与工艺杂质的结合降低的抗体的制作方法

本发明涉及新型抗体，其具有的通过非特异性和/或特异性相互作用结合制造工艺杂质(诸如宿主细胞蛋白)的能力降低。更具体地，本发明涉及新型免疫球蛋白，其通过对抗体的氨基酸序列的修饰而具有降低的结合此类制造工艺杂质的能力。发明背景单克隆抗体(mabs)是生物药物，其用于大范围疾病的治疗处理。这些复杂重组蛋白的制造通常需要使用生物宿主系统，其通过基因工程改造能够以合适活性的形式表达产物。在这方面，哺乳动物细胞系，诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞，泛在地用作许多mab产品的工业生产的宿主，因为它们能够折叠、组装这些蛋白并对这些蛋白应用适当的翻译后修饰，确保它们与人类系统的相容性。后果，和由此使用基于细胞的系统用于生产mab的关键挑战，是需要从一定范围的其他复杂杂质分离产物蛋白。这些被称为工艺相关的杂质，且包括各种范围的蛋白，所述蛋白对宿主生物是内源的或与此类细胞相关(诸如病毒样蛋白)。这些所谓的宿主细胞蛋白(hcp)代表了广泛类别的分子，其有可能负面影响生物制药药物的稳定性和安全性。一些hcp可具有蛋白水解活性，其可不利地影响产物蛋白的稳定性。如果存在于最终药物产品中，则其他hcp有可能在患者中引起免疫原性响应。由于这些原因，hcp的清除代表了所有生物制药产品的制造的主要挑战。宿主细胞蛋白的清除通常通过使用多种色谱纯化技术，利用正交分离化学法来实现。尽管这种方法通常是有效的，但当产物mab表现出与构成hcp群体的一种或多种蛋白的一定相互作用或亲和力时出现挑战，导致这些hcp与产物的共纯化。在此类情况下，标准方法是开发合适的色谱柱洗涤策略，其从物理化学角度设计，以破坏这些相互作用。由于hcp相互作用的倾向在mab分子之间变化，通常认为抗体的高变互补决定区(cdr)主要负责这些相互作用。然而，尚未阐明这些区域内导致相互作用增加的精确序列和结构基序。在表示为g、a、m、d和e的五类免疫球蛋白(ig)中，大多数mab生物药物落在免疫球蛋白g(igg)类内，其中存在编号为1至4的四个亚类。最近，已经显示hcp诸如推定的磷脂酶b样2(plbl2)，也称为含磷脂酶b结构域的蛋白2(plbd2)，具有增加的与某些免疫球蛋白变体共纯化的倾向。这种与一些igg同种型(但不是其他)共纯化的倾向的差异的确切原因尚不清楚，但先前的研究已经假定igg和plbl2之间的相互作用主要由cdrs驱动，但由igg4恒定区的特征(将其与igg1亚类区分开)促进(tran等人(2016)j.chromatogr.1438:31-38)。然而，这些差异的确切性质仍然未知。工艺杂质(诸如plbl2)有可能在患者中引发免疫响应。此外，已经将脂酶诸如plbl2鉴定为降解制剂赋形剂的潜在原因(dixit等人,(2016)j.pharm.sci.,105(5):1657-66和us2016/0101181)。这些赋形剂对于最终制剂中产物蛋白的稳定化是必需的，并且它们的分解会损害保质期并因此损害药物的潜在安全性。由于这些原因，在最终药物产品中存在工艺杂质和hcp(诸如plbl2)是非常不期望的。某些免疫球蛋白与hcp(诸如plbl2)相互作用的增加倾向，使得有必要开发专门的纯化方案以确保足够安全的最终药物产品。这种方法尽管有效，但是并不理想，因为它不仅增加了相关的制造成本，而且还增加对工艺验证的负担，并且需要显示纯化工艺可以将工艺杂质稳健地清除至可接受的水平。其次，这在增加的分析要求方面也具有影响，因为已经显示plbl2难以通过常规技术检测，经常需要使用定制的免疫测定(wo2015/038884)。因此，仍然需要更有效和成本有效地降低治疗性免疫球蛋白的最终药物产品中的hcp的水平。发明概述根据本发明的第一个方面，提供了在重链恒定区中的kabat残基203和256之间的区域中的氨基酸的任一个或组合处已经被修饰的变体igg4抗体，其中所述变体igg4抗体相比于未修饰的igg4抗体具有与宿主细胞蛋白(hcp)的降低的结合水平。根据本发明的进一步方面，提供了编码如本文定义的变体igg4抗体的细胞系。根据本发明的进一步方面，提供了修饰igg抗体以降低对工艺杂质的结合的方法，其包括以下步骤：a)鉴定参与工艺杂质的结合的至少一个氨基酸；和b)通过用不同氨基酸取代鉴定为参与与工艺杂质的结合的氨基酸来产生所述igg抗体的变体。根据本发明的进一步方面，提供了产生与宿主细胞蛋白(hcp)的结合降低的igg4抗体的方法，其包括修饰在重链恒定区中的kabat残基203和256之间的区域中的氨基酸的任一个或组合处的抗体序列。根据本发明的进一步方面，提供了包含如本文定义的变体igg4抗体的组合物。图/附图简述图1：最终批量mab的hcpelisa稀释线性度。通过hcpelisa分析不同亚型的人源化igg产物的最终批量样品，以评价测定中的稀释非线性度。通过将测量的hcp浓度乘以稀释倍数且然后除以产物浓度，计算每种稀释度的经调整的hcp值。将每个样品稀释度的经调整的hcp值在双对数标度上绘制为稀释倍数的函数。当经调整的hcp值随着稀释倍数增加而增加时，观察非线性度。仅mab7在hcpelisa中表现出非线性度。图2a-b：不同mab的抗plbl2western印迹。通过western印迹分析人源化igg产物的最终批量样品以检测plbl2的存在。(a)syproruby染色的凝胶以证实样品的上样量相等。(b)用抗plbl2抗体探测western印迹。仅在mab7样品中在约60kda处检测到plbl2，如图像右侧的箭头所示。图3a-c：通过spr的plbl2与不同mab的结合。plbl2与不同mab结合的表面等离振子共振(spr)传感图。(a)传感图表明固定的抗人iggfc单克隆抗体对所有7种mab的类似捕获水平，其中通过在~200秒处的箭头指示mab注射，且通过在0秒处的箭头指示plbl2注射。放大的传感图显示plbl2与mab1、mab3、mab5和mab7(b)，以及与mab2、mab4和mab6(c)的结合和解离，证明plbl2与igg4分子选择性结合。图4a-b：plbl2与mab7的结合亲和力。表面等离振子共振结合实验以计算plbl2与mab7结合的亲和力。(a)传感图显示将plbl2浓度从1.25μm增加至80μm与增加的与mab7的结合相关。(b)作为plbl2浓度的函数的稳态结合响应的图。用于计算kd的1:1结合模型。图5：plbl2与mab3、mab6a和mab6b的结合。plbl2与在两种不同的宿主细胞表达系统中表达的mab3和mab6结合的表面等离振子共振传感图。使用chok1a宿主系统表达mab6a，而使用hek293宿主表达系统表达mab6b。结果显示尽管在不同细胞系中产生，但两种igg4分子(mab6a和mab6b)相当地与plbl2相互作用。同时igg2分子(mab3)不相互作用。图6a-c：plbl2与mab3、mab6a和mab6b的结合亲和力。在(a)mab3、(b)mab6a和(c)mab6b上的生物层干涉测定法(bli)实验的结果，其显示这些分子与plbl2的结合亲和力的拟合。使用局部拟合用1:1结合模型计算kd结果。注意，因为没有相互作用，不能获取mab3的亲和力数据。图7：单独的mab7和plbl2结合的样品的hdx微分图。在0.5分钟、5分钟、60分钟、120分钟、180分钟和240分钟测量氘标记。竖杆代表来自六个标记时间点的各肽的总hdx差异。具有显著降低的溶剂暴露的序列区域标记为k218-f256(重链)。图8：不同mab的序列比对。mab1-7的下部ch1、铰链和上部ch2结构域的氨基酸序列针对人类种系igg1、igg2和igg4的相应位置中的氨基酸进行比对。比对限于igg4的铰链区，基于比较不同mab分子的plbl2结合的实验，其可能是plbl2结合位点。序列之间的差异以灰色突出显示。目标氨基酸残基是在其中观察到plbl2结合的igg4分子中保守和在其中观察到plbl2不结合的其他igg亚型中不保守的残基(即，不同的残基)。鉴定了10种此类氨基酸，其由黑框标示。图9：经由诱变的不同mab的序列比对。经由亲本igg4(mab5)的诱变产生总共7种不同的铰链修饰的igg4变体(mab5-1b至7b)。该比对将igg4变体的氨基酸序列与亲本igg4的氨基酸序列以及两种其他非铰链修饰的igg4(mab6和mab7)和igg2(mab3)和igg1(mab8)进行比较。后缀“a”或“b”表示抗体是经由cho(a)还是由hek(b)哺乳动物宿主细胞表达。氨基酸序列的差异以灰色突出显示。然后，标示的灰色框突出显示被认为在影响plbl2结合中发挥作用的氨基酸残基。igg4变体中铰链序列的突变以黑色突出显示。图10：igg2、igg4和变体igg4分子与plbl2的相互作用。测试plbl2与铰链修饰的igg4变体(mab5-1b至7b)相比于未修饰的亲本(mab5b)的结合的表面等离振子共振(spr)实验的结果。在分析中包括几种其他mab(包括igg1(mab8a)、igg2(mab3b)和igg4(mab6b和mab7a))作为进一步的对照。后缀“a”或“b”表示抗体是经由cho(a)还是由hek(b)哺乳动物宿主细胞表达。发明详述本发明涉及具有降低的与工艺杂质(诸如hcp，包括plbl2)的相互作用的抗体。已经发现，在某些位置的残基处修饰(例如通过取代、插入或缺失)氨基酸导致某些抗体结合hcp诸如plbl2的能力降低。这种降低的相互作用的倾向导致工艺杂质(诸如plbl2)的共纯化水平降低，消除了旨在清除该工艺相关杂质的特定纯化策略的需求。实际上，例如，plbl2与并入这些氨基酸残基变化的igg4分子结合的水平与其中未发现plbl2共纯化是问题的那些一致。这进而增加制造工艺的效率，降低相关成本，减轻过度产品测试的需求，并最终有助于确保患者安全性。除此之外，脂肪酶诸如plbl2已经被鉴定为降解最终制剂中产物蛋白(重组抗体)的稳定化所必需的制剂赋形剂(诸如聚山梨醇酯80)的潜在原因。减少plbl2的结合将用于使最终配制的药物中该hcp的潜在水平最小化，由此使产物(重组抗体)的保质期最大化，这将进一步降低成本并确保安全性。igg4的效应子功能igg4在重链恒定区中与igg同种型igg1、igg2和igg3共有超过95%的序列同源性。与igg1相比，igg4对活化的fcγ受体(fcγriia和fcγriiia)具有低结合亲和力。与igg1相比，igg4对高亲和力fcγri具有弱至中等结合亲和力。igg4保持与抑制性fcγriib的结合亲和力，与igg1类似。igg4也以与igg1类似的方式结合至fcrn。igg4显示与c1q蛋白复合物没有结合或可忽略不计的结合，并且不能活化经典补体途径，由此具有降低的cdc活性。igg4具有降低的adcc活性或没有adcc活性。效应子结合的这种减少已导致选择igg4重链恒定结构域用于重组抗体中，其中效应子功能是不必要的或是不期望的。核心igg4铰链包含序列cpsc(seqidno:19)，而核心igg1铰链包含cppc(seqidno:20)，其对还原不太敏感。igg4中的s241(kabat)导致更柔性的铰链，能够形成链内环化二硫化物，并导致出现“半抗体”，其含有来自不同抗体的非共价连接的重链，通常称为igg4fab臂交换。igg4的核心铰链可以通过将s241修饰为脯氨酸(即，s241p)来稳定化，如igg1中那样。许多治疗性igg4抗体具有铰链工程改造的区域，包括s241p取代。在l248e变体不存在的情况下，igg4-s241p单一取代是可能的，以保留正常的fcγri结合。与igg1相比，igg4l248e变体降低igg4-pe与fcγri的结合亲和力，并且对fcγri的亲和力比igg4野生型弱约20倍。igg4序列修饰本发明人已经鉴定了igg分子的保守区和所述分子结合工艺杂质(诸如hcp，包括但不限于plbl2)的能力之间的意外联系。具体地，本发明人已经鉴定了igg4亚类抗体的高度保守的铰链区和周围序列中的关键氨基酸残基，其负责引起这些抗体与hcp(诸如plbl2)的结合。当这些氨基酸残基被修饰时，与没有前述修饰的亲本igg4分子相比，所得修饰的igg4分子显示结合hcp(诸如plbl2)的能力降低，同时保持与没有所述修饰的情况下相同的igg4效应子功能(例如，igg4分子的fcrn受体结合行为)。此外，修饰的igg4分子至少维持(或增强)没有所述修饰的igg4的生物物理特性，诸如稳定性、剪切行为。因此，根据本发明的第一个方面，提供了在重链恒定区中的kabat残基203和256之间的区域中的氨基酸的任一个或组合处已经修饰的变体igg4抗体，其中所述变体igg4抗体相比于未修饰的igg4抗体具有与宿主细胞蛋白(hcp)的降低的结合水平。在一个实施方案中，所述一个氨基酸或氨基酸的组合在kabat残基203和243之间。在进一步实施方案中，所述一个氨基酸或氨基酸的组合在kabat残基222和243之间。在替代实施方案中，所述一个氨基酸或氨基酸的组合在kabat残基222和256之间。在一个实施方案中，所述一个氨基酸或氨基酸的组合选自：(i)在kabat残基226和243之间的铰链区的一个或多个氨基酸；和/或(ii)kabat残基203；和/或(iii)kabat残基222。在一个实施方案中，未修饰的igg4抗体具有eskygppcpscp(seqidno:21)或eskygppcppcp(seqidno:22)(即，kabat位置226-243)的铰链区序列。在一个实施方案中，所述铰链区在kabat残基203和256之间。在一个实施方案中，所述铰链区在kabat残基226和243之间。在进一步实施方案中，所述铰链区在kabat残基226和238之间。在替代实施方案中，所述铰链区在kabat残基234和250之间。在一个实施方案中，所述变体igg4抗体包含序列cppc(seqidno:20)(kabat残基239至242)。这被称为“核心铰链”。在替代实施方案中，所述变体igg4抗体包含序列cpsc(seqidno:19)(kabat残基239至242)。在一个实施方案中，所述修饰包含在kabat残基203和256之间的区域中的氨基酸的任一个或组合的缺失。在一个实施方案中，所述修饰包含在kabat残基203和256之间的区域中的一个或多个氨基酸的插入。在一个实施方案中，所述修饰包含在kabat残基203和256之间的区域中的一个或多个氨基酸的取代。存在于重链的铰链区中或在重链的铰链区附近的关键igg4氨基酸残基是：在位置197处的丝氨酸(s197)、在位置198处的亮氨酸(l198)、在位置203处的赖氨酸(k203)、在位置207处的苏氨酸(t207)、在位置211处的天冬氨酸(d211)、在位置222处的精氨酸(r222)、在位置226处的谷氨酸(e226)、在位置227处的丝氨酸(s227)、在位置229处的酪氨酸(y229)、在位置230处的甘氨酸(g230)、在位置237处的脯氨酸(p237)、在位置238处的脯氨酸(p238)、在位置246处的谷氨酸(e246)、在位置247处的苯丙氨酸(f247)、在位置249处的甘氨酸(g249)、在位置250处的甘氨酸(g250)和在位置251处的脯氨酸(p251)。目标序列显示于图8和9中。关键igg4氨基酸残基是：在位置203处的赖氨酸(k203)、在位置222处的精氨酸(r222)、在位置226处的谷氨酸(e226)、在位置227处的丝氨酸(s227)、在位置229处的酪氨酸(y229)、在位置230处的甘氨酸(g230)、在位置237处的脯氨酸(p237)和在位置238处的脯氨酸(p238)。igg4铰链区的修饰可以包含在这些位置周围实施一个或多个氨基酸取代，产生具有降低的结合hcp(诸如plbl2)的能力的修饰的igg4分子。另外，igg4铰链区的修饰可以包含移除在位置229处的酪氨酸(y229)和/或在位置230处的甘氨酸(g230)，并且在某些实施方案中，这些消除与在先前列举的位置之一处的至少一个氨基酸取代或进一步消除组合，产生相比于亲本igg4抗体具有降低的结合hcp(诸如plbl2)的能力的变体igg4抗体。在另一个实施方案中，igg4铰链区的修饰可以包含移除在位置229处的酪氨酸(y229)和/或在位置230处的甘氨酸(g230)，其与在位置237和238处的脯氨酸残基(p237和p238)的至少一个氨基酸取代或进一步消除组合，产生相比于亲本igg4抗体具有降低的结合hcp(诸如plbl2)的能力的变体igg4抗体。在一个实施方案中，所述修饰包含用scdktht(seqidno:24)或ccve(seqidno:25)替换ygpp(seqidno：23)(kabat残基229至238)。在一个实施方案中，所述修饰包含取代成igg1、igg2和/或igg3抗体种系序列中的等同氨基酸序列。在进一步实施方案中，所述igg1、igg2和/或igg3抗体种系序列是人类的。igg抗体种系序列是本领域众所周知的。例如，在位置203和256(包括203和256)之间的igg1种系序列显示于图8中且显示为seqidno：8。在位置203和256(包括203和256)之间的igg2种系序列显示于图8中且显示为seqidno：9。在一个实施方案中，igg4铰链区的修饰包含用来自替代同种型的人类抗体的种系序列的相应位置处的氨基酸残基取代以下关键氨基酸残基中的一个或多个：在位置203处的赖氨酸(k203)、在位置222处的精氨酸(r222)、在位置226处的谷氨酸(e226)、在位置227处的丝氨酸(s227)、在位置229处的酪氨酸(y229)、在位置230处的甘氨酸(g230)、在位置237处的脯氨酸(p237)和在位置238处的脯氨酸(p238)。替代同种型可以是igg1、igg2或igg3。在其中实施多于一个取代的此类实施方案中，所述取代不一定需要基于仅一种替代igg同种型进行选择，但可以相反是来自多于一种替代人类抗体同种型的残基的组合。因此可预测地，此实施方案的变体igg4可以在这些关键位置中由来自igg1种系序列和igg2种系序列，或igg1种系序列和igg3种系序列，或igg2种系序列和igg3种系序列，或igg1、igg2和igg3种系序列的氨基酸残基组成。在其中替代同种型的种系序列在对应于igg4种系序列中的上述关键残基的位置处不含氨基酸的实施方案中，则此实施方案的变体igg4的所述位置的一个或多个氨基酸残基已从蛋白序列消除。在一个实施方案中，所述修饰包含以下的任一个或组合：(i)一个或多个氨基酸的取代，包括：k203取代成r、e或q；r222取代成t、k或q；e226取代成l或i；s227取代成r、p、a、n或t；y229取代成s、c、f、w或h；g230取代成c、a、n或s；p237取代成h、e、d或v；和/或p238取代成t、k或e；和/或(ii)用epkscdktht(seqidno:27)或erkygpp(seqidno:28)或erkccve(seqidno:29)或elktplgdttht(seqidno:30)替换eskygpp(seqidno：26)(kabat残基226至238)；和/或(iii)用scdktht(seqidno:24)或ccve(seqidno:25)替换ygpp(seqidno：23)(kabat残基229至238)。这些修饰概述于表1中。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的种系序列中的位置203处的赖氨酸被谷氨酰胺(k203q)取代。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的种系序列中的位置222处的精氨酸被选自以下的残基取代：赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在进一步实施方案中，所述变体igg4分子的种系序列中的位置222处的精氨酸被选自以下的残基取代：赖氨酸和苏氨酸。在又进一步实施方案中，所述变体igg4分子的种系序列中的位置222处的精氨酸被苏氨酸(r222t)取代。在又进一步实施方案中，所述变体igg4分子的种系序列中的位置222处的精氨酸被赖氨酸(r222k)取代。如本文描述的实施例中所示，在此位置处的修饰显示plbl2结合的最大降低。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的种系序列中的位置226处的谷氨酸被选自以下的残基取代：异亮氨酸和亮氨酸。例如，所述取代是e226l。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的位置227处的丝氨酸被选自以下的残基取代：脯氨酸和精氨酸。例如，所述取代是s227p。在一个实施方案中，所述变体igg4分子不含有在种系人类igg4序列中的位置229处的酪氨酸。在一个实施方案中，所述变体igg4分子不含有在种系人类igg4序列中的位置230处的甘氨酸。在一个实施方案中，所述变体igg4分子不含有在种系人类igg4序列中的位置237处的脯氨酸。在一个实施方案中，所述变体igg4分子不含有在种系人类igg4序列中的位置238处的脯氨酸。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的位置229处的酪氨酸被选自以下的残基取代：赖氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、半胱氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的位置230处的甘氨酸被选自以下的残基取代：赖氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、半胱氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的位置237处的脯氨酸被选自以下的残基取代：赖氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、半胱氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的位置238处的脯氨酸被选自以下的残基取代：赖氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、半胱氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。在一个实施方案中，所述变体igg4分子不含有在位置229处的酪氨酸、在位置230处的甘氨酸、在位置237处的脯氨酸和在位置238处的脯氨酸，而相反含有以下肽序列：scdktht(seqidno:24)。在替代实施方案中，所述变体igg4分子不含有在位置229处的酪氨酸、在位置230处的甘氨酸、在位置237处的脯氨酸和在位置238处的脯氨酸，而相反含有以下肽序列：ccve(seqidno:25)。例如，所述变体igg4包含kabat229-238ygpp(seqidno：23)的缺失和ccve(seqidno：25)的插入。例如，所述变体igg4包含用ccve(seqidno：25)替换kabat229-238ygpp(seqidno：23)。本文描述的实例，在这些位置处的修饰显示plbl2结合的最大降低。在一个实施方案中，所述变体igg4分子的位置247处的苯丙氨酸被亮氨酸取代。在一个实施方案中，所述修饰包含用paaas(seqidno:32)或paaap(seqidno:33)替换eflggp(seqidno:31)(kabat残基246至251)。在特定kabat残基处的可能氨基酸修饰(例如，取代和/或插入和/或缺失)的实例(其概述于表1中)，可以对igg4抗体实施以产生具有降低的结合hcp(诸如plbl2)的能力的igg4抗体。可以在氨基酸的任何一个或多个(即，组合)处实施这些修饰。表1：igg4重链内的氨基酸修饰的实例kabat重链位置种系igg4氨基酸降低hcp结合的修饰197s取代成n198l取代成f203k取代成q、e或r207t取代成i211d取代成n222r取代成k、t或q226e取代成i或l227s取代成r、p、a、n或t229y取代成s、c、f、w或h230g取代成c、a、n或s237p取代成h、e、d或v238p取代成t、k或e229,230,237&238ygpp(seqidno:23)用scdktht(seqidno:24)或ccve(seqidno:25)替换226-230,237&238eskygpp(seqidno:26)用epkscdktht、erkygpp、erkccve或elktplgdttht(分别为seqidno:27、28、29和30)替换246e取代成p247f取代成l246-251eflggp(seqidno:31)用paaas(seqidno:32)或paaap(seqidno:33)替换248e取代成l或a251p取代成s在一个实施方案中，所述变体igg4抗体是人类或人源化的。在另一个实施方案中，取代成igg1、igg2和/或igg3抗体种系序列中的等同氨基酸序列涉及人类抗体种系序列。在一个实施方案中，对变体igg4分子的两个重链实施所述修饰。在替代实施方案中，仅对变体igg4分子的重链之一实施所述修饰。在一个实施方案中，相比于未修饰的igg4抗体，没有在重链恒定区中实施进一步修饰。在一个实施方案中，没有对igg4效应子功能所需的氨基酸残基实施修饰。例如，野生型igg4f247(kabat)(euf234)对于减弱的adcc和cdc活性是重要的。此外，修饰的e248(kabat)可以抑制效应子功能，具体地降低与fcγri的结合。在一个实施方案中，所述变体igg4抗体包含s241取代成p和/或l248取代成e的进一步取代。在一个实施方案中，所述变体igg4抗体包含s241取代成p的进一步取代。该修饰有助于改善igg4分子的稳定性。在一个实施方案中，所述变体igg4抗体包含用序列paaap(seqidno：33)的进一步取代eflggp序列(seqidno：31)(kabat残基246-251)。根据本发明的进一步方面，提供了编码如本文定义的变体igg4抗体的核酸构建体。可以将所述核酸构建体转染至宿主细胞系中。因此，根据本发明的进一步方面，提供了编码如本文定义的变体igg4抗体的细胞系。进一步序列修饰根据本发明的进一步方面，提供了在重链恒定区中的kabat残基203和256之间的区域中的氨基酸的任一个或组合处已经被修饰的变体igg抗体，其中所述变体igg抗体相比于未修饰的igg抗体具有与宿主细胞蛋白(hcp)的降低的结合水平。例如，所述变体igg抗体已经在重链恒定区中的kabat残基203和256之间的1至25个氨基酸处被修饰。例如，所述变体igg抗体已经在重链恒定区中的kabat残基203和256之间的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十一、二十二或二十三个氨基酸处被修饰。例如，所述变体igg抗体已经在重链恒定区中的kabat位置197、198、203、207、211、222、226、227、229、230、232、233、234、235、236、237、238、246、247、248、249、250或251中的任一个或组合处被修饰。例如，所述变体igg抗体已经在重链恒定区中的kabat位置203、222、226、227、229、230、232、233、234、235、236、237、238、247、248或251中的任一个或组合处被修饰。宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白或“hcp”是指在细胞培养或发酵期间由宿主细胞产生的、与目标蛋白(即，重组蛋白/变体igg4)无关的蛋白，包括细胞内蛋白和/或分泌蛋白。宿主细胞蛋白的一个实例是蛋白酶，如果在纯化期间和之后仍然存在，其可以引起对目标蛋白的损伤。例如，如果蛋白酶保留在包含目标蛋白的样品中，其可以产生最初不存在的产物相关的物质或杂质。蛋白酶的存在可以引起在纯化期间和/或在最终制剂中目标蛋白随时间的分解。在一个实施方案中，所述宿主细胞蛋白由哺乳动物细胞或细菌细胞产生/衍生。在进一步实施方案中，所述哺乳动物细胞选自人类或啮齿动物(诸如仓鼠或小鼠)细胞。在某些实施方案中，用于表达所述抗体的宿主细胞选自cho细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、cos细胞、k562细胞、bhk细胞、per.c6细胞和hek细胞(即，所述宿主细胞蛋白衍生自这些宿主细胞)。或者，所述宿主细胞可以是选自以下的细菌细胞：大肠杆菌(例如，w3110、bl21)、枯草芽孢杆菌和/或其他合适的细菌；真核细胞，诸如真菌或酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、曲霉菌属种(aspergillussp.)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、粗糙链孢霉(neurosporacrassa))。例如，所述宿主细胞是cho细胞。或者，所述宿主细胞是hek细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞蛋白是推定的磷脂酶b样2(plbl2)。plbl2也被称为含磷脂酶b结构域蛋白2(plbd2)。降低igg4分子与hcp(诸如plbl2)的结合导致这些工艺相关的杂质与产物igg4的共纯化水平的同时降低。这进而消除对特定纯化策略(诸如在填充床柱色谱期间的严格洗涤条件)以从药物产品中清除hcp的需求。这样做增加制造工艺的效率，降低相关成本，并减轻使用可能要定制的免疫测定进行过度产品测试的需求。最终，这些修饰用于潜在地降低hcp(诸如plbl2)存在于最终药物产品中的风险，并作为结果，使它们在患者中引起免疫原性响应的可能性最小化。可以基于实施例中提供的方法，量化这些修饰的igg4分子结合hcp(诸如plbl2)的能力的降低。存在几种方法可以测量降低的宿主细胞蛋白结合水平。例如，一经纯化，例如通过亲和色谱纯化，可以通过简单地测量具有抗体的溶液中存在的宿主细胞蛋白的量，来评估降低的结合水平(与未修饰的igg4相比减少的量表明降低的宿主细胞蛋白结合)。在一个实施方案中，所述igg4抗体相比于未修饰的igg4抗体具有降低的与宿主细胞蛋白的结合亲和力和/或活性。在一个实施方案中，所述变体igg4抗体相比于未修饰的igg4抗体具有至少10%的结合活性降低，诸如至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%的结合活性降低。在一个实施方案中，所述变体igg4抗体相比于未修饰的igg4抗体具有至少10倍的结合亲和力降低，诸如至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%的结合亲和力降低。包含抗体变体的组合物根据本发明的进一步方面，提供了包含如本文定义的变体igg4抗体的组合物。本发明的组合物可以根据常规技术用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂配制。所述药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂应当适用于本发明的所选化合物和所选施用模式。在一个实施方案中，所述变体igg4在至少10mg/ml的浓度，例如至少20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml或95mg/ml或100mg/ml。本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得如下量的活性成分，其对于具体患者、组合物和施用模式实现期望的治疗响应是有效的，且对患者没有毒性。所选剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括本发明采用的具体组合物的活性、施用途径、施用时间、治疗的持续时间、与采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史、以及医疗领域众所周知的类似因素。具有本领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定和开具所需药物组合物的有效量。在一个实施方案中，所述组合物中推定的磷脂酶b样2(plbl2)的浓度为小于500ppm，例如，小于400ppm、300ppm、200ppm、100ppm、90ppm、80ppm、70ppm、60ppm、50ppm、40ppm、30ppm、20ppm或10ppm。在一个实施方案中，所述组合物中推定的磷脂酶b样2(plbl2)的浓度为小于约200ngplbl2/mg产物(即，ng/mg)；小于约150ng/mg；小于约100ng/mg；或小于约50ng/mg。在一个实施方案中，所述组合物额外包含缓冲剂和/或脂肪酸酯。在进一步实施方案中，所述脂肪酸酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。如上所提及，plbl2已被鉴定为降解最终制剂中的产物蛋白的稳定化所必需的制剂赋形剂(诸如聚山梨醇酯)的潜在原因。因此，减少plbl2的结合将进而使最终配制药物中plbl2的水平最小化，由此使产品的保质期最大化。因此，根据本发明的进一步方面，提供了具有延长/改善的保质期的组合物，其包含如本文定义的变体igg4抗体。此外，根据本发明的进一步方面，提供了提供延长抗体组合物的保质期的方法，其包括通过修饰在重链恒定区中的kabat残基203和256之间的区域中的氨基酸的任一个或组合处的抗体序列而产生与plbl2的结合降低的igg4抗体。抗体变体的用途根据本发明的进一步方面，提供了如本文所定义的变体igg4抗体，其用于疗法中。本领域技术人员将理解，本发明可应用于针对不同靶标的各种igg4抗体，因此所述igg4变体可用以治疗一系列的疾病。本文描述的抗体也可用于治疗方法中。治疗可以是治疗、预防或防止性的。治疗涵盖疾病的至少一个方面或症状的减轻、减少或预防，且涵盖本文描述的疾病的预防或治愈。本文描述的抗体可以有效量用于治疗、预防或防止性治疗。本文描述的抗体的治疗有效量是有效减轻或减少疾病的一种或多种症状或有效预防或治愈所述疾病的量。制备抗体变体的方法本文提供了抗体变体和用于产生所述抗体变体的方法，所述抗体变体已经由氨基酸序列变化进行修饰以降低工艺杂质结合的水平。这些修饰具有减少存在于所得医学产品中的工艺杂质的量的有益作用。因此，根据本发明的进一步方面，提供了修饰igg抗体以降低对工艺杂质的结合的方法，其包括以下步骤：a)鉴定参与工艺杂质的结合的至少一个氨基酸；和b)通过用不同氨基酸取代鉴定为参与与工艺杂质的结合的氨基酸来产生所述igg抗体的变体。根据本发明的进一步方面，提供了用于产生相比于未修饰的igg抗体，与工艺杂质的结合降低的igg抗体变体的方法，其包括以下步骤：a)鉴定参与工艺杂质的结合的至少一个氨基酸；和b)通过用不同氨基酸取代鉴定为参与与工艺杂质的结合的氨基酸来产生所述igg抗体的变体。在一个实施方案中，通过使用可用于研究蛋白-蛋白相互作用的方法或方法的组合，鉴定参与工艺杂质的结合的氨基酸。在一个实施方案中，用于研究蛋白-蛋白相互作用的方法选自：氢氘交换质谱(hdx-ms)、结晶学、酵母2-杂交筛选、在计算机芯片上3d结构建模或其任何组合。此类实施方案可能需要组合许多这些方法的输出，且通过应用适当的科学推理，可推导出参与工艺杂质的结合的一个或多个氨基酸的身份。在一个实施方案中，鉴定为参与工艺杂质的结合的氨基酸存在于恒定区中。在进一步实施方案中，鉴定为参与工艺杂质的结合的氨基酸存在于重链恒定区中。在通过蛋白-蛋白相互作用方法(例如，hdx-ms)确定的区域中，与工艺杂质相互作用的igg同种型针对不与工艺杂质相互作用的同种型的序列比对，允许鉴定参与工艺杂质的结合的氨基酸。从不与工艺杂质结合的igg同种型至与工艺杂质结合的igg的保守的种系至种系取代则将允许产生不与工艺杂质结合的变体。因此，在一个实施方案中，用来自替代igg抗体种系序列的等同氨基酸取代鉴定为参与与工艺杂质的结合的氨基酸。在一个实施方案中，鉴定为参与与工艺杂质的结合的氨基酸通过抗体序列的保守区中保守、相同物种、免疫球蛋白种系-至-种系氨基酸变化而进行修饰。因此，本文提供了产生与宿主细胞蛋白(hcp)的结合降低的igg4抗体的方法，其包括修饰重链恒定区中在kabat残基203和256之间的区域中的氨基酸的任一个或组合处的抗体序列。在一个实例中，所述宿主细胞蛋白是推定的磷脂酶b样2(plbl2)。所述方法可以额外包括使用亲和色谱技术纯化igg4抗体。所述方法可以额外包括使用至少一种其他正交色谱技术进一步纯化igg4抗体。在一个实例中，所述正交色谱技术是离子交换色谱。因此，本发明提供了抗体变体，其通过定点诱变产生，而不是通过更经典的色谱方法纯化，以降低相关工艺杂质的水平。根据本发明的进一步方面，提供了通过本文定义的方法获得的igg抗体。在一个实施方案中，所述igg抗体是igg4抗体。因此，在该实施方案中，用来自igg1、igg2和/或igg3抗体种系序列的等同氨基酸取代鉴定为参与与工艺杂质的结合的氨基酸。制备抗体igg4变体的方法根据本发明的进一步方面，提供了产生与宿主细胞蛋白(hcp)的结合降低的igg4抗体的方法，其包括修饰重链恒定区中在kabat残基203和256之间的区域中的氨基酸的任一个或组合处的抗体序列。产生抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，所述方法可以包括制备用编码所述igg4抗体的重组多核苷酸转化或转染的重组宿主细胞的悬浮培养物；和在允许所述igg4抗体的表达的条件下培养所述宿主细胞培养物。所述方法可以额外包括使用亲和色谱技术纯化igg4抗体。所述方法可以额外包括使用至少一种其他正交色谱技术进一步纯化igg4抗体。在一个实例中，所述正交色谱技术是离子交换色谱。在一个实施方案中，所述方法额外包括(例如在培养后)纯化igg4抗体，例如，使用亲和色谱技术纯化。在进一步实施方案中，所述亲和色谱技术是超抗原亲和色谱。在一个实施方案中，所述超抗原选自蛋白a、蛋白g和蛋白l。因此，在进一步实施方案中，所述超抗原亲和色谱选自蛋白a亲和色谱、蛋白g亲和色谱和蛋白l亲和色谱。在一个实施方案中，所述方法额外包括使用至少一种其他色谱技术(诸如离子交换色谱)进一步纯化igg4抗体。在一个实施方案中，所述一个或多个进一步色谱步骤选自：阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和混合模式色谱，特别是阴离子交换色谱。在一个实施方案中，至少一种其他色谱技术不包括疏水相互作用色谱。所述方法还可以包括过滤步骤，诸如深度过滤(用于移除细胞和细胞碎片)和纳米过滤(用于移除病毒)。还可以采用纯化步骤以包括任何病毒灭活步骤，以用于使用哺乳动物表达系统产生的材料。根据本发明的进一步方面，提供了产生如本文定义的变体igg4抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述抗体的核酸构建体和任选地纯化所述抗体。根据本发明的进一步方面，提供了通过本文定义的方法获得的igg4抗体。定义除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术、蛋白纯化和生物化学中)通常理解的相同含义。标准技术用于分子、遗传和生物化学方法和化学方法。如本文所用，术语“抗体”是指所有免疫球蛋白或igg(诸如igg1、igg2、igg3或igg4)、igm、iga、igd或ige抗体，无论其衍生自天然产生抗体的任何物种，还是通过重组dna技术产生；无论是从血清、b细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是从细菌分离。抗体可以是单克隆的，重组的，多克隆的，嵌合的(例如，来自不同来源(例如，人/小鼠嵌合抗体)或不同抗体类型(例如igg2/4抗体))，人，人源化，多特异性(包括双特异性)或异源缀合物抗体。该术语还包括单一可变结构域(例如，vh、vhh、vl)、结构域抗体(dab®)、抗原结合片段、免疫有效片段、fab、f(ab')2、fv、二硫化物连接的fv、单链fv、闭合构象多特异性抗体、二硫化物连接的scfv、双抗体、tandabs™等。在一个实施方案中，所述抗体是igg4。在另一个实施方案中，所述抗体是重组igg4。在另一个实施方案中，所述抗体是变体igg4。在另一个实施方案中，所述抗体是重组变体igg4。如本文所用，术语“cdr”被定义为抗体的互补性决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的30可变部分中存在三个重链cdr和三个轻链cdr(或cdr区)。因此，如本文所用的“cdr”是指所有三个重链cdr或所有三个轻链cdr(或如果适当，所有重链cdr和所有轻链cdr两者)。抗体的结构和蛋白折叠可能意味着其他残基被视作抗原结合区的部分，且被技术人员理解为这样。如本文所用，术语“结构域”是指一种折叠的蛋白结构，其具有独立于该蛋白的其他部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的离散功能特性，且在许多情况下，可以将结构域添加、移除或转移至其他蛋白，而不损失所述蛋白的剩余部分和/或所述结构域的功能。所述抗体是蛋白产物，即目标蛋白。例如，蛋白产物是变体igg4。例如，蛋白产物是重组igg4。例如，蛋白产物是重组变体igg4。如本文所用，术语“铰链区”和/或“铰链序列”是指通常称为抗体的铰链区的事物，其为覆盖分子蛋白序列的位置226至243(包括端值)(其中氨基酸编号根据kabat编号)或根据eu编号的位置216-230(包括端值)中的氨基酸的igg分子的结构域。这些区域也可称为“遗传铰链”。除此之外，如本文所用的术语“铰链区”和“铰链序列”还可以用于包括分子蛋白序列的位置203至223(包括端值)(其中氨基酸编号根据kabat编号)或根据eu编号的位置196至215(包括端值)中的氨基酸。此外，如本文所用的术语“铰链区”和“铰链序列”可以用于包括分子蛋白序列的位置244至256(包括端值)(其中氨基酸编号根据kabat编号)或根据eu编号的位置231至243(包括端值)中的氨基酸。或者，基于始于h/l链二硫化物之后的残基且终止于fc结构域之前的残基的铰链，“结构铰链”已被定义为kabat位置234-250(或eu位置221-237)。铰链可以在结构上分成上铰链(kabat位置234-238；或eu位置221-225)，其为fab结构域的末端至由一个螺旋转角形成的第一个重链间的二硫化物；和从最后一个二硫化物至fc结构域的起点的下铰链(kabat位置243-250或eu位置230-237)。中间或核心铰链是人igg1中的“cppc”(seqidno:20)基序(kabat位置239-242或eu位置226-229)，其包含通过二硫桥连接的两个平行的多脯氨酸双螺旋。应当注意的是，本领域中的大多数编号基于人igg1，并且在特定的铰链序列中将由于插入缺失而不同。例如，igg4的核心铰链旁边的“ygpp”(seqidno:23)基序等同于igg1中的“scdktht”(seqidno:24)基序，这是igg4的“ygpp”(seqidno:23)分别是位置229、230、237和238，而不是简单地位置229至232的原因。如本文所用，在描述抗体分子的上下文中，术语“铰链修饰的”是指任何抗体，其中蛋白序列的位置203至256之间(包括端值)的氨基酸残基已经从未修饰和/或亲本抗体的序列的氨基酸残基改变。这些改变可以涉及用一个或多个残基取代替代氨基酸，或用完整肽序列取代替代序列。改变还可以涉及从蛋白消除氨基酸或肽序列。如本文所用，术语“未修饰的”是指在降低与工艺杂质的结合的修饰之前的抗体。这可以包括呈其天然、种系形式的抗体。其还可以包括已经被修饰以改善除了减少宿主细胞蛋白结合以外的特性、诸如在许多igg4抗体中用于改善稳定性的取代s241p(即产生在kabat残基239至242处的序列cppc[seqidno:20])的抗体。因此，在一个实施方案中，未修饰的抗体包含取代s241p。其还可以包括已经用取代l248e(其在许多igg4抗体中用于改善效应子功能)修饰的抗体。因此，在一个实施方案中，未修饰的抗体包含取代l248e。术语“修饰的”在本文中用于描述重链恒定区的kabat残基203和256之间的区域中的一个氨基酸或氨基酸的组合的取代、和/或缺失和/或插入中的任一个或组合。例如，所述修饰可以包含一个或多个氨基酸取代，和/或一个或多个氨基酸插入，和/或一个或多个氨基酸缺失。术语“缺失”、“移除”、“替换”、“消除”在本文中可互换使用。例如，所述变体igg抗体已经在kabat残基203和256之间的重链恒定区中的1至25个氨基酸处被修饰。例如，所述变体igg抗体已经在kabat残基203和256之间的重链恒定区中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十一、二十二或二十三个氨基酸处被修饰。例如，所述变体igg抗体已经在重链恒定区中的kabat位置197、198、203、207、211、222、226、227、229、230、232、233、234、235、236、237、238、246、247、248、249、250或251中的任一个或组合处被修饰。例如，所述变体igg抗体已经在重链恒定区中的kabat位置203、222、226、227、229、230、232、233、234、235、236、237、238、247、248或251中的任一个或组合处被修饰。如本文所用，术语“宿主细胞”是指原核和真核的任何生物体，其可以进行基因工程改造以表达非工程改造的生物体不表达的多肽。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自cho细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、cos细胞、k562细胞、bhk细胞、perc6细胞和hek细胞。所述宿主细胞可以是选自以下的细菌细胞：大肠杆菌(例如w3110、bl21)，枯草芽孢杆菌和/或其他合适的真核细胞，诸如真菌或酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、曲霉菌属种(aspergillussp.)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、粗糙链孢霉(neurosporacrassa))。如本文所用，术语“宿主细胞蛋白”和缩写“hcp”可互换使用，并且是指除了宿主细胞已经被工程改造以表达的免疫球蛋白(即目标蛋白)以外，由宿主细胞表达的任何多肽。如本文所用，术语“工艺杂质”可以根据国际人用药物注册技术要求协调委员会(ich)指南(例如ichq6b)来定义，并且用于指由于其中产生目标蛋白的工艺而存在的杂质。因此，该定义涵盖衍生自制造工艺(即细胞底物(例如，宿主细胞蛋白、宿主细胞dna/rna)、细胞培养(例如，诱导物、抗生素或培养基组分)或其下游加工)的杂质。术语“工艺杂质”不包括产物相关杂质(例如，抗体聚集体和/或片段)。本文中鉴定的所有“氨基酸”残基可以呈天然的l-构型。与标准多肽命名法一致，氨基酸残基的缩写如在表2中所示。表2：氨基酸缩写单字母缩写三字母缩写氨基酸klys赖氨酸nasn天冬酰胺tthr苏氨酸rarg精氨酸mmet甲硫氨酸iile异亮氨酸qgln谷氨酰胺hhis组氨酸ppro脯氨酸eglu谷氨酸dasp天冬氨酸aala丙氨酸ggly甘氨酸vval缬氨酸ytyr酪氨酸sser丝氨酸wtrp色氨酸ccys半胱氨酸lleu亮氨酸fphe苯丙氨酸所有氨基酸序列在本文用结构式详述，所述式从左至右的方向为从氨基末端至羧基末端的常规方向。如本文所用，如在上下文中用于描述抗体的氨基酸序列的术语“种系”描述了通过例如免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因文库，从使用人免疫球蛋白序列的系统获得的任何抗体的氨基酸序列，并且其中所选人抗体的氨基酸序列与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90%同一性。如本文所用，当提及“保守的种系至种系氨基酸变化”时，这被定义为抗体的保守变化，其中抗体的初始种系序列的至少一个氨基酸被修饰为衍生自相同物种的另一种抗体种系序列的比对的、等同定位的氨基酸的不同的氨基酸序列。如本文所用，在描述抗体的上下文中，术语“亲本”或“亲本的”是指由天然存在的种系人免疫球蛋白的氨基酸序列构成的任何免疫球蛋白。在描述igg4亚类抗体的上下文中，术语“亲本”或“亲本的”是指任何免疫球蛋白，其含有人igg4分子的重链和轻链两者中保守恒定区的天然存在的人种系氨基酸序列，连同包括互补决定区的可变结构域中的任何氨基酸序列，并且其中铰链区含有氨基酸序列；半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸或半胱氨酸-脯氨酸-丝氨酸-半胱氨酸。如本文所用，术语“修饰的igg4”或“变体igg4”或“重组igg4”可互换使用，并且是指包含与“亲本”igg4抗体相同的氨基酸序列、但在一个或多个氨基酸中不同的任何igg4抗体。在某些实施方案中，这些差异可以构成表1中详述的或如本文所述的修饰中的至少一种。如本文所用，在抗体与宿主细胞蛋白(hcp)(诸如plbl2)结合的上下文下，术语“结合”是指抗体和所述宿主细胞蛋白(hcp)之间的特异性和/或非特异性、可逆性和不可逆性相互作用。“结合的水平”、“结合的能力”、“相互作用的倾向”、“相互作用”在本文中可互换使用。抗体和hcp之间的此类结合相互作用可以由本领域技术人员定量测定。例如，可以如实施例2中那样实施抗plbl2western印迹。此类结合相互作用还可以通过例如使用biacore™3000或biacore™t200仪器中的表面等离振子共振(spr)技术，使用抗体作为配体且宿主细胞蛋白作为分析物进行定量测定。如本文所用，术语“亲和力”是指一个分子(例如，本发明的抗体)与hcp(诸如plbl2)的结合的强度。抗体与其靶标或污染物(诸如hcp)的结合亲和力可以通过平衡方法测定。定量结合亲和力的方法包括生物层干涉测定法(bli)，例如与octet®red384仪器组合(参见实施例6)。其他方法包括酶联免疫吸附测定(elisa)或放射免疫测定(ria))或动力学(例如，biacoretm分析)。如本文所用，在抗体与宿主细胞蛋白(诸如plbl2)结合的上下文中，术语“活性”是指与抗体结合的hcp的量。例如，与plbl2结合的抗体数量。定量结合活性的方法包括：确定有多少hcp与抗体结合(例如plbl2ng/mg)的酶联免疫吸附测定(elisa)，参见实施例3；确定有多少hcp结合至抗体(例如plbl2结合(ru))的biacore™3000或biacore™t200仪器中的表面等离子共振(spr)技术，参见实施例4。如本文所用，当用于描述一种抗体与宿主细胞蛋白的结合相比于另一种抗体与相同宿主细胞蛋白的结合的变化的上下文中时，术语“降低的”是指两种抗体与所述宿主细胞蛋白的结合的相对差异。亲和力或活性的差异可以通过例如使用biacore™3000或biacore™t200仪器中的表面等离振子共振(spr)技术，使用抗体作为配体且宿主细胞蛋白作为分析物来定量确定，在这种情况下，如果存在大于10%的结合活性降低和/或大于10倍的结合亲和力降低，则将一种抗体定义为相比于另一种抗体具有“降低的”结合水平。因此，在一个实施方案中，相比于未修饰的抗体，所述变体抗体的结合活性降低至少10%和/或结合亲和力降低至少10倍。如本文所用，在描述组分(例如plbl2)的浓度或量的上下文中，术语“百万分率”或“ppm”是指相对于产物(诸如igg4抗体)的浓度的所述组分的浓度。“ppm”值基本上是组分和抗体产物之间的摩尔比，并且可以例如通过将组分的浓度(以ng/ml测量)除以抗体的浓度(以mg/ml测量)来计算。然后，该计算的结果是每百万份抗体产物中所述组分的份数。或者，检测到的hcp可以通过“ppb”(“十亿分之一”)(其等同于pg/mg)来测量。如本文所用，“亲和色谱”是一种色谱方法，其利用生物分子之间的特异性、可逆相互作用而不是生物分子的一般特性，诸如等电点、疏水性或大小，以实现色谱分离。“超抗原”是指这样的通用配体：其与免疫球蛋白超家族的成员在不同于这些蛋白的靶配体结合位点的位点处相互作用。葡萄球菌肠毒素是与t-细胞受体相互作用的超抗原的实例。结合抗体的超抗原包括、但不限于蛋白g，其结合igg恒定区；蛋白a，其结合igg恒定区和vh结构域；和蛋白l，其结合vl结构域。因此，在一个实施方案中，所述超抗原选自蛋白a、蛋白g和蛋白l。当在本文中使用时，术语“蛋白a”涵盖从其天然来源(例如，金黄色葡萄球菌的细胞壁)回收的蛋白a、合成地(例如通过肽合成或通过重组技术)生产的蛋白a、及其保留结合具有ch2/ch3区域的蛋白的能力的变体。“蛋白a亲和色谱”或“蛋白a色谱”是指利用蛋白a的igg结合结构域对免疫球蛋白分子的fc部分的亲和力的特异性亲和色谱方法。该fc部分包含人或动物免疫球蛋白恒定结构域ch2和ch3或与这些基本上类似的免疫球蛋白结构域。在实践中，蛋白a色谱涉及使用固定化至固体支持物的蛋白a。蛋白g和蛋白l也可以用于亲和色谱。固体支持物是蛋白a附着于其上的非水性基质(例如，柱、树脂、基质、珠粒、凝胶等)。此类支持物包括琼脂糖、琼脂糖凝胶、玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、火棉胶-炭、砂、聚甲基丙烯酸酯、交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)和具有葡聚糖表面延伸剂(extender)的琼脂糖和任意其他合适材料。此类材料是本领域众所周知的。可以使用任何合适的方法将超抗原固定至固体支持物。将蛋白固定至合适的固体支持物的方法是本领域众所周知的。此类固体支持物(具有和没有固定化的蛋白a或蛋白l)可容易地得自许多商业来源，包括诸如vectorlaboratory(burlingame,calif.)、santacruzbiotechnology(santacruz,calif.)、biorad(hercules,calif.)、amershambiosciences(gehealthcare的一部分,uppsala,sweden)和millipore(billerica,mass.)。术语“缓冲剂”是指稳定溶液的ph的缓冲溶液或缓冲试剂。缓冲剂通常包含弱酸及其共轭碱，或弱碱及其共轭酸。在最佳ph或接近最佳ph下缓冲蛋白溶液有助于确保适当的蛋白折叠和功能。术语“脂肪酸酯”意指含有经由酯键与头部基团连接的脂肪酸链的任何有机化合物。当羟基基团(例如，醇或羧酸)被烷氧基基团替换时，形成酯键。脂肪酸酯的实例通常包括磷脂、脂质(例如，头部基团是甘油，包括甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)、和表面活性剂和乳化剂，包括例如聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80，其为非离子去垢剂。表面活性剂和乳化剂可用作助溶剂和稳定剂，并且可以添加至蛋白制剂中以增强蛋白针对机械应力(诸如空气/液体界面和固/液界面剪切)的稳定性。现将参考以下非限制性实施例描述本发明。实施例实施例1-最终批量mab的hcpelisa稀释线性度先前研究已显示，宿主细胞蛋白(hcp)磷脂酶b样2(plbl2)可存在于已使用哺乳动物细胞宿主产生的抗体样品中。此外，当通过elisa定量样品中总hcp水平时，plbl2的存在可引起观察到稀释非线性度。在鉴定最终原料药中可能含有plbl2的mab产物的尝试中，进行hcpelisa以评估所述样品的稀释线性度。内部开发专用elisa以定量cho衍生的产物样品中免疫原性hcp的总量。此hcpelisa使用定制山羊抗-chohcp多克隆抗体和内部产生的hcp参考标准，在gsk用于跨cho衍生的产品的多产品用途，且已用作用于监测跨多种生物医药mab产品的纯化工艺样品的hcp的清除的平台方法。此测定具有2.0ng/ml的灵敏度。针对处理中和最终原料药样品的中间精度范围为5.7-14.9%cv而重复性范围为3.5-8.8%cv。通过elisa分析各样品的最少四份稀释液。对于各稀释液，通过将测量的hcp浓度乘以稀释倍数且然后除以产物浓度来计算经调整的hcp值。将各样品稀释液的调整的hcp值以双对数标度绘制为稀释倍数的函数。各样品的稀释斜率使用下列双对数方程计算：log(经调整的hcp)=a+b*log(稀释倍数)其中a是y-截距且b是斜率。随稀释度增加而增加的经调整的hcp值指示稀释非线性度，且可能表明plbl2的存在。分析不同亚型的人源化igg产物，包括igg1、igg2、igg4和igg2/igg4嵌合体。该igg2/igg4嵌合体是具有人类igg4种系序列的抗体，但铰链区与人类igg2的铰链区交换。结果证实稀释非线性度仅用mab7(igg4分子)观察到(图1)，如通过随稀释倍数增加而增加的经调整的hcp值所测定的。下表3含有在hcpelisa中针对这些mab产物各自获得的稀释斜率值。表3：在hcpelisa中针对不同的mab产物获得的稀释斜率值产物同种型斜率mab1igg10.013mab3igg20.002mab4igg2/4-0.014mab7igg40.416这些结果表明mab7最终原料药中存在hcp，其过量且饱含用于elisa中的抗-chohcp检测抗体。为了证实该hcp是否是plbl2，需要进一步实验。实施例2-不同mab的抗-plbl2western印迹实施例1证明mab7在hcpelisa中表现出稀释非线性度。为了确定plbl2是否可能造成稀释非线性度，对先前通过elisa(实施例1)分析的相同人源化igg产物进行抗-plbl2western印迹。含有100µg的mab产物的样品用2x样品缓冲剂(novex)1:1稀释，且然后上样于4-20%梯度凝胶(novex)中。sds-page在每个凝胶24ma的恒定电流下进行30分钟，随后在每个凝胶36ma下进行50分钟。电泳后，固定所述凝胶并用sypro®ruby(thermofisherscientific)染色蛋白。将sypro®ruby染色的凝胶在fla-3000荧光图像分析仪(fujifilmcorp.)上成像。该sypro®ruby图像(图2a)证实各产物等量上样于该凝胶上。western印迹通过使用xcellii™blotmodule(novex)将凝胶转移至pvdf膜(bio-rad)，在25v的恒定电压下运行105分钟进行。转移后，该膜使用用tbst(sigma)1:10稀释的荧光封闭缓冲剂(rocklandimmunochemicals)封闭过夜。封闭后，该膜用tbst洗涤并与1µg/ml的抗-plbd2多克隆抗体(abcam,ab138334)在室温下孵育两小时。孵育后，该膜用tbst洗涤三次，持续10分钟。该膜然后与1µg/ml的小鼠抗-兔cy3缀合物(jacksonimmunoresearch)在室温下孵育一小时。孵育后，该膜用tbst洗涤三次，持续10分钟。洗涤后，使该膜干燥30分钟。使干燥的膜在fla-3000荧光图像分析仪上成像。此western印迹具有20ng的plbl2的检测下限。该western印迹图像(图2b)证实在mab7的最终原料药中检测到plbl2，而在任何一个其他igg产物没有检测到。此结果支持plbl2负责对于mab7所观察到的稀释非线性度(实施例1中描述)的论点，且应当进行进一步分析以定量样品中存在的plbl2的量。实施例3-定量mab样品中的plbl2鉴于在mab7中检测到plbl2，开发elisa以精确定量样品中plbl2的浓度。内部开发此elisa并使用重组仓鼠plbl2作为参考标准，且使用定制内部产生的多克隆抗-plbl2抗体用于检测。此测定具有2.0ng/m的灵敏度。针对样品的中间精度为3.23%cv。使用plbl2elisa以定量针在对先前研究的四种不同mab产物进行的整个纯化过程中取得的样品中的plbl2浓度。所述plbl2浓度在收获后、第一色谱步骤后(步骤1)和最终原料药(最后)测定且可见于下表4中。表4：在mab纯化样品中通过plbl2elisa定量的plbl2浓度表4中发现的结果证实大量plbl2仍留在mab7的最终原料药中而非其他测试的mab产物中。有趣地，对于mab7，收获材料中的plbl2的仅52%在第一色谱纯化步骤期间移除，而在此步骤期间99.92%从mab1移除。鉴于两种产物使用相同树脂用于纯化，可能plbl2与mab分子而非色谱树脂直接相互作用。实施例4-通过spr的plbl2与不同mab的结合基于先前数据，一种可能的解释是plbl2优先结合至mab7而非其他mab产物。如先前所示，mab7是igg4分子，其可能为plbl2提供在其他亚型中不存在的结合位点。为了进一步研究plbl2没有在mab7的纯化期间被移除的原因，进行表面等离振子共振(spr)结合实验。在此实验中，使用biacore™t200仪器(gehealthcare)将抗-人类iggfc抗体(gehealthcare)固定至s系列cm5传感器芯片(gehealthcare)的两个流动室(fc4和fc3)至~7000响应单位(ru)的水平。固定的抗体用于将1xhbs-ep+缓冲剂(gehealthcare)中的mab产物捕获至fc4上至~2500ru的水平，其使用fc3作为在线(inline)参考室用于背景减除。使用hbs-ep+缓冲剂将重组仓鼠plbl2稀释至5µm，并以30µl/分钟注射60秒。使用制造商推荐的方案，在再生表面之前测量plbl2的解离180秒。通过spr使用此方案分析不同亚型的七种不同人源化igg产物(包括igg1、igg2、igg4和igg2/igg4嵌合体)的plbl2结合(参见下表5)。结果证实plbl2结合至测试的所有三种igg4分子，且不结合至其他亚型中的任一种(图3b、图3c)，尽管几乎相等地捕获mab于传感器芯片上(图3a)。与各mab的plbl2结合水平可见于下表5中。表5：通过spr的plbl2与mab产物的结合水平产物同种型plbl2结合(ru)mab1igg17.2mab2igg17.1mab3igg25.0mab4igg2/44.2mab5igg498.4mab6igg4100.1mab7igg4103.6表5中的结果显示plbl2具有增加的结合至igg4亚型的抗体的倾向。此外，由于mab2、3、5和6全部含有相同的可变区，所以结果将指示igg4分子的恒定区负责其增强的结合plbl2能力。显著地，plbl2不结合至mab4，其为含有igg2的种系铰链区的igg2/igg4嵌合体，而该恒定区的剩余部分由igg4的种系铰链区构成。这些结果表明plbl2在mab7的纯化期间由于直接结合至mab产物而未被移除。这些结果不但指出igg4分子的恒定结构域主要负责驱动plbl2的结合，而且还指出此恒定结构域的铰链区可能负责plbl2的结合。为了计算重组plbl2与mab7的结合亲和力，进行第二次spr实验。此实验使用相同的固定化抗-人类iggfc芯片，但仅捕获mab7至~170ru的水平。捕获后，plbl2以30µl/分钟注射120秒，其中单独注射浓度范围为1.25µm至80µm。结合亲和力(kd)使用biacoret200评估软件，使用1:1结合模型在稳定状态下进行测定。结果证实plbl2与mab7的结合随浓度增加而增加(图4a)。使用在稳定状态(plbl2注射开始后~110秒)下的结合响应，计算结合亲和力(图4b)。计算plbl2与mab7的结合的kd为40.0µm。尽管这是相对弱的结合，但该结果有助于hdx-ms实验的设置，以在该实验中用plbl2饱和mab7分子。实施例5-表达系统对plbl2的结合的影响先前实施例已显示相比于其他抗体亚型(例如，igg1和igg2)，igg4亚型的抗体结合plbl2增加的倾向。进行研究以确定用于产生这些抗体的宿主细胞表达系统是否可影响它们结合plbl2的能力。研究使用mab6(igg4)和mab3(igg2)进行，其两者都具有相同的可变结构域，但为不同的igg亚类。这些分子的行为差异可因此直接归因于恒定抗体结构域。简而言之，分别地培养表达igg4mab6的chok1和hek293细胞(分别表示为mab6a和mab6b)，连同表达mab3(igg2)的chok1a细胞的另一分离培养物。在适当的时间点获取这些培养物，然后通过标准mab澄清和下游纯化工艺。然后使用biacore™t200使用表面等离振子共振(spr)分析和比较这些抗体各自的纯化样品的结合plbl2的能力。样品(表6)在hbs-ep缓冲剂中稀释至20µg/ml且持续60秒以10µl/min注射在预固定蛋白a芯片(gehealthcare)的主动流动室上。然后将在hbs-ep中稀释至100µg/ml的plbl2持续120秒以5µl/min注射在主动流动室和参考流动室两者上。两种流动室使用10mm甘氨酸ph1.5以30µl/min再生10秒且然后使用hbs-ep以30µl/min再生30秒。表6：分子形式和用于产生抗体的宿主细胞表达系统分子编号分子形式和宿主细胞表达系统mab3人类igg2(chok1)mab6a人类igg4(chok1)mab6b人类igg4(hek293)结果(图5)证实两种igg4分子尽管在不同细胞系中产生但相当地与plbl2相互作用。同时，igg2分子不相互作用。表7显示由各样品产生的任意值。表7：plbl2与不同宿主系统中表达的igg4和igg2分子的结合分子编号相对响应单位mab3-1.0mab6a119.2mab6b118.8实施例6-igg2和igg4亚型的抗体的结合亲和力的定量先前实验已显示相比于其他亚类的抗体(例如，igg1和igg2)，igg4亚类的抗体结合plbl2的能力增加。还进行研究以定量igg4抗体对于plbl2的亲和力。样品如实施例5中所述产生。然后，使用octet®red384仪器通过生物层干涉测定法(bli)评价这些样品中plbl2与抗体结合的亲和力。将样品(与如表6中提及的相同)在pbs-t中稀释至10µg/ml。在1000rpm下，将商业可得的蛋白a生物传感器(pall)浸入各样品中120秒。然后，在1000rpm下，将上样的生物传感器浸入各种浓度(1538nm连续稀释2倍至16nm)的plbl2中300秒以评价结合，然后在1000rpm下浸入pbs-t中300秒以评估解离。根据制造商的说明，使用10mm甘氨酸ph1.5和pbs-t再生生物传感器。结果(表8)使用局部拟合以1:1结合模型产生。因为不存在相互作用，没有获得mab3的亲和力数据(图6a)。mab6a和mab6b两者均具有低亲和力；由于较快的结合速率，mab6a的亲和力相比于mab6b具有近似14倍的增加。同时解离速率是相似的。mab6a和mab6b的拟合分别显示于图6b和6c中。这些结果显示尽管宿主细胞表达系统不影响表达的igg4结合plbl2的能力，但可能影响分子的结合亲和力。表8：igg2和igg4分子的结合亲和力分子编号kd(um)kon(1/ms)kdis(1/s)mab3n/an/an/amab6a11.23.82e+055.26e-02mab6b1601.32e+045.63e-02实施例7-由hdx-ms探测的mab7和plbl2之间的相互作用为了进一步理解mab7和plbl2之间的科学潜在相互作用，使用偶联至synaptg2-s质谱仪的watershdx管理系统进行mab7和与plbl2样品结合的mab7的hdx-ms分析。基于通过spr的40.0µm的kd，~70%的mab在氘标记后与plbl2结合。在0.5分钟、5分钟、60分钟、120分钟、180分钟和240分钟测量氘标记。数据使用watersdynamx软件和产生的hdx微分图(图7)进行分析。竖杆代表来自六个标记时间点的各肽的总hdx差值。未结合和plbl2结合的mab7的hdx谱的比较揭示重链中的区域k218-f256显示结合至plbl2后氘摄取的降低。这指示此区域由于plbl2结合至mab7而稳定且与其他实验结合结果良好相关。实施例8-不同mab的铰链区的序列比对先前结果证实plbl2通过直接结合至产物和共纯化而污染mab7(igg4分子)。类似地，先前实施例已显示mab5和mab6(其也是igg4亚型的)也能够结合plbl2。结合至不同同种型的mab的plbl2的分析表明该结合最可能在igg4分子的铰链区中发生，其得到hdx-ms数据支持。鉴于不同igg同种型中不同氨基酸的数量较小，可能可鉴定参与plbl2结合的单个氨基酸残基。为了确定参与plbl2结合的igg4氨基酸残基，产生mab产物的铰链区的氨基酸序列比对。在分析序列比对中，目标残基是在其中观察到plbl2结合的igg4分子(mab5、mab6和mab7)中保守和在其中plbl2不结合的其他igg亚型中不保守(即，不同的残基)的那些残基。此分析产生10个此类残基，其由黑框(图8)标示。具体地，目标残基是：k203、r222、s227、y229、g230、p237、p238、e246、f247和e248。预期将这10个残基从见于igg4中的氨基酸突变为见于igg2或igg1中的氨基酸防止plbl2结合至igg4分子。实施例9-igg4铰链区残基的诱变以减轻与plbl2的结合实施例1至8中详述的研究已显示igg4分子的恒定区主要负责使这些免疫球蛋白能够结合至plbl2。此外，在igg4和igg2/igg4嵌合体之间所作的比较已允许将与plbl2的这些相互作用局限于该分子的铰链区处或在该分子的铰链区附近。已经研究的各种分子的氨基酸序列的比对，已允许通过消除的方法鉴定铰链区内的在plbl2结合中发挥作用的特定氨基酸。最终步骤是进行验证性诱变实验以显示igg4分子的铰链区的修饰如何可减轻此亚类的免疫球蛋白与plbl2的结合。进行研究，其中将鉴定为负责引起plbl2结合至igg4亚类的抗体的10个氨基酸残基中的7个取代成替代氨基酸(诸如在人类igg1和/或igg2抗体的种系铰链序列中发现的那些)。使用mab5作为模型分子，实施诱变实验，其中hek293宿主细胞表达系统用编码具有修饰的铰链区的许多mab5变体的载体dna瞬时转染。对mab5的铰链区的突变在先前鉴定为在影响plbl2结合中具有一定作用的氨基酸序列位置(实施例8)。突变作为单点突变(如表1中已描述)以及以其各种组合引入，导致产生7种不同铰链修饰的igg4变体分子(mab5-1b、2b、3b、4b、6b和7b)。平行地，还设置培养以瞬时表达未修饰的亲本igg4(mab5b)。除此之外，还对mab7(也是igg4，但针对不同抗原靶标)的铰链区实施突变(作为单点突变以及以其各种组合)，导致产生3种不同的铰链修饰的变体(mab7-2b、4b和5b)。这些变体的后缀编号反映所作突变且该编号跨两组铰链修饰的igg4变体保持不变。因此，mab5-2b的铰链区与mab7-2b的铰链区相同。此外，还设置培养以表达作为额外对照的igg2(mab3b)和igg4(mab6b)，以及铰链修饰的igg1变体(mab2-αb)。图9说明这些igg4变体的修饰的铰链区，并将其针对研究中包括的其他mab分子的铰链区序列进行比对。表9详述评估的不同分子。分子名称上的后缀“a”和“b”分别表示该抗体是表达于chok1，还是hek293细胞中。表9：评估的igg1、igg2、igg4和igg4变体的详情分子名称修饰分子类型mab2-αbk222r的取代hek293表达的铰链修饰的igg1变体mab3bhek293表达的igg2mab5bhek293表达的igg4mab5-1bk203q的取代hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab5-2br222k的取代hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab5-3bs227p的取代hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab5-4br222k和s227p的取代hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab5-5bygpp(seqidno:23)缺失ccve(seqigno:25)插入hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab5-6bygpp(seqidno:23)缺失scdktht(seqidno:24)插入hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab5-7be226l的取代hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab5-8br222t的取代hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab6bhek293表达的igg4mab7achok1表达的igg4mab7-2br222k的取代hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab7-4br222k和s227p的取代hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab7-5bygpp(seqidno:23)缺失ccve(seqigno:25)插入hek293表达的铰链修饰的igg4变体mab8achok1表达的igg1由hek293细胞产生的材料使用标准mab纯化工艺纯化。简而言之，在培育适当时段以足够瞬时表达产物mab后，移除细胞并使用蛋白a亲和色谱纯化澄清的细胞培养上清液。使用tris溶液将蛋白a洗脱物滴定至中性ph。然后，对含有所研究的不同mab分子的中和的蛋白a洗脱物进行一系列结合测定，如实施例10至12中所述。实施例10：对igg2、igg4和igg4变体分子的plbl2相互作用测定使用biacore™t200(gehealthcare)结合方法，通过表面等离振子共振(spr)评价实施例9中产生和描述的各种mab与重组人类plbl2的相互作用。将20µg/ml的mab持续60秒以10µl/min注射于商业可得的预固定蛋白a芯片(gehealthcare)的流动室4上，且允许在hbs-ep+运行缓冲剂中稳定10秒。捕获的抗体的水平变化小于10%。然后将100µg/ml(1538nm)重组人类plbl2持续120秒以5µl/min注射于流动室4和3上。流动室3充当在线参考室，减小的5µl/min流动速率用于促进低亲和力相互作用。然后，使用10mm甘氨酸ph1.5以30µl/min再生传感器10秒。基于先前实验的结果，已知mab8a(其为igg1)不与重组人类plbl2相互作用。因此，其用作阴性对照以将结果归一化。spr分析的结果(图10)指示plbl2与mab5-2b和mab5-4b的ru相比于其亲本分子(mab5b)大致减小90%，且plbl2与mab7-2b和mab7-4b的ru相比于其亲本分子(mab7a)近似下降80%。mab5-3b显示结合无变化，其指示此突变单独无法成功减少相互作用。mab5-2b在位置222中含有从精氨酸至赖氨酸的单一氨基酸取代。mab5-3b在位置227中含有从丝氨酸至脯氨酸的单一氨基酸取代。mab5-4b含有存在于mab5-2b和mab5-3b两者中的突变；其指示尽管位置227中的脯氨酸取代不减少plbl2相互作用，但也没有不利影响，且观察到plbl2结合的减少是由于在位置222处的赖氨酸取代。事实上，当相比于表现出对plbl2无结合的亲本分子(mab2)时，在mab2中在位置222处的赖氨酸(图9)取代成精氨酸(其代表在此位置处的igg1至igg4种系的转换)产生通过spr具有增加的与plbl2的结合的突变体(mab2-αb)。相比于亲本分子(mab5)，将在mab5中在位置222处的精氨酸(图9)转换为苏氨酸(其代表在此位置处的igg4至igg2种系的转换)产生通过spr具有近似30%减少的与plbl2的结合的突变体(mab5-8b)。尽管此数据表明位置222处的精氨酸是促进plbl2结合的显著因素，但其他铰链残基也可影响此hcp的结合，如通过由mab5-5b表现出的降低的plbl2结合所证明(图10)。同时mab8a显示不与plbl2相互作用；mab6b显示最大量的结合。实施例11-对igg2、igg4和igg4变体分子的plbl2亲和力测定以与实施例6中描述的相同方式，使用octet®red384仪器(fortebio)通过生物层干涉测定法(bli)测试，plbl2与实施例9中产生和描述的各种mab的相互作用的亲和力。在1000rpm下，将商业可得的蛋白a生物传感器浸入10µg/ml的样品中120秒。在1000rpm下，将生物传感器浸入测定缓冲剂(hbs-ep+)中30秒以允许松散结合的蛋白的解离。然后将上样的生物传感器浸入各种浓度(1538、769.2、384.6、192.3、96.15、48.15、24、0nm)的重组人类plbl2中并最终浸入hbs-ep+中5分钟。结合和解离速率使用具有整体拟合的1:1结合模型进行测量；然而由于快解离速率而仅分析解离曲线的前50秒。结果显示于表10中。表10：igg1、igg2、igg4和igg4变体分子的结合亲和力*基于mab5b的kd计算的倍数变化。由于较差的曲线拟合而无法计算mab5-2b、mab5-4b、mab7-2b、mab7-4b和mab8a的动力学值，其指示这些分子与plbl2没有相互作用。这些结果与来自实施例10的发现一致，其也证实这些样品与plbl2的结合受到影响。相比于亲本分子(mab5b)，对于mab5-6b看到kd的大幅降低(高于10x)。mab5-1b和mab5-7b显示由于稍快结合速率(kon)而与plbl2的亲和力稍微增加(其是不期望的)。当相比于亲本分子时，所有剩余突变体都显示与plbl2的结合降低小于10x且因此认为结合亲和力的变化是不显著的。实施例12：igg2、igg4和变体igg4分子的抗原结合抗体分子mab3、mab5(包括所有铰链修饰的变体)和mab6全部包含相同的可变区，因为这些抗体针对相同的抗原靶向。为了证实样品诱变对各分子的抗原结合活性没有不利影响，使用biacore™t200(gehealthcare)通过表面等离振子共振(spr)评价抗原结合。通过使用预固定蛋白a传感器(gehealthcare)以捕获配体来评价活性。在使用前，在所有流动室上运行5x启动循环，以再生传感器表面(在30µl/min下使用10mm甘氨酸ph1.5，持续60秒)。各mab样品10µg/ml稀释于pbs-t中且持续60秒以10µl/min注射于流动室4上，其中稳定时段为10秒。然后将10µg/ml靶抗原持续60秒以10µl/min注射于流动室4和3上，其后停止注射并持续100秒以10µl/min的流动速率注射测定缓冲剂以允许解离。然后，使用10mm甘氨酸ph1.5以30µl/min再生传感器表面60秒，准备用于下一次注射。为了计算各分子的活性，将抗原结合响应(ru)除以抗体捕获响应(ru)且报告为百分比。报告的百分比指示存在于样品中的仍能够结合至其抗原的抗体的量。归因于该实验的测定误差为10%。表11显示所有mab都展示对靶抗原的100±10%活性，指示不存在结合损失或变化。所有突变体性能相当。具体而言，在mab5b或其铰链修饰的变体(mab5-1b至7b)的任一个的结合不存在差异。表11：各mab的igg2和igg4亚类与靶抗原的结合样品id%结合mab3b103.1%mab5b94.3%mab5-1b95.3%mab5-2b95.0%mab5-3b93.4%mab5-4b95.1%mab5-5b94.9%mab5-6b94.8%mab5-7b97.3%mab6b94.2%实施例13-igg4与宿主细胞蛋白(hcp)的结合的减轻有问题的宿主细胞蛋白通常与产物共纯化，且尽管通常以仅痕量存在，但已有其中完全纯化的药物物质中存在的水平可呈现安全性和药效问题两者的情况。尽管plbl2的结合呈现此情况的重要实例，但存在报导其他有问题的宿主细胞蛋白与目标抗体产物相互作用的情况。作为结果，进行研究以证明igg4铰链区修饰对减轻其他hcp的结合的影响。第一阶段将是鉴定具有与igg4相互作用的倾向的hcp，例如，使用mab6作为模型分子。这些hcp可使用hcp富集方法鉴定，由此mab的fc区将结合至商业可得的蛋白a珠粒且经历用无chok1澄清的未处理批量(cub)材料的多个10分钟孵育时段。然后，从珠粒洗脱最终结合的复合物，并使用lc-ms/ms分析。多反应监测(mrm)方法可用于定量存在的宿主细胞蛋白。一旦这些hcp已经成功鉴定，则先前实施例中详述的方法可用于评价这些hcp与原始mab5分子连同修饰的mab5突变体(其产生描述于实施例9中)两者的结合。这些研究将有助于说明使用作为本发明主题的铰链区修饰，不仅减轻plbl2与igg4的结合，而且更广泛地降低更通常结合至hcp的倾向的能力。当前第1页12