实施例中，在受试者中产生vegf-a的方法包括向受试者给予根据本披露的包含经修饰的rna的配制品，其中该受试者患有对vegf-a疗法有反应的疾病。在一些实施例中，受试者患有选自以下项的疾病：具有减少或保留的射血分数的心力衰竭、肾脏疾病、涉及皮肤移植和组织移植的疾病、mi后心脏功能障碍、缺血性心脏病、来自创伤或手术的血管损伤、包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡、严重肢体缺血、肺动脉高压和外周动脉疾病。在一些实施例中，该疾病是具有减少或保留的射血分数的心力衰竭。在一些实施例中，该疾病是mi后心脏功能障碍。在一些实施例中，该疾病是缺血性心脏病。在一些实施例中，该疾病是来自创伤或手术的血管损伤。在一些实施例中，该疾病是包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡。在一些实施例中，该疾病是严重肢体缺血。在一些实施例中，该疾病是肺动脉高压。在一些实施例中，该疾病是外周动脉疾病。在一些实施例中，该疾病是肾脏疾病。在一些实施例中，该疾病是涉及皮肤移植和组织移植的疾病。在一些实施例中，在受试者中产生vegf-a的方法包括向受试者给予根据本披露的包含经修饰的rna的配制品，其中向受试者给予该配制品是经肌内、皮内、皮下或心内途径，通过门静脉导管、通过冠状窦导管和/或通过直接给予到待治疗的区域。在一些实施例中，将配制品肌内给予该受试者。在一些实施例中，将配制品皮内给予该受试者。在一些实施例中，将配制品皮下给予该受试者。在一些实施例中，向受试者给予该配制品是经心内进行，优选以固定剂量以多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)给予来给予。在一些实施例中，向受试者给予该配制品是通过门静脉导管进行。在一些实施例中，向受试者给予该配制品是通过冠状窦导管进行。在一些实施例中，通过直接给予到待治疗的区域中将该配制品给予该受试者。在一些实施例中，在受试者中产生vegf-a的方法包括向受试者给予根据本披露的包含经修饰的rna的配制品，其中该配制品包含基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子)、磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液。在优选的实施例中，包含经修饰的rna的配制品配制在柠檬酸盐盐水缓冲液中。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。在一些实施例中，在受试者中产生vegf-a的方法包括向受试者给予根据本披露的包含经修饰的rna的配制品，其中该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，在受试者中产生vegf-a的方法包括向受试者给予根据本披露的包含经修饰的rna的配制品，其中该配制品包含柠檬酸盐盐水缓冲液，并且与基于脂质的配制品相比对于受试者的毒性更低。5.8.用于制备配制品的方法一些实施例涉及用于制备配制品的方法，该方法包括将根据本披露的经修饰的rna与基于脂质的复合物(例如脂质体、脂质复合物和脂质纳米粒子)、磷酸盐缓冲盐水缓冲液、tham缓冲液或柠檬酸盐盐水缓冲液组合。一些实施例涉及制备配制品的方法，该方法包括将经修饰的rna与柠檬酸盐盐水缓冲液组合，其中该配制品对于治疗患有对vegf-a疗法有反应的疾病的受试者是有效的；调节哺乳动物细胞、组织或受试者的生理过程；在哺乳动物细胞或组织中表达vegf-a；和/或在受试者中产生vegf-a。在一些实施例中，用于制备配制品的方法包括将根据本披露的经修饰的rna与柠檬酸盐盐水缓冲液组合，其中该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在0.1和1μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在1和10μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，该配制品包含配制于柠檬酸盐盐水缓冲液中的浓度在10和50μg/μl之间的经修饰的rna。在一些实施例中，用于制备配制品的方法包括将根据本披露将经修饰的rna与柠檬酸盐盐水缓冲液组合，其中该配制品包含柠檬酸盐盐水缓冲液，并且与基于脂质的配制品相比对于受试者的毒性更低。在一些实施例中，用于制备配制品的方法包括将根据本披露将经修饰的rna与柠檬酸盐盐水缓冲液组合，其中该柠檬酸盐盐水缓冲液基本上不含二价阳离子，包括钙和镁。在一些实施例中，柠檬酸盐盐水缓冲液不含钙或镁。在一些实施例中，用于制备配制品的方法包括将根据本披露将经修饰的rna与柠檬酸盐盐水缓冲液组合，其中该配制品包含柠檬酸盐盐水缓冲液，并且进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，该药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。在一些实施例中，该溶剂是水性溶剂。根据本披露，可以经由许多途径向受试者给予配制品。适于皮内、心内、皮下和肌内注射的特定配制品是本领域已知的。例如，为了延长活性成分的效果，通常希望的是减缓肌内注射的活性成分的吸收。通过将药物(例如，经修饰的rna)溶解或悬浮于油性运运载体中完成肌内给予的药物的延迟吸收。通过在生物可降解的聚合物(诸如聚乳酸交酯-聚乙交酯)中形成药物(例如修饰的rna)的微胶囊基质来制得可注射的贮库形式。取决于药物对聚合物的比率以及所使用的特定聚合物的性质，可以对药物释放的速率进行控制。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。对于皮内和皮下注射，优选配制该配制品以使得当递送到皮内隔室时不诱导免疫应答。添加剂可用于皮内注射的配制品中，包括例如润湿剂、乳化剂或ph缓冲剂。用于皮内注射的配制品还可以含有一种或多种其他赋形剂，例如糖和多元醇。对于心内注射，优选配制该配制品以使得在使用注射针后它们不会对心脏肌肉和冠状动脉造成额外的损伤。本文提供了用于心内注射的合适配制品。5.9.降低经修饰的rna组合物的毒性的方法一些实施例涉及减少受试者中经修饰的rna治疗的毒性的方法，该方法包括用柠檬酸盐盐水缓冲液配制经修饰的rna。在一些实施例中，与基于脂质的配制品相比，用柠檬酸盐盐水缓冲液配制经修饰的rna对受试者的毒性更低。在一些实施例中，基于脂质的配制品的毒性是剂量依赖性毒性。在一些实施例中，基于脂质的配制品的毒性是剂量限制性毒性。在一些实施例中，减少受试者中的治疗毒性的方法包括根据本披露用柠檬酸盐盐水缓冲液配制经修饰的rna，并且进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，该药学上可接受的赋形剂选自溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、核-壳纳米粒子、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。在一些实施例中，该溶剂是水性溶剂。在一些实施例中，该溶剂是非水性溶剂。在一些实施例中，降低受试者中的治疗毒性的方法包括根据本披露用柠檬酸盐盐水缓冲液配制经修饰的rna，其中该受试者患有对vegf-a疗法有反应的疾病。在一些实施例中，受试者患有选自以下项的疾病：具有减少或保留的射血分数的心力衰竭、肾脏疾病、涉及皮肤移植和组织移植的疾病、mi后心脏功能障碍、缺血性心脏病、来自创伤或手术的血管损伤、包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡、严重肢体缺血、肺动脉高压和外周动脉疾病。在一些实施例中，该疾病是具有减少或保留的射血分数的心力衰竭。在一些实施例中，该疾病是mi后心脏功能障碍。在一些实施例中，该疾病是缺血性心脏病。在一些实施例中，该疾病是来自创伤或手术的血管损伤。在一些实施例中，该疾病是包括糖尿病性溃疡的皮肤溃疡。在一些实施例中，该疾病是严重肢体缺血。在一些实施例中，该疾病是肺动脉高压。在一些实施例中，该疾病是外周动脉疾病。在一些实施例中，该疾病是外周动脉疾病。在一些实施例中，该疾病是肾脏疾病。在一些实施例中，该疾病是涉及皮肤移植和组织移植的疾病。5.10.核酸序列一些实施例涉及包含用于产生经修饰的rna的体外转录模板的核酸序列。在一些实施例中，根据本披露，核酸序列包含用于产生经修饰的rna的体外转录模板。一旦用于产生经修饰的rna的转录模板可用，根据本披露的经修饰的rna可以根据本领域熟知的任何可用的技术，使用可商购的起始材料制备(参见，例如，美国专利申请公开号2015/0051268；美国专利号8,710,200；美国专利申请公开号2013/0259923；这些所有都通过引用结合)。权利要求列表中的所有权利要求在此通过引用以其全部内容作为附加实施例并入本说明书中。6.实例6.1.实例1vegf-a修饰的rna的转染和vegf-a蛋白的产生为了研究vegf-a修饰的rna的转染潜力，将10,000个细胞接种到常规培养基中的96孔板中。为了制备含有经修饰的rna产生的vegf-a的条件培养基，将250,000个人脐静脉内皮细胞(huvec)(龙沙公司(lonza)，瑞士巴塞尔)接种在内皮生长培养基(egm)培养基(龙沙公司)中的6孔板中。第二天，在无血清内皮基础培养基(ebm)培养基(龙沙公司)中进行转染。根据制造商的说明书，将vegfa修饰的rna(指示量)与脂质转染胺2000(英杰公司(invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)混合并加入细胞中。作为转染对照，使用与水混合的脂质转染胺2000。4小时后，将转染培养基去除并更换为新鲜的无血清ebm培养基，并在指定的时间点收集培养基。24小时后收集条件培养基并保持在-80℃。如下所述用elisa测量人vegfa浓度。根据制造商的说明书，用人vegf-aelisa试剂盒(novex，英杰公司)测量转染后细胞培养基中人vegf-a的量。在spectramax读数器中在450nm处读取吸光度，并计算样品中的vegfa浓度。对于在体外将vegf-a修饰的rna全部转染到细胞中，需要脂质转染胺2000。vegf-a修饰的rna可被转染到多种人心脏细胞类型中。更高剂量的经修饰的rna导致产生更多的vegf-a蛋白(图2a)。来自经修饰的rna的蛋白质生产在转染后大约8小时达到峰值，并且然后下降(图2b)。此外，经修饰的rna转染和蛋白质生产跨物种进行，并且可以转染小鼠心脏成纤维细胞和猪内皮细胞，导致vegf-a蛋白的翻译(图2c)。6.2.实例2通过重组和经修饰的rna产生的vegf-a激活vegf受体2信号传导将十万个huvec接种在egm培养基中的12孔板中。第二天，将细胞在ebm中饥饿24小时，并且然后暴露于100ng/mlvegf-a，无论是重组的(r&d系统公司，明尼阿波里斯市，明尼苏达州，美国)或经修饰的rna产生的(作为条件培养基添加)，或者暴露于不具有vegf-a的培养基。2、10和20分钟后终止刺激，并除去培养基。从用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(中尺度发现公司(mesoscalediscovery)，罗克维尔，马里兰州，美国)的裂解缓冲液培养的细胞制备总蛋白。使用bca蛋白测定试剂盒(皮尔斯公司(pierce)，罗克福德，伊利诺州，美国)根据制造商的方案测量蛋白质浓度。将15微克蛋白质加载在4％至12％bis-tris梯度凝胶上，并使用messds运行缓冲液(英杰公司)进行电泳。将分级蛋白质电印迹到聚二氟乙烯(pvdf)膜(英杰公司)上。将膜在tbs吐温(0.1％)中的5％bsa中封闭，并且随后在4℃下用一级抗体孵育过夜。使用的一级抗体是针对vegf受体2(vegfr2)、磷酸化vegfr2(p-vegfr2)、akt、磷酸化akt(p-akt)、enos(均来自细胞信号传导公司(cellsignaling)，丹佛斯，马萨诸塞州，美国)和磷酸化enos(p-enos，bd生物科学公司(bdbiosciences)，富兰克林湖，新泽西州，美国)。将膜用辣根过氧化物酶标记的二级抗体(达科公司(dako)，格洛斯楚普，丹麦)进行孵育，并使用ecl蛋白质印迹底物(皮尔斯公司)检测免疫反应。化学发光信号是使用chemidoc触摸成像系统(伯乐公司(biorad)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)来可视化。为了验证由经修饰的rna产生的vegf-a蛋白是有活性的，将来自用vegf-a修饰的rna转染的细胞的条件培养基加入到培养的细胞中。这导致人内皮细胞中主要vegf-a受体(vegf受体2)的磷酸化(图3a)。此外，条件培养基还分别诱导人内皮细胞中的下游信号传导通路enos(图3b)和小鼠心脏成纤维细胞中的akt(图3c)的磷酸化。6.3.实例3经修饰的rna产生的vegf-a蛋白是在血管生成过程中刺激了几个关键步骤的活性蛋白将huvec以每孔3000个细胞的密度在egm培养基(龙沙公司)中接种在96孔板中。第二天，将培养基更换为补充有2％胎牛血清(fbs)和重组vegf-a(r&d系统公司)的基础ebm培养基或更换为补充有2％fbs的含有经修饰的rna产生的vegf-a的条件培养基。vegf-a浓度分别为10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml。将不含vegf-a的培养基用作对照。将板在37℃保持于5％co2中，并且两天后在4％缓冲甲醛(histolab，瑞典哥德堡)中固定，并用hoechst(英杰公司)核染色10min。在图片表达高含量分析系统(imageexpresshighcontentanalysissystem)中确定核计数。根据制造商的说明，将huvec用celltrackerred(分子探针公司(molecularprobes)，尤金，俄勒冈，美国)染色，并接种在24孔板(康宁公司(corning)，纽约，美国)中具有8μm孔径的floroblok膜的穿孔插入物(transwellinsert)中的补充有2％血清的ebm培养基中。将具有人重组vegf-a(r&d系统公司)和2％血清的ebm或者含有经修饰的rna产生的vegf-a和2％血清的条件培养基加入到下室中。分别以10ng/ml和100ng/ml的浓度研究作为趋化因子的vegf-a。将不含vegf-a的培养基用作对照。24小时后，用图片表达高含量分析系统(imageexpresshighcontentanalysissystem)对迁移到膜下侧的细胞进行计数。在ebm中将huvec与cytodex3微载体珠粒(ge医疗集团(gehealthcare)，小查尔方特(littlechalfont)，英国)混合，并将管保持在37℃下并经常轻弹以允许均匀涂覆。4小时后，将涂覆有内皮细胞的珠粒接种在烧瓶中，并保持在37℃和5％co2下过夜。将珠粒以500个珠粒/ml悬浮于含有抑肽酶(0.15单位/ml，西格玛奥德里奇(sigmaaldrich))的纤维蛋白原溶液(2mg/ml西格玛奥德里奇，圣路易斯市，密苏里州，美国)中，并且然后加入96孔板中含有凝血酶(0.625单位/ml，西格玛奥德里奇)的孔中。15分钟后，纤维蛋白凝胶已形成凝块，并且加入具有重组vegf-a的egm培养基或含有经修饰的rna产生的vegf-a的条件培养基。作为对照，使用不具有vegf-a的培养基。当评价血管生成芽形成时，将板保持在37℃和5％co2下2天。将细胞用钙黄绿素染色30分钟，并在图片表达高含量分析系统中读取各板，并确定芽形成。如所描绘的，血管生成过程中的几个关键步骤受到经修饰的rna产生的vegf-a蛋白的影响。vegf-a增加培养的人内皮细胞的增殖(图4a)和迁移(图4b)。此外，通过经修饰的rna产生的vegf-a增加具有涂覆有内皮细胞的珠粒的3d培养物中的血管生成芽形成(图4c和图5)。重要的是，在内皮细胞中，与重组vegf-a蛋白相比，经修饰的rna产生的vegf-a蛋白诱导相似的应答，这表明经修饰的rna产生的vegf-a保留了其影响血管生成的性质和能力。6.4.实例4在小鼠中单次心内注射lacz修饰的rna后评估β-半乳糖苷酶蛋白将雄性c57b1/6小鼠(10至12周龄)用异氟烷麻醉。将左胸部剃毛并灭菌，并且在插管后，通过左胸廓切开术将心脏暴露。将配制在柠檬酸盐/盐水(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，在hyclone水中，用氢氧化钠将ph调节至大约7.5)或脂质转染(rnaimax转染试剂，赛默飞世尔公司(thermofisherscientificinc.)，纽约，美国)中的lacz修饰的rna从心脏的顶点向基部注射(50μl)在左心室游离壁中。注射后，通过缝合将胸和皮肤闭合，并通过温和的胸部按压从胸腔中除去多余的空气。随后，当正常呼吸建立时，将小鼠与呼吸机断开连接并使其返回到它的居住笼中。在心脏注射后的预定义时间点，将小鼠麻醉并将胸部第二次打开。切除心脏，并通过5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(x-gal)染色检测转染效率和报告物β-半乳糖苷酶的存在。x-gal被酶水解，产生指示存在活性β-半乳糖苷酶的强烈蓝色不溶性产物。简言之，将器官或组织在磷酸盐缓冲液中漂洗并固定在4％多聚甲醛中15分钟，并用含有2mmol/lmgcl2、0.01％脱氧胆酸钠和0.02％nonidetp40的0.1mmol/l磷酸盐(ph7.3)洗涤缓冲液洗涤3次(20至30分钟)。随后，将新鲜制备的x-gal溶液(含有5mmol/lk4fe(cn)6、5mmol/lk3fe/cn)6和1mg/mlx-gal的磷酸盐洗涤缓冲液)加入到样本中，然后将其包裹在箔中并在37℃下孵育过夜。然后将样品用磷酸盐洗涤缓冲液洗涤3次并拍照。在左胸廓切开术之后，给麻醉的小鼠单次心内注射柠檬酸盐/盐水或lacz修饰的rna。大约24小时后，处死小鼠，并切除心脏。然后将心脏进行x-gal染色过夜。图6b和6c说明了用配制在脂质转染胺(图6b)或柠檬酸盐/盐水缓冲液(图6c)中的经修饰的rna注射的顶端区域中有效的和定性相似的转染以及β半乳糖苷酶的产生。在仅注射了柠檬酸盐/盐水的心脏中未观察到染色(图6a)。6.5.实例5在初试小鼠中，心内注射荧光素酶修饰的rna后评估荧光素酶蛋白表达将雄性c57b1/6小鼠(10至12周龄)用通过腹膜内注射给予的氯胺酮(10mg/kg)和甲苯噻嗪(3.5至4mg/kg)的混合物进行麻醉。将左胸部剃毛并灭菌，并且在插管后，通过左胸廓切开术将心脏暴露。用以下缓冲液配制萤火虫荧光素酶修饰的rna：1.pbs缓冲液(1xpbs，无钙，无镁，ph7.4)2.柠檬酸盐盐水缓冲液(c/s，10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，于hyclone水中，ph7.0)3.tham缓冲液(氨丁三醇aka2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)，300mmol/ltris-hcl，ph8.0)将总共25μg的荧光素酶修饰的rna从心脏的顶点向着基部注射(50μl)在左心室游离壁中。注射后，通过缝合将胸和皮肤闭合，并通过温和的胸部按压从胸腔中除去多余的空气。手术后，小鼠接受腹膜内注射阿替美唑盐酸盐(1mg/kg)和皮下注射丁丙诺啡盐酸盐(0.02mg/kg)。随后，当正常呼吸建立时，将小鼠与呼吸机断开连接并使其返回到它的居住笼中。在左胸廓切开术之后，给予麻醉的小鼠单次心内注射仅缓冲液(pbs，c/s或tham对照)或配制在pbs、c/s或tham缓冲液中的萤火虫荧光素酶修饰的rna。切除心脏以用于通过生物发光ivis成像进行荧光素酶蛋白表达评估。下面呈现的结果是两个交错的小鼠研究的组合。表2报告了个体原始ivis生物发光通量值，并且图7分别示出了所有治疗组的图示平均值。表2.仅注射了对照缓冲液或在缓冲液的任一种中配制的荧光素酶修饰的rna的小鼠心脏中的原始ivis生物发光数据。如在图7中所描绘的，在用荧光素酶修饰的rna注射的所有心脏中检测到荧光素酶蛋白表达，而阴性对照(pbs，c/s和tham)显示很少信号乃至没有信号。这些对照中的基线ivis生物发光信号从约4波动到7.5+e03单位生物发光通量，表示为光子/秒。在用荧光素酶修饰的rna注射的所有心脏中检测到荧光素酶信号的3至4个数量级。在各种缓冲液之间没有检测到统计学差异。6.6.实例6在大鼠中，心内注射人vegf-a修饰的rna后评估人vegf-a蛋白产生将雄性斯普拉道来大鼠(体重250至300g)用异氟烷麻醉，并皮下注射了麻卡因(25mg/kg)和丁丙诺啡(0.05mg/kg)用于镇痛。将左胸部剃毛并灭菌，并且在插管后，通过在第五肋间隙的左胸廓切开术将心脏暴露。沿着左心室游离壁的一条线，将配制在柠檬酸盐盐水(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，于hyclone水中，用氢氧化钠将ph调节至大约7.5)中的人vegf-a修饰的rna(1800、150或15μg)作为六次分开的注射(每次15μl，总容积90μl)进行注射。注射后，通过缝合将胸和皮肤闭合，并通过温和的胸部按压从胸腔中除去多余的空气。随后，当正常呼吸建立时，将大鼠与呼吸机断开连接并使其返回到它的居住笼中。在心脏注射后的预定义时间点，将大鼠麻醉并将胸部第二次打开进行心脏组织取样。切除心脏，并且切掉右心室及左心房和右心房。将包括注射部位的横向切片切除，分成两部分，将其在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存，直至分析vegf-a蛋白。作为阴性对照，从远离注射部位的顶端取出单独的组织样品。对麻醉的大鼠心内注射配制在柠檬酸盐/盐水中的3种不同剂量(15、150或1800μg)的vegf-a修饰的rna。在一个单时间点作为六次分开的注射跨左心室游离壁给予每个剂量。在注射后的不同时间点处死动物，切除心脏，并收获心室组织用于vegf-a蛋白质含量分析。图8a总结了注射的三个剂量中的每个产生的vegf-a蛋白的时间曲线和多少。如可以看出的，蛋白质产生不是剂量线性的，并且15至150μg的10倍剂量增加导致仅在曲线下面积(auc)上增加1.6倍，并且150和1800μg剂量组观察到相似的auc(1.1倍差异)。6.7.实例7向经受心肌梗塞的大鼠中心内注射人vegf-a修饰的rna后对左心室功能和梗塞尺寸的影响如上所述，将雄性斯普拉道来大鼠(体重250至300g)进行麻醉、预处理并切开胸廓。随后使动物经受左前降支冠状动脉的永久性结扎以诱导心肌梗塞。结扎之后是心内注射90μl柠檬酸盐/盐水(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，于hyclone水中，用氢氧化钠将ph调节至大约7.5)或150或1800μg在柠檬酸盐/盐水中配制的人vegf-a修饰的rna。整个容积是按六次分开的心外膜注射沿着梗塞边界区域递送的。注射后，通过缝合将胸和皮肤闭合，并通过温和的胸部按压从胸腔中除去多余的空气。随后，当正常呼吸建立时，将大鼠与呼吸机断开连接并使其返回到它的居住笼中。在手术后1和8天，将动物带到成像设备以通过磁共振成像(mri)评估左心室功能和梗塞尺寸。此外，在手术之后的第二天，从尾静脉抽取血液样品以便分析作为心脏损伤的生物标志物的心肌肌钙蛋白i(i-心肌肌钙蛋白i诊断测试，雅培定点照护公司(abbottpointofcareinc.)，雅培科技园(abbottpark)，伊利诺州60064，美国)。使用专用的小型动物mri系统进行mri扫描，场强为4.7t。以短轴方向采集图像，并且采集覆盖左心室的图像堆叠。使用心电描记法在心动周期的特定阶段触发成像。从证明一个心跳期间左心室壁的移动的一个图像系列评价心脏功能。在采集该图像系列时使用的成像序列是梯度回波序列，横向重复时间为10ms，而翻转角为25。经验丰富的读取者使用专用图像分析软件在不同时间点通过手动描绘来评估左心室的容积。收缩末期(esv)和舒张末期(edv)容积被鉴定为最小和最大的左心室容积。反映心脏功能的射血分数(ef)是通过公式ef＝(edv-esv)/edv来评估。在给予钆双胺(含有钆的造影剂)后采集证明心肌梗塞程度的图像。图像采集前十分钟，通过尾静脉导管注射0.3mmol/kg钆双胺。使用梯度回波序列进行成像，其中造影准备包括使用反转脉冲。重复时间为最小的900ms，并且翻转角为90°。有经验的读取者使用专用图像分析软件通过手动描绘来评估左心室壁容积(lvv)和梗塞容积(iv)。通过公式is＝iv/lvv确定梗塞尺寸(is)，表示为左心室壁的梗塞分数。将二十七只大鼠经受左前降支冠状动脉的永久性结扎，以及心内注射柠檬酸盐/盐水(n＝8)或者低(150μg，n＝9)或高(1800μg，n＝10)剂量的配制在柠檬酸盐/盐水中的vegf-a修饰的rna。对动物随访8天，并且在诱导梗塞后第1天和第8天通过mri评估对左心室射血分数和梗塞尺寸的影响。在第1天在静脉血中测量作为心肌细胞损伤的生物标志物的心肌tni。由于两种剂量的vegf-a修饰的rna导致产生相似量的vegf-a，在功效分析中汇集来自两组的数据。与柠檬酸盐/盐水处理的大鼠相比，给予vegf-a修饰的rna的动物具有显著较高的第8天左心室射血分数(图8b)和较低水平的第1天心肌tni(图8d)。此外，相对于运载体处理的大鼠，积极处理的大鼠倾向于具有减小的梗塞尺寸(图8c)。6.8.实例8在哥廷根小型猪中，心内注射lacz修饰的rna或人vegf-a修饰的rna后评估β-半乳糖苷酶和人vegf-a蛋白禁食过夜的雌性哥廷根小型猪(体重约25kg)通过肌内注射咪达唑仑和氯胺酮镇静。镇静后，将静脉管线置于耳边缘静脉中，以通过丙泊酚诱导麻醉，并将猪经气管内插管。然后将猪转移到实验室并连接到呼吸机。全身麻醉是由通过精密汽化器输送的异氟烷和具有定期动脉血气监测的循环吸气呼吸系统维持。在整个实验过程中连续监测生命体征(心率、血压、呼吸率、o2脉搏血氧计、ecg和体温)。在整个手术过程中给予静脉流体治疗，调整速率以取代失血或在全身血压低的情况下进行。进行左胸廓切开术以暴露心脏，并将lacz修饰的rna或vegf-a修饰的rna(以不同的容积和剂量)以距离心外膜表面大约5mm的深度注射到左心室游离壁中。注射部位用小缝合线标记，并且6小时后切除心脏。在注射部位收获透壁组织厚板，并且如上所述针对β-半乳糖苷酶进行x-gal染色。对于vegf-a蛋白分析，从心外膜到心内膜，将每个组织厚板分成6个单独的样本。将这些样品在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存，直到如下所述的vegf-a分析。将lacz或vegf-a修饰的rna经心外膜注射到左心室游离壁中，并且6小时后采集组织以用于x-gal染色或vegf-a蛋白分析。在给予了lacz修饰的rna的猪中，当使用脂质转染胺作为转染培养基时(图9a)，与当使用柠檬酸盐/盐水时相比，β-半乳糖苷酶的产生是定性相似的(图9b)。6.9.实例9心脏组织中人vegf-a蛋白的定量将含有磷酸酶抑制剂i和ii及蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(中尺度发现公司(mesoscalediscovery(msd))，罗克维尔，马里兰州，美国)的tris裂解缓冲液加入到冷冻的组织活组织检查物中，并在均质化之前在约-20℃下冷冻。然后添加陶瓷珠粒(3毫米)，并使用precellys均化器将样品均质化。将匀浆物离心，并将上清液储存在-80℃，之后分析。使用具有电化学发光检测的夹心免疫测定法测定vegf-a浓度。msdv-plex细胞因子组1(人)vegf-a试剂盒被用于测量组织匀浆物中的vegf-a浓度。按照试剂盒说明进行该测定。使用试剂盒稀释液将标准品1:2连续稀释，并在每批中包括额外的对照以监测测定性能。在分析前用试剂盒稀释液将样品最少1:10稀释，并在msdsector600仪器上读取各板。图10总结了在柠檬酸盐/盐水中配制的不同剂量(每次注射50至2000μg)的vegf-a修饰的rna的心外膜注射后6小时vegf-a的剂量依赖性产生。在低剂量注射vegf-a修饰的rna的情况下产生的蛋白的水平指示饱和，这与大鼠中的发现一致(图8a)。6.10.实例10在柠檬酸盐盐水缓冲液中lacz和荧光素酶修饰的rna心脏转染和翻译如所描绘的，将75μg具有心脏注射液的编码经修饰的rna的lacz进行转染并在大约10％的左心室中翻译(图11a、11b、11c和11d)。荧光素酶修饰的rna的rna原位杂交揭示在注射部位的心肌中的染色表达(图11e和11f)，并且通过连续切片中的免疫组织化学分析显示相关荧光素酶蛋白表达(图11g)。6.11.实例11经修饰的rna随柠檬酸盐盐水缓冲液注射到心脏后，vegf-a蛋白表达是可饱和的，并且在多个物种间具有类似的药代动力学为了比较vegf-a蛋白产生，将柠檬酸盐盐水缓冲液中的150μgvegf-a修饰的rna和使用rnaimax(基于脂质的配制品)作为递送载体的100μgvegf-a修饰的rna注射到大鼠心脏中。24小时后，大鼠中柠檬酸盐盐水缓冲液(ntb)的情况下的vegf-a蛋白水平具有与注射了rnaimax的大鼠中相当的水平，并且药代动力学曲线相似(图12a)。在物种间可见蛋白质表达是剂量限制性的和可饱和的(图12b)。随着剂量的十倍增加，曲线下面积仅增加1.6倍(图12c)。6.12.实例12在小鼠、大鼠和猪中，心内注射人vegf-a修饰的rna后评估人vegf-a蛋白产生为了比较vegf-a蛋白产生，将柠檬酸盐盐水缓冲液中的150μgvegf-a修饰的rna和使用rnaimax(基于脂质的配制品)作为递送载体的100μgvegf-a修饰的rna注射到大鼠心脏中。24小时后，大鼠中的vegf-a蛋白水平将雄性c57b1/6小鼠(10至12周龄)用异氟烷麻醉。将左胸部剃毛并灭菌，并且在插管后，通过左胸廓切开术将心脏暴露。将配制在柠檬酸盐盐水(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，于hyclone水中，用氢氧化钠将ph调节至约7.5)中的100μgvegf-a修饰的rna(编码人vegf-a蛋白(vegf-a))从心脏的顶点向基部注射(50μl)在左心室游离壁中。注射后，通过缝合将胸和皮肤闭合，并通过温和的胸部按压从胸腔中除去多余的空气。随后，当正常呼吸建立时，将小鼠移离呼吸机并使其返回到它的居住笼中。在心脏注射后的预定义时间点，将小鼠麻醉并将胸部第二次打开进行心脏组织取样。切除心脏，并且切掉右心室及左心房和右心房。将剩余的心脏组织(即，左心室游离壁和心室内隔膜)在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存，直至如下所述分析vegf-a蛋白。将雄性斯普拉道来大鼠(体重250至300g)用异氟烷麻醉，并皮下注射了麻卡因(25mg/kg)和丁丙诺啡(0.05mg/kg)用于镇痛。将左胸部剃毛并灭菌，并且在插管后，通过在第五肋间隙的左胸廓切开术将心脏暴露。沿着左心室游离壁的一条线，将配制在柠檬酸盐盐水(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，于hyclone水中，用氢氧化钠将ph调节至大约7.5)中的人vegf-a修饰的rna(100μg)作为三次分开的注射(每次20μl，总容积60μl)进行注射。注射后，通过缝合将胸和皮肤闭合，并通过温和的胸部按压从胸腔中除去多余的空气。随后，当正常呼吸建立时，将大鼠与呼吸机断开连接并使其返回到它的居住笼中。在心脏注射后的预定义时间点，将大鼠麻醉并将胸部第二次打开进行心脏组织取样。切除心脏，并且切掉右心室及左心房和右心房。将包括注射部位的横向切片切除，分成两部分，将其在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存，直至如下所述分析vegf-a蛋白。禁食过夜的雌性哥廷根小型猪(体重约25kg)通过肌内注射咪达唑仑和氯胺酮镇静。镇静后，将静脉管线置于耳边缘静脉中，以通过丙泊酚诱导麻醉，并将猪经气管内插管。然后将猪转移到实验室并连接到呼吸机。全身麻醉是由通过精密汽化器输送的异氟烷和具有定期动脉血气监测的循环吸气呼吸系统维持。在整个实验过程中连续监测生命体征(心率、血压、呼吸率、o2脉搏血氧计、ecg和体温)。在整个手术过程中给予静脉流体治疗，调整速率以取代失血或在全身血压低的情况下进行。进行左胸廓切开术以暴露心脏，并将vegf-a修饰的rna(配制在柠檬酸盐盐水(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，于hyclone水中，用氢氧化钠将ph调节至约7.5)中的100μg)以距离心外膜表面大约5mm的深度注射到左心室游离壁中。注射部位用小缝合线标记，并且6小时后切除心脏。收获透壁组织厚板。对于vegf-a蛋白分析，从心外膜到心内膜，将每个组织厚板分成6个单独的样本。将这些样品在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存，直到如下所述的vegf-a分析。如在图13a和13b中所示，产生的蛋白质的量在注射后大约6至12小时达到峰值，并且所产生的vegfa蛋白的多少和时间曲线在物种间是相似的。在大鼠中注射后192小时，在心脏组织中仍观察到人vegf-a蛋白(图13b)。6.13.实例13向经受心肌梗塞的猪心内注射人vegf-a修饰的rna后对左心室功能和梗塞尺寸的影响将三十四只任一性别的性成熟的兰屿小型猪(约5月龄)禁食过夜并麻醉，气管内插管并通过呼吸器用氧气、空气和异氟烷的混合物人工通气。在整个实验过程中连续监测生命体征(心率、血压、呼吸率、o2脉搏血氧计、ecg和体温)。在整个手术过程中给予静脉流体治疗，调整速率以取代失血或在全身血压低的情况下进行。进行左胸廓切开术以暴露心脏，并且除了其中动脉未闭塞的5例(假手术组)外，所有猪均进行中左前降支冠状动脉的永久闭塞。随后，闭合胸部，并在将猪带回到围栏后，转入特护室持续大约2小时。在手术前后，给予镇痛剂和抗生素以缓解疼痛并预防感染。在初次手术后7天，如上所述准备猪用于第二次手术，并将其带回手术室。准备后，将梗塞的猪随机用柠檬酸盐/盐水(n＝8)、vegf-a修饰的rna低剂量(1mg，n＝8)、vegf-a修饰的rna高剂量(10mg，n＝8)或配制在自组装纳米纤维中的重组人vegf-a蛋白(n＝5)进行盲法处理。尽管未被批准用于临床使用，包括了纳米纤维构建体作为阳性对照疗法(林(lin)y.d.等人，科学转化医学期刊(sciencetranslmed)，(2012)4：146ra109；其全部内容通过引用结合在此)。在左胸廓切开术后，研究药物以分布于梗塞周围/梗塞区域中的20个心外膜注射来给予，每次注射容积为100μl。该程序之后，如上所述对猪进行处理，并在进行终点实验之前使其恢复2个月。在整个研究中，通过超声心动图评估左心室功能的连续测量。因此，就在心肌梗塞诱导之前和之后，就在心内注射研究药物之前和处死当天，在闭合胸部的猪中在麻醉下进行测量。使用vividq与3.5mhz探针(ge医疗集团，霍顿(horten)，挪威)通过2d超声心动图评估心脏功能。将猪置于左侧卧位。通过m模式获得胸骨旁长轴视图以测量左心室容积，以得出左心室射血分数。在研究结束时(即在给予研究药物后2个月)，如上所述将猪麻醉，并用装备仪器以便通过定位在左心室腔内的压力-容积循环记录导管(米拉仪器公司(millarinstruments)，休斯敦，德克萨斯州，美国)通过右颈动脉插管术进行侵入式血流动力学评估。用商业软件(ad仪器公司(adinstruments))分析血液动力学数据。血液动力学评估后，处死猪，并收获心脏。将心脏洗涤三次，并从顶端到乳头肌层处理成五个切片。拍摄每个切片的图像，并使用商业软件(imagej)估计梗塞尺寸。梗塞尺寸计算为整个心室面积减去内部空间面积的百分比。在研究过程中进行左心室射血分数(ef)的连续评估。如可以在图14中看到的，左前降支冠状动脉的永久闭塞与ef立即从大约65％减少到低于45％相关，即在注射研究药物闭塞后7天保持的下降。在经受假手术的猪中没有观察到这种减少。在注射后两个月，观察到给予了配制在自组装纳米纤维中的vegf-a修饰的rna或重组vegf-a蛋白的猪与柠檬酸盐/盐水注射的猪相比具有改善的ef。当比较注射当天直到研究结束时ef的变化，对于vegf-a修饰的rna组和vegf-a蛋白组而言观察到统计学上显著的改善，而对于柠檬酸盐/盐水组未观察到。在研究终止时进行的左心室功能的侵入式血液动力学评估显示出类似的改善，分别由随时间的最高左心室压力发展上的差异(dp/dtmax，图15)、随时间的最小压力发展(dp/dtmin，图16)、收缩末期压力容积关系(espvr，图17)、舒张末期压力容积关系(edpvr，图18)和前负荷补充搏功(prsw，图19)证明。在研究结束时在组织收获后测量梗塞尺寸，并将其定量为总体左心室梗塞尺寸(切片2、3、4和5，图20a)、中左心室梗塞尺寸(切片3和4，图20b)和正中左心室梗塞尺寸(切片4，图20c)。如可以在图20a、20b和20c中看到的，vegf-a修饰的rna以及vegf-a蛋白/纳米纤维处理与梗塞尺寸的剂量依赖性降低(对比柠檬酸盐/盐水处理的猪)相关。6.14.实例14在糖尿病小鼠的伤口愈合模型中人vegf-a修饰的rna的体内作用该实验的目的是确定人vegf-a修饰的rna是否在延迟皮肤伤口愈合的糖尿病小鼠模型中展示出生物活性。使用db/db小鼠进行两次试验，该小鼠由于点突变而在瘦蛋白受体表达上有缺陷，并且相对于健康对照小鼠经历延迟的皮肤伤口愈合。db/db小鼠已被广泛用于已发表的文献中，以测试旨在加速伤口愈合的各种治疗的治疗功效。第一个试验，试验1，包括32只雄性db/db小鼠，并被设计为：1)评价人vegf-a修饰的rna对伤口愈合率的影响，2)确定治疗是否导致肉芽组织形成异常，以及3)确定人vegf-a修饰的rna对肉芽组织中血管分布的影响。第二个试验，试验2，包括7只雄性db/db小鼠，并被设计为使用新型硼基氧传感纳米粒子的比率法成像来评价伤口随时间的氧合。简言之，在试验的第一天(第0天)，在每只小鼠的背部经手术制造1cm直径的全层皮肤伤口，并且将人vegf-a修饰的rna或运载体对照(每组n＝8只小鼠)立即皮内注射在伤口周围。在小鼠的亚组(每组n＝8只小鼠)中，在第3天还递送人vegf-a修饰的rna或运载体对照。使用tegaderm将伤口包扎，并将小鼠单独地关在笼中。在随后的时间点采集伤口的连续照片，并在终点(第18天)，收获伤口组织并处理用于免疫组织化学(针对内皮细胞cd31+染色及苏木精和伊红(h&e)染色)。在试验2中，除了仅在第0天和第3天进行给药，在类似于试验1的实验程序之后，将氧传感纳米粒子局部递送到伤口床后采集荧光和磷光的连续图像。试验1的结果显示，相对于运载体对照的连续给药，人vegf-a修饰的rna(第0天为100μg，第3天为100μg)的连续给药在第6天和第10天显著(p<0.05)减少了开放伤口面积，而单次给予人vegf-a修饰的rna或运载体对照组没有如此。早期时间点(第3至6天)之间伤口闭合的平均百分比与运载体对照相比显著增加。在接受人vegf-a修饰的rna连续给药的小鼠中，肉芽组织中的cd31+染色也增加。在试验2中，相对于双次注射运载体组，接受2次连续剂量的100μg人vegf-a修饰的rna的小鼠在第6天伤口中的氧水平也显著增加(p<0.05)。此实验支持在早期(更临床相关的伤口愈合期)期间通过连续给予人vegf-a修饰的rna来处理糖尿病小鼠背部的皮肤伤口显著加速伤口愈合。加速的愈合伴随在早期时间点肉芽组织的血管化增加和伤口床的氧合增加。测试化合物和配制品测试系统研究设计实验程序实验分为两个试验，试验1和试验2。试验1专注于在糖尿病伤口愈合的背景下评价人vegf-a修饰的rna的生物活性。试验2再次测试人vegf-a修饰的rna在相同伤口愈合模型中的生物活性，而且还采用氧敏感性纳米粒子的使用来确定伤口床内的氧合作用。除非另有说明，以下列出的程序为两次试验共有。全层皮肤伤口(第0天)：用2％可吸入的异氟烷/氧气混合物麻醉小鼠，并且然后在手术前脱毛并灭菌。使用模版在小鼠的背部上标记1cm直径的圆。从轮廓区域仔细切除皮肤(包括真皮和表皮)，以形成全层皮肤伤口。皮内注射人vegf-a修饰的rna或运载体。在手术后给予镇痛剂(丁丙诺啡，0.1mg/kg)，并用tegaderm敷料和自粘包裹物覆盖伤口。皮内注射(第0天和第3天)：切除皮肤后立即注射10μlx4的人vegf-a修饰的rna或运载体(如上概述)。在第0天(创伤日)，将人vegf-a修饰的rna或运载体在伤口周围以0、90、180和270度位置注射到皮肤真皮层中。在第3天，将人vegf-a修饰的rna或运载体围绕伤口周围以45、135、225和315度位置进行皮内注射，以避免在相同位置注射两次。成像程序(第0、3、6、10、13和18天)：在伤口成像之前去除自粘包裹物和tegaderm敷料。在成像前每天记录身体质量(第0、3、6、10、13和18天)。用1200万像素摄像机在伤口上方固定距离处采集图像，同时用2％可吸入的异氟烷/氧气混合物麻醉小鼠。成像后，用新的tegaderm敷料覆盖伤口，并用现有的自粘包裹物包裹(除非要进行纳米粒子成像)。用氧敏感性纳米粒子进行的成像程序(第0、3、6、10、13和18天)：对氧气水平的成像仅在试验2中进行。在如上所述成像之后，将小鼠保持麻醉并置于具有定制设计的成像平台的温度控制显微镜台。在uv照射下，对每个伤口采集m-jpeg，1)由以下组成：在施加硼基纳米粒子(bnp)之前，10帧(以3帧/秒采集)伤口，和2)在伤口床内50μl纳米粒子溶液超灌后60帧(以3帧/秒采集)。成像后，用新的tegaderm敷料覆盖伤口，并用现有的自粘包裹物包裹。伤口氧合图像分析：仅在试验2中进行氧水平的成像。使用专门编写的matlab程序分析uv照射的伤口图像(如上所述采集)。为了考虑背景信号，在添加纳米粒子之前针对红色和蓝色通道强度分析伤口床内的选定点。从添加纳米粒子后采集的红色和蓝色强度值减去这些背景强度值。计算每个像素的蓝色通道强度与红色通道强度的比率，以表示荧光(在bnp存在下恒定)与磷光(在氧存在下淬灭)的比例。然后使用256值色彩地图定性展示比率法图像，该地图被缩放到比例范围以在时空上解析荧光与磷光比。为了量化伤口床内的氧气量，使用原始蓝色和红色通道强度值来构建灰度图像(低氧：黑色像素，高氧：白色像素)。选择伤口床作为感兴趣区域，并使用imagej软件量化灰度像素均值。组织的收获、组织学切片和染色(第18天)：通过co2窒息将小鼠安乐死，并采集伤口的最终图像。将伤口中心周围1.5cmx1.5cm的区域切除，并针对三次单独的分析纵向三分。将三分之一的组织在液氮中快速冷冻并发送用于下游vegf信号传导蛋白的评估。将组织的中间三分之一固定在10％福尔马林中1周，并处理用于石蜡包埋。切割5μm切片并用苏木精和伊红(h&e)且针对cd31(圣克鲁兹生物技术公司(santacruzbiotechnology)，sc-1506，pecam-1(m-20))染色。血糖测量(第0天和第18天)：在第0天初始创伤之前，所有小鼠在没有食物的铺垫纸的笼中禁食4小时。创伤前进行初始禁食血糖测量。在第18天收获血液时，进行未禁食血糖测量，并对血液小样品取样。数据分析伤口面积定量：试验1和2的时间点。使用imagej，观察者追踪周边伤口，并且imagej计算开放伤口的面积。为了将观察者判断的差异考虑在内，每个伤口报告三个伤口面积的中值。将每个时间点的伤口面积针对初始伤口面积(第0天)归一化，以考虑初始伤口尺寸的微小差异。使用重复测量双向anova统计分析数据，显著性假定p<0.05。进行这些数据的三次样条插值，以分别计算到伤口闭合25％、50％和75％的估计时间。时间点之间的平均愈合百分比通过从先前剩余伤口面积的百分比减去剩余伤口面积的百分比来计算。使用重复测量双向anova分析数据，显著性假定p<0.05。cd31染色分析(试验1)：伤口组织的组织学横截面针对cd31免疫染色，并使用具有40x物镜的透射光学显微镜成像。棕色通道(阳性cd31标记)被界限为白色和黑色以去除背景和非特异性标记。对于n＝3的每个处理组，计算cd31阳性染色的面积阈值百分比。苏木精和伊红染色分析(试验1)：将来自每个伤口的石蜡切片用h&e染色，并使用透射光学显微镜使用4x物镜成像。目视检查肉芽组织，以定性评估表皮的厚度和连续性、肉芽组织的横截面面积(宽度和厚度)以及任何异常组织结构如血管瘤的存在或不存在。下游vegf信号传导分析(蛋白质印迹)(试验1)：将皮肤组织样品用ripa裂解缓冲液(sc-24948，圣克鲁兹生物技术公司(santacruzbiotechnology)，圣克鲁兹，加利福尼亚州)均质化，并离心，由布拉德福德(bradford)蛋白测定法(#5000112，bio-red，加利福尼亚州赫拉克勒斯)确定上清液的蛋白质浓度。将总蛋白30μg加载在聚丙烯酰胺凝胶(#3450124，bio-red，加利福尼亚州赫拉克勒斯)上并转移到膜(#1620232，bio-red，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)上。用以下抗体探测膜：抗pakt抗体(s473，#4060，细胞信号传导公司(cellsignaling)，丹佛斯，马萨诸塞州)和抗akt抗体(#4691，细胞信号传导技术公司(cellsignalingtechnology)，丹佛斯，马萨诸塞州)，抗兔igg二级抗体(irdye800cw，li-cor生物科学公司(li-corbiosciences)，林肯，内布拉斯加州)。使用imagej程序29进行pakt和akt条带的定量。身体质量和血糖分析：使用重复测量双向anova统计分析身体质量和血糖水平，显著性假定p<0.05。氧定量分析(试验2)：使用重复测量双向anova统计分析原始纳米粒子图像的灰度均值，显著性假定p<0.05。结果伤口面积测量结果(试验1)在试验1中包括的所有组中db/db小鼠的身体质量示于图21中。在所有时间点所有组的身体质量都相似，除了单次注射的运载体组和单次注射的vegf-a修饰的rna组在第13天有显著差异(p<0.05)。此差异不应认为对研究成果具有影响。在第0天和第18天，所有组的db/db小鼠中禁食血糖和非空腹血糖水平示于图22。所有组都是相似的，除了单次注射的运载体组和单次注射的vegf-a修饰的rna组在第0天有85mg/dl的显著(p<0.05)差异。此差异不应认为对研究成果具有影响。在18天观察时间期间伤口面积的测量结果示于图23-25中。关于开放性伤口区域的闭合，在第18天观察时间期间，在第0天单次注射vegf-a修饰的rna组剂量与其单次注射的运载体当量相比并没有显示任何显著的效果。另一方面，在第0天和第3天双次注射vegf-a修饰的rna的组显示显著(p<0.05)较快的闭合，在第6天为55％开放伤口面积并在第10天为27％开放伤口面积，相比之下对应地双次注射运载体组的第6天为71％开放伤口面积和第10天为49％开放伤口面积(图23)。曲线下面积分别为运载体单次注射962.83，运载体双次注射998.21，vegf-a修饰rna单次注射895.12，vegf-a修饰的rna双次注射792.79。到25％闭合的时间分别为单次注射运载体6.2天，双次注射运载体5.4天，单次注射vegf-a修饰的rna5.1天，以及双次注射vegf-a修饰的rna4.2天(图24)。到50％闭合的时间分别为单次注射运载体8.9天，双次注射运载体9.8天，单次注射vegf-a修饰的rna7.8天，以及双次注射vegf-a修饰的rna6.3天(图24)到75％闭合的时间分别为单次注射运载体12.3天，双次注射运载体13.7天，单次注射vegf-a修饰的rna12.5天，以及双次注射vegf-a修饰的rna10.4天(图24)当比较时间点之间伤口闭合的平均百分比时，相比于双次注射运载体组的20％变化，双次注射的vegf-a修饰的rna组显示显著(p<0.05)差异，在第3天至第6天之间有40％变化，而单次注射的vegf-a修饰的rna组与单次注射运载体组相比未显示显著性(图25)。组织学评价结果(试验1)图26显示了第18天伤口区域的h&e染色切片的代表性结果。此染色显示正常的肉芽组织，没有任何异常组织结构的迹象。在图27中，在单次和双次注射运载体和vegf-a修饰的rna之后，对于伤口区域切片分别显示代表性的cd31阳性染色。在图28所示的伤口区域中基于内皮细胞的血管的定量得到增加的面积阈值百分比，单次(4.3±4.0，均值±sd)和双次(8.4±4.4)注射vegf-a修饰的rna均为cd31阳性染色，分别相比于单次(3.2±0.6)和双次(3.2±0.6)注射运载体。用蛋白质印迹进行的下游vegf信号传导分析(试验1)在第18天，包括akt和vegfr2的下游vegf信号传导的分析结果示于图29和图30中。这些结果在第18天(研究结束)没有显示任何持续的下游信号传导。氧传感纳米粒子测量结果(试验2)在图31中，包括在两个组即试验2中的双次注射运载体和vegf-a修饰的rna中的db/db小鼠的身体质量显示为时间的函数。在所有时间点所有组的身体质量都是相似的。在试验2中，对应地，在db/db小鼠中双次注射运载体和vegf-a修饰的rna在第0天和第18天的禁食血糖和非空腹血糖水平示于图32中。两组中禁食血糖和非空腹血糖水平相似。在试验2中，将氧敏感性纳米粒子置于伤口中以估计氧合。在图33中，显示了纳米粒子氧定量背后技术的示意图。在室温和在激发后，纳米粒子发出由蓝色通道信号捕获的荧光和由红色信号通道捕获的氧依赖性磷光。当这些信号放在一起时，结果是伤口中相对氧合的图像。在图34中，显示了双次注射运载体的小鼠和双次注射vegf-a修饰的rna的小鼠的代表性图像，作为时间的函数。与双次注射运载体的小鼠相比，在第3天双次注射vegf-a修饰的rna的小鼠的伤口区域中的黄色和红色已经更突出。在第6天，双次注射vegf-a修饰的rna的组与双次注射运载体的组相比，氧合显著(p<0.05)增加(图35)。在18天观察时间期间伤口面积的测量结果示于图36-38中。在第0天和第3天双次注射vegf-a修饰的rna的组在第6天显示显著(p<0.05)更快的闭合，开放伤口面积为45％，相比之下对应地双次注射运载体的组开放伤口面积为62％。到25％闭合的时间分别为双次注射运载体3.4天和双次注射vegf-a修饰的rna3.8天。到50％闭合的时间分别为双次注射运载体7.1天和双次注射vegf-a修饰的rna5.6天。到75％闭合的时间分别为双次注射运载体8.9天和双次注射vegf-a修饰的rna7.8天。当比较时间点之间伤口闭合的平均百分比时，对应地相比于双次注射运载体组的14％变化，双次注射的vegf-a修饰的rna组显示显著(p<0.05)差异，在第3天至第6天之间有40％变化。结论在损伤后第0天和第3天分到伤口周围附近4个注射部位的100μgvegf-a修饰的rna的表皮内给予相对于运载体对照显著减少在第6天和第10天db/db小鼠中的开放伤口面积。在损伤后第0天和第3天分到伤口周围附近4个注射部位的100μgvegf-a修饰的rna的表皮内给予相对于运载体对照显著增加在早期时间点之间(第3至6天)伤口闭合的平均百分比。在损伤后第0天和第3天分到伤口周围附近4个注射部位的100μgvegf-a修饰的rna的表皮内给予相对于运载体对照且相对于仅在初始时间点(第0天)给予vegf-a修饰的rna，增加了第18天肉芽组织的组织学横截面中的cd31+免疫染色的面积。在损伤后第0天和第3天分到伤口周围附近4个注射部位的100μgvegf-a修饰的rna的表皮内给予相对于运载体对照显著增加了在第6天伤口中的氧量。6.15.实例15在体内，人vegf-a修饰的rna对小鼠耳朵血液动力学和新生血管形成的影响的光声显微镜检查在此实验中，在体内在健康的小鼠耳朵中监测对人vegf-a修饰的rna(vegf-a修饰的rna)的急性和慢性血管反应。应用多参数光声显微镜检查(pam)技术来动态表征vegf-a修饰的rna对血管直径、血色素氧饱和度(so2)、血流量和新生血管形成的影响。进行对vegf-a修饰的rna、重组人vegf-a蛋白和柠檬酸盐/盐水/运载体的反应的并行和定量比较。此外，通过比较高剂量(100μg/耳)和低剂量(10μg/耳)vegf-a修饰的rna诱导的结果，探讨了反应的剂量依赖性。研究表明，vegf-a修饰的rna在注射后不久(30分钟至6小时)诱导注射部位附近局部血流量的明显上调。另外，注意到注射高剂量vegf-a修饰的rna后7至14天不显著的毛细血管生成和新生血管形成，但注射低剂量vegf-a修饰的rna、vegf-a蛋白或柠檬酸盐/盐水的耳朵中不是这样。此外，在注射部位下游的微血管血流中vegf-a修饰的rna诱导醒目的和空间限制的上调，这与对人重组vegf-a蛋白的高度集中的应答有明显差异。本研究的目的是通过多参数光声显微镜检查(pam)技术来在健康的小鼠耳朵体内动态表征vegf-a修饰的rna对血管直径、血色素氧饱和度(so2)、血流量和新生血管形成的影响。化合物和配制品对照/参考化合物是来自r&d系统公司(614麦金利普莱斯ne(mckinleyplacene)，明尼阿波里斯市，明尼苏达州55413，美国)的重组人vegf-a165蛋白。测试系统研究设计实验程序对于完全非侵入式的小鼠耳朵成像，可以反复对相同的小鼠成像以对不同药物对血管直径、so2、血流量、血管生成和新生血管形成的影响进行延时监测。在皮内注射研究药物之前采集小鼠耳朵的基线图像。然后，将药物处理的耳朵监测6小时以捕获急性血管反应并在第7天再次成像以记录慢性血液动力学反应和可能的新生血管形成。为了检查vegf-a修饰的rna诱导的血管重塑的持续性，将用高剂量vegf-a修饰的rna处理的小鼠分别在第14、21和28天进一步成像。详细的pam成像方案如下：将小鼠在充满3％异氟烷吸入气体的小室中麻醉(典型流速为1至1.5l/min，取决于体重)。整个实验中以1.5％异氟烷维持麻醉。使用医用级空气作为吸入气体来将小鼠维持在正常生理状态。纯氧不适合，因为它将静脉血氧合提高到高于正常生理水平并偏向pam测量。随后，将小鼠从麻醉室转移到附近的立体定位阶段。使用加热垫将小鼠的体温保持在37℃。在立体定位阶段定位之后，将一层超声波凝胶施加在要成像的耳朵的表面上。注意避免在凝胶内捕获气泡。然后将耳朵放置在填充有去离子水的箱下面，并缓慢升高直到超声波凝胶与被聚乙烯薄膜覆盖的箱底缓慢接触。将软膏施加至眼睛以防止干燥和意外的激光损伤。然后将成像头降低直到声透镜浸入水箱中。去除在透镜下面捕获的任何气泡。因此，从上到下竖直设置包括声透镜、水箱、超声波凝胶和小鼠耳朵。然后检查激光能量密度，以确保其在美国国家标准协会的激光安全标准(即20mj/cm2)内运行。图像采集后，用去离子水清洁小鼠耳朵，并将其运回居住笼中。通过多参数pam同时获得三个血管参数(宁(ning)等人，微血管解剖学、氧饱和度和血流量的同时光声显微镜检查(simultaneousphotoacousticmicroscopyofmicrovascularanatomy,oxygensaturation,andbloodflow)，光学通讯(optlett)，2015，40：910-913)。在每个取样位置，血管解剖学通过pam采集的原始光声信号的希尔伯特变换(hilbert-transformation)直接产生。以双波长激发获得血管so2，通过其光吸收光谱来区分氧-和脱氧-血红蛋白。通过关联在532nm处获得的100个连续a线来定量血流速度。相关分析的时间窗设置为10ms。计算的相关系数的时间过程遵循二阶指数衰减，并且与血流速度成线性比例的衰减常数被提取用于流量定量。此外，借助于记录的血管分割算法提取了各个血管的平均直径、so2和血流量(瑟蒂克诺(soetikno)等人，光声显微镜检查获得的缺血性中风图像的血管分割分析(vesselsegmentationanalysisofischemicstrokeimagesacquiredwithphotoacousticmicroscopy)国际光学工程学会学报(proc.sspe)，2012，8223：822345)。将各组内不同动物的测量组合以用于统计分析。数据分析显示的结果是均值±sd。为了研究柠檬酸盐/盐水、vegf-a修饰的rna和人重组vegf-a蛋白处理的小鼠之间的定量差异，使用重复测量的混合模型进行统计分析。将具有协方差矩阵自回归结构的个体截距模型拟合到血管直径或容积流量自基线的差异。另外，使用基线血管直径或容积流量作为协变量来校正任何差异。结果将高剂量的vegf-a修饰的rna皮内注射在三只健康小鼠的耳朵中。血管结构、so2和血流量的代表性延时pam图像显示在图39中。注射后不久(即长达6小时)，在所有三只小鼠的注射部位周围观察到血管so2和血流量的显著上调。在第7、14、21和28天重复采集的pam图像显示，先前上调的so2逐渐回退，而血流量保持在基线之上。除了持续的血流上调外，在三只高剂量的vegf-a修饰的rna注射的耳朵中的两个中观察到醒目的血管生成和新生血管形成(图40)。在pam图像中的这些新血管的强烈对比意味着它们被红细胞高度灌注。确切地，如在图40中看到的，新血管在注射后14天出现，在第21天回退，并在第28天“消失”。类似地，在第二高剂量小鼠中，新血管在第7天出现，并在注射后14天“消失”。新血管的“回退/消失”可能是由于血液灌注的丧失。为了探索减少的vegf-a修饰的rna剂量是否可以诱导血流上调和新生血管形成，评估了对较低剂量的vegf-a修饰的rna(30μg和10μg)的血管反应。在注射了30μgvegf-a修饰的rna的一只小鼠中，诱导so2和血流中较不持续的上调，其在第14天回退到基线。尽管能够在注射部位周围产生毛细血管生成，但未观察到明显的新生血管形成。在两只小鼠中降低vegf-a修饰的rna剂量甚至更低(至10μg)导致进一步的血管反应受损(图41)。确切地，血管so2和血流量的急性上调略微更弱并且较不持续(在第7天回退到基线)，并且没有观察到明显的新生血管形成或血管生成。这些结果进一步证实了对vegf-a修饰的rna的血管反应的剂量依赖性。为了比较，在三只小鼠中研究了对人重组vegf-a蛋白的血管反应(图42)。与高剂量和中剂量vegf-a修饰的rna类似，在整个7天的监测期内vegf-a蛋白诱导局部so2和血流的持续上调。然而，在第7天，在三只小鼠中的两只中仅观察到非常适度的毛细血管生成，并且在所有情况下均未观察到新血管。最后，进行三个对照实验以检查对柠檬酸盐/盐水的血管反应。如在图43中显示的，局部so2和血流量在注射后不久稍微上调，可能是由于组织间隙液压增加，并在第7天恢复到基线水平。没有观察到血管生成、新生血管形成或炎症反应。使用血管分割，进一步定量比较对高剂量vegf-a修饰的rna、人重组vegf-a蛋白和柠檬酸盐/盐水的血管反应，并在图44中示出。在注射vegf-a修饰的rna和vegf-a蛋白后不久观察到急性和明显的血管舒张和流量上调。响应于柠檬酸盐/盐水注射还观察到血管直径和血流上的适度反应，可能是组织间隙液压增加的结果。作为反应，对于处理和被视作对照的柠檬酸盐/盐水，随着时间的推移比较血管直径(4个血管的均值)自基线(注射前)的变化。治疗与时间的相互作用是统计学上显著的(p<0.0001)。在7天时，所有处理与彼此统计学上有差异(p＝0.0009)，并且在6小时处，vegf-a修饰的rna和人重组vegf-a蛋白与盐水不同(p＝0.004)。对容积流量自基线的变化进行类似的分析(4个血管的均值)。对于处理和被视为对照的柠檬酸盐/盐水，随着时间的推移比较容积流量的变化。治疗与时间的相互作用是统计学上显著的(p＝0.02)。在第7天，vegf-a修饰的rna和人重组vegf-a蛋白与柠檬酸盐/盐水不同(p＝0.0015)。注射后7天，柠檬酸盐/盐水组的血管直径和血流量返回到基线，这与vegf-a修饰的rna和人重组vegf-a蛋白组中的持续血管舒张和流量上调形成醒目对比。进一步探索对局部注射的微血管反应的空间依赖性。为此，使用血管分割除去直径大于50μm的所有主要血管，并且随后将剩余的微血管分成微节段。然后，通过叠加个体微节段的值将微血管so2和血流量延伸到组织水平。叠加中的加权因子被定义为微节段的质心与感兴趣组织的位置之间的距离的倒数。将在注射vegf-a修饰的rna(即基线)之前采集的组织水平流量和so2地图从第7天采集的减去，显示在注射部位的微血管血流下游中醒目的(即约4倍)和空间上限制的上调(图45)，而微血管so2的变化是适度的(图45)。相比之下，vegf-a蛋白诱导的微血管流量上调在注射部位周围不太明显且更集中(图46)，但微血管so2的增加更为显著。如所预期的，在第7天对盐水注射的微血管反应去除(图47)。结论使用多参数光声显微镜检查和血管分割，监测并比较了对皮内注射vegf-a修饰的rna、人重组vegf-a蛋白和柠檬酸盐/盐水的时空血管反应。证明vegf-a修饰的rna可以在体内诱导剂量依赖性的显著和持续的血管生成、血流上调、毛细血管生成和新生血管形成。此外，在注射部位下游的微血管血流中vegf-a修饰的rna诱导醒目的和空间限制的上调，这与对人重组vegf-a蛋白的高度集中的应答有明显差异。6.16.实例16在体内，兔皮内注射vegf-a修饰的rna后人vegf-a蛋白的表达和检测在此实验中，用微量透析技术研究了在柠檬酸盐/盐水中配制的人vegf-a修饰的rna(vegf-a修饰的rna)的皮内(id)注射后兔皮肤中vegf-a蛋白的产生。在4只经麻醉的兔子的每一只中，在左后腿上皮内插入两个微量透析探针。在t＝0小时(h)时，开始两个微量透析探针的回收时间。1小时后，接近每个微量透析探针给出vegf-a修饰的rna的4次注射(每次50μl和50μg)。每小时在冰上收集含蛋白质的洗脱物，在t＝2h开始，直至t＝6h。最后一次洗脱物收集后，注射部位周围的区域被切除。在注射vegf-a修饰的rna后3小时，在8个探针中的3个的洗脱物中发现人vegf-a的可检测水平(218±155，均值±sem)。相应地，在注射后4和5小时，分别在8个探针中的5个和8个探针中的5个的洗脱物中检测到vegf-a蛋白。尽管观察到的浓度变化很大；但蛋白质水平在这些时间点趋于稳定(分别为369±217和360±203pg/ml)。可以得出结论，在皮内注射vegf-a修饰的rna后3至5小时，可以在兔皮肤中用微量透析技术检测人vegf-a蛋白。化合物和配制品测试系统物种兔性别雄性动物总数4研究设计实验程序麻醉和维持体内平衡：将新西兰白色(nzw)雄性兔分别用作为静脉内推注给予的氯胺酮(5mg/kg，辉瑞(pfizer)ab，索伦蒂纳市，瑞典)和美托咪定(0.15mg/kg，奥利昂药物公司(orionpharma)，埃斯波，芬兰)进行麻醉，随后维持输注(11和0.33mg/kg*h)。将兔子插管并使用伺服呼吸机(900d，西门子埃莱马(siemenselema)，索尔纳，瑞典)用室内空气和10％o2的混合物进行人工通气。呼吸速率在30周期/min保持恒定。在实验前和实验过程中，通过血液气体分析仪(abl800flex，辐射计(radiometer)，哥本哈根，丹麦)测量动脉血中的血液气体和ph值，并且如果需要，将其通过调节潮气量调整为落入正常生理范围内。通过覆盖动物并通过外部加热将直肠温度保持在38℃和39.5℃之间。动物制剂：将用于给予麻醉剂的经皮聚乙烯导管(venflon0.8mm，比戈(viggo)，赫尔辛堡，瑞典)插入左耳的边缘静脉。将聚乙烯导管(intramedicpe-90clayadams，贝迪公司(bectondickinson)，斯帕克斯，马里兰州，美国)插入右颈动脉分别用于动脉血压记录(通过压力传感器，彼得·冯·伯格·梅蒂井特赫尼克(petervonbergmedizintechnik)gmbh，基尔希塞翁/恩格尔哈廷(kirchseeon/englharting)，德国)和血液采样。通过使用计算机和软件(pharmlabv6.6，阿斯利康(astrazeneca)r&d瑞典)记录血压测量信号并采样。左后腿的皮毛用电动剃须刀去除。微量透析：根据供应商提供的说明，在每个实验中将两个100kda线性微量透析探针(命名为a和b)(66线性导管&66高截断线性导管，m透析ab，哈马比(hammarby)，瑞典斯德哥尔摩)皮内插入到兔子左后腿的上部。将微量透析探针用0.5μl/min盐水(9mg/ml，费森尤斯卡比公司(freseniuskabiag)，巴特洪堡(badhomburg)，德国)灌注，并将洗脱物样品收集在预先称重的0.5ml管(蛋白lobind，埃普多夫公司(eppendorfag)，汉堡，德国)中的冰上。透析膜和收集管出口之间的死区约为1.5μl。测定每种洗脱物的容积，并以1:1的条件添加磷酸盐缓冲盐水(pbsph7.4，生命技术公司(lifetechnologies)tm的派斯利，英国)中的2％牛血清白蛋白(bsa，a7979，西格玛奥德里奇，圣路易斯市，密苏里州，美国)。将这些样品在-80℃下保存直到分析。实验方案：图48a中示出了实验设计。在t＝0h时，开始两个微量透析探针的回收时间。1小时后(即t＝1h)，收集回收洗脱物，并随后在微量透析-探针部位进行4次注射，如图48b所描绘的。从t＝2h至t＝6h，每小时收集含蛋白质的洗脱物，并如上所述进行处理。在研究结束时，通过致死的静脉内剂量的戊巴比妥钠(allfatalvet，omnideaab，斯德哥尔摩，瑞典)终结动物。微量透析洗脱物中人vegf-a蛋白的评估：使用gyrolab平台测定微量透析洗脱物样品中表达的人vegf-a浓度。gyrolab使用具有微结构孔的亲和力流通版式(gyros，乌普萨拉，瑞典)。使用由含有具有链霉亲和素涂覆材料(gyros)的亲和捕获柱的96个微结构孔组成的gyrolabbioafy1000cd。首先，将针对人vegfa(af-293-na，r&d系统公司，阿宾顿，英国)的生物素化捕获多克隆抗体固定在链霉亲和素柱上，其中样品通过旋转重力流过，并且分析物被捕获在抗体上。然后使针对人vegf-a(r&d系统公司)的alexa标记的检测抗体流过柱，并使用荧光强度来定量配体。使用五参数线性拟合产生标准曲线，并根据其吸光度从标准曲线计算样品浓度。用msd稀释液9(中尺度发现公司(mesoscalediscovery)，罗克维尔，马里兰州，美国)中的人vegf-a165(293-ve-010，r&d系统公司)制备范围为16.7pg/ml至12170pg/ml的标准曲线。质量控制品是从msd稀释液9中的人vegf-a165的who标准品(国家生物标准与控制研究所(nationalinstituteforbiologicalstandardsandcontrol)，赫特福德郡，英国)准备的。将所有标准品、qc和样品与rexxiphn-max(gyros)在分析前1:1混合。数据分析：结果呈现为均值±sem。结果来自四只兔子(两个各自插入探针，a和b)的个体人vegf-a蛋白水平在图49中呈现为均值±sem。在注射vegf-a修饰的rna后3小时，在8个探针中的3个的洗脱物中发现人vegf-a的可检测水平(218±155，均值±sem)。相应地，在注射后4和5小时，分别在8个探针中的5个和8个探针中的5个的洗脱物中检测到vegf-a蛋白。尽管观察到浓度变化很大，但蛋白质水平在这些时间点趋于稳定(分别为369±217和360±203pg/ml)。结论在皮内注射vegf-a修饰的rna后3至5小时，用微量透析技术检测到人vegf-a蛋白在兔皮肤中表达。6.17.实例17体内向经受心肌梗塞的猪心内注射人vegf-a修饰的rna后对毛细血管和小动脉密度以及纤维化的影响在兰屿小型猪中进行vegf-a修饰的rna(1或10mg)、柠檬酸盐/盐水(2ml)或假手术对毛细血管和小动脉密度以及纤维化的影响的评估。毛细管和小动脉密度测定：在研究终止后，在4℃将来自梗塞周围区域的组织样品在4％多聚甲醛中固定至少24小时，并且然后石蜡包埋。切片后，脱石蜡并再水合，通过在10mmol/l柠檬酸钠缓冲液(ph6)中煮沸10分钟进行抗原修复。然后将切片用抗心肌肌钙蛋白i(1:200，dshb，爱荷华，爱荷华州，美国)、抗-同工凝集素(1:100，英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)和sm-22α(1:200，艾碧康(abcam)，剑桥，英国)孵育过夜。洗涤三次后，将切片用相关的alexafluor488或568抗体(英杰公司)进行孵育。将细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，西格玛奥德里奇，圣路易斯市，密苏里州，美国)染色。安装后，通过从沿着梗塞周围区域的三个随机选择的区域拍摄的图像(200倍放大)手动计数和求平均值计算毛细血管和小动脉密度。纤维化测量：将远离梗塞/梗塞周围区域的样品如上所述针对梗塞周围区域样品进行处理。使用梅森氏三色染色(masson’strichromestaining)测定根据胶原沉积的纤维化。使用亮视野显微镜(200倍放大)从三个随机选择的区域针对每个切片拍摄图像，并且然后定量(axiovision，蔡司，慕尼黑，德国)并求平均值。结果图50a和图50b说明了诱导心肌梗塞后两个月评估的假手术或注射vegf-a修饰的rna(1或10mg)或柠檬酸盐/盐水(2ml)对梗塞周围(边界)区域中的毛细血管和小动脉密度的影响。如所见的，vegf-a修饰的rna的注射与毛细血管和小动脉密度的剂量依赖性和统计学显著性增加相关(相比柠檬酸盐/盐水的注射)。证明vegf-a修饰的rna对比柠檬酸盐/盐水的注射统计学上显著减小远离梗塞区域收获的组织样品中的胶原含量(即纤维化)(图50c)。6.18.实例18体外人vegf-a修饰的rna转染之后vegf-a蛋白产生的时间历程为了研究vegf-a修饰的rna转染之后人vegf-a蛋白产生的时间曲线，将10,000个人主动脉平滑肌细胞(haosmc，龙沙公司，巴塞尔，瑞士)或20,000个衍生自诱导多能细胞的人心肌细胞(hips-cm，细胞动力公司(cellulardynamics)，麦迪逊，威斯康辛州，美国)分别接种在96-孔板中补充有生长因子的平滑肌细胞基础培养基(smgm-2，龙沙公司)或充分补充的心肌细胞维持培养基(细胞动力公司)中。第二天，在无血清培养基中进行转染，并根据制造商的说明书将250ngvegf-a修饰的rna与脂质转染胺2000(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)混合并加入到细胞中。使用与水混合的脂质转染胺2000作为转染对照。每8个小时用新鲜培养基代替培养基，并在不同时间点用elisa测量上清液中的人vegf-a蛋白。在人主动脉平滑肌细胞和人心肌细胞中由vegf-a修饰的rna产生的人vegf-a蛋白的多少在转染后大约8小时达到峰值，并且然后下降到低水平(图51)。转染后32小时，没有检测到或检测到非常低水平的蛋白质。6.19.实例19小鼠中心肌梗塞后心外膜衍生细胞扩张的时间历程将雄性c57bl/6小鼠用异氟烷麻醉，插管并连接到呼吸机，并用补充有空气和氧气(80％/20％)的2.5％至3％异氟烷人工通气。通过加热的操作台和加热灯将直肠温度保持在37.5℃。随后，将胸部剃光，并将ecg针电极插入爪中，以评估心率和ecg。在皮肤上进行切口，仔细分离胸部肌肉，并将第四肋间隙打开以便胸部牵引器插入。轻轻地解剖心包，并将7-0结扎丝线置于左心房略下方的左前降支冠状动脉周围，用于永久性闭塞。通过视觉检查(远离缝合线的左心室变暗淡)和ecg的st升高证实了缺血。对照动物未经受动脉闭塞。然后用6-0可吸收缝合线闭合肋骨和皮肤。皮下给予镇痛剂(丁丙诺啡，0.05mg/kg，10ml/kg)，并使小鼠在其笼中在电加热垫上恢复。在心肌梗塞(mi)后第3天、第7天和第14天处死小鼠。切下心脏，并且然后在盐水中冲洗，之后进行福尔马林固定。通过免疫组织化学法，通过维耳姆瘤蛋白1(wt-1)表达来评估心包膜衍生的细胞(epdc)活化。将福尔马林固定的心脏从顶部到基部横向切成1mm切片。将心脏切片在乙醇和二甲苯中脱水，包埋在石蜡中，并且最后切成4μm切片。使用针对wt-1(稀释1:200，calbiochem，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)的兔多克隆抗体在温塔娜发现(ventanadiscovery)xt自动染色机中进行作为epdc标记的wt-1的免疫组织化学检查。所有试剂均为温塔娜(ventana)产品(罗氏公司(roche)，巴塞尔，瑞士)。对wt-1阳性(wt-1+)细胞进行盲法评价，并通过手动评分系统进行评价。得分定义为：0：无wt-1+细胞，1：稀有数量的wt-1+阳性细胞，2：在心脏中位于特定水平的单层中很少的wt-1+阳性细胞，3：位于心脏中若干水平的中等数量的wt-1+阳性细胞，以及4：在心脏中位于若干水平的厚层中大量wt-1+阳性细胞。在对照非梗塞心脏的心外膜中发现很少的wt-1+epdc(图52a)。诱导mi后，激活wt-1+epdc，并扩增数量在mi后7天达到峰值(图52b)。7.序列表7.1.seqidno:1：实例中使用的编码vegf-a的经修饰的rna5’7megpppg2’omeggaaauaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagagccaccaugaacuuucugcugucuugggugcauuggagccuugccuugcugcucuaccuccaccaugccaaguggucccaggcugcacccauggcagaaggaggagggcagaaucaucacgaaguggugaaguucauggaugucuaucagcgcagcuacugccauccaaucgagacccugguggacaucuuccaggaguacccugaugagaucgaguacaucuucaagccauccugugugccccugaugcgaugcgggggcugcugcaaugacgagggccuggagugugugcccacugaggaguccaacaucaccaugcagauuaugcggaucaaaccucaccaaggccagcacauaggagagaugagcuuccuacagcacaacaaaugugaaugcagaccaaagaaagauagagcaagacaagaaaaucccugugggccuugcucagagcggagaaagcauuuguuuguacaagauccgcagacguguaaauguuccugcaaaaacacagacucgcguugcaaggcgaggcagcuugaguuaaacgaacguacuugcagaugugacaagccgaggcggugauaauaggcuggagccucgguggccaugcuucuugccccuugggccuccccccagccccuccuccccuuccugcacccguacccccguggucuuugaauaaagucugagugggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaucuagoh3’(seqidno:1)其中：对应地，a，c，g&u＝amp，cmp，gmp&n1-甲基-假umpme＝甲基p＝无机磷酸盐7.1.seqidno:2：人vegf-a同种型vegf-165的氨基酸序列mnfllswvhwslalllylhhakwsqaapmaegggqnhhevvkfmdvyqrsychpietlvdifqeypdeieyifkpscvplmrcggccndeglecvpteesnitmqimrikphqgqhigemsflqhnkcecrpkkdrarqenpcgpcserrkhlfvqdpqtckcsckntdsrckarqlelnertcrcdkprr(seqidno:2)7.3.萤光素酶mrna构建体7.4.laczmrna构建体当前第1页12