用于评价和治疗癌症的材料和方法与流程

本申请要求于2016年9月27日提交的美国申请系列号62/400,420的优先权。该在先申请的公开内容被认为是本申请的公开内容的一部分，并且以其整体合并入本申请中。

背景

1.技术领域

本文件涉及用于评价和治疗与2型蒲肯野细胞抗体(pca-2)-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和癌症的方法和材料。例如，本文件涉及用于使用微管相关蛋白1b(map1b)多肽及其片段来检测pca-2-特异性自身抗体的存在或不存在的方法和材料。

2.背景信息

神经限制性自身抗体作为获得性神经学病症(特发性的和副肿瘤性的两者)的血清生物标志物而出现。在2000年，pca-2被描述为由小细胞肺癌(sclc)引发的副肿瘤性神经学自身免疫性的igg生物标志物，其中具有在中枢和周围神经组织以及sclc细胞中表达的～280-kda的肿瘤神经胞质抗原(vernino等人,ann.neurol.,47:297-305(2000))。该自身抗体被命名为pca-2，以区分其与卵巢癌和乳腺癌相关性小脑变性的生物标志物pca-1(aka抗-yo；greenlee等人,ann.neurol.,14:609-13(1983))。

概述

本文件提供了用于检测与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症的方法和材料，以及用于治疗与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症(例如，神经内分泌肿瘤)的方法和材料。

如在本文中所描述的，map1b是与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症的抗原靶标，所述pca-2-特异性自身抗体充当小细胞肺癌的强的阳性预测物和关于具有多种多样的神经学表现的副肿瘤性神经学病症的生物标志物。pca-2-特异性自身抗体(在本文中也称为map1b-特异性自身抗体)的检测可以用于支持与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和癌症的诊断。map1b在发育中的神经元和神经内分泌肿瘤(例如sclc)两者中均高度表达，并且可以被靶向以用于治疗副肿瘤性神经学病症。

总体而言，本文件的一个方面刻画了用于检测在来自个体的生物学样品中pca-2-特异性自身抗体的存在或不存在的方法。所述方法包括下列步骤或基本上由下列步骤组成：使来自个体的生物学样品与map1b多肽或其片段相接触，如果所述生物学样品包含所述pca-2-特异性自身抗体，则形成map1b-pca-2-特异性自身抗体复合物；和检测所述复合物的存在或不存在。在所述生物学样品中所述pca-2-特异性自身抗体的存在可能与在所述个体中的与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症或癌症相关。所述副肿瘤性神经学病症可以是脑炎/脑病、癫痫发作、睡眠障碍、小脑功能障碍/小脑变性/小脑共济失调、视神经病、视网膜病变、运动障碍/非随意运动、眼球运动异常、周围神经病、自主神经功能障碍、神经肌肉连接综合征、兰-伊肌无力综合征(lems)、库欣综合征、抗利尿激素分泌失调综合征(siadh)、副肿瘤性小脑变性、脑脊髓炎、边缘性脑炎、脑干脑炎、斜视眼阵挛-肌阵挛-共济失调综合征或多肌炎。在一些实施方案中，所述副肿瘤性神经学病症可以是lems。所述癌症可以是小细胞肺癌(sclc)、肾癌、鳞状细胞皮肤癌、肺外小细胞癌(epscc)、前列腺腺癌、原发性肝内胆管癌、尤因肉瘤、鼻咽癌、淋巴瘤、肺大细胞神经内分泌癌(lcnec)、胃肠胰腺神经内分泌肿瘤(gep-net)、垂体肿瘤、甲状腺肿瘤或髓样癌。在一些实施方案中，所述癌症可以是sclc。所述方法还可以包括施行western印迹以检测所述复合物。所述方法还可以包括检测所述复合物的存在或检测所述复合物的不存在。所述生物学样品可以是血清、血浆、脑脊液或血液。

在另一个方面，本文件刻画了试剂盒，其包含map1b多肽或其片段以及关于使用所述map1b多肽来检测个体中的pca-2-特异性自身抗体的使用说明书。所述试剂盒可以用于诊断在个体中与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症或癌症的存在或不存在。所述试剂盒还可以包含具有对于map1b多肽或其片段的特异性结合亲和力的单克隆抗体。所述试剂盒还可以包含pca-2-特异性自身抗体。

在另一个方面，本文件刻画了用于治疗具有与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症的个体的方法。所述方法包括下列步骤或基本上由下列步骤组成：将个体鉴定为具有与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症；和向所述个体施用免疫调谐剂。所述将个体鉴定为具有与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症的步骤可以包括：使来自所述个体的生物学样品与map1b多肽或其片段相接触，如果所述生物学样品包含所述pca-2-特异性自身抗体，则形成map1b-pca-2-特异性自身抗体复合物；和检测所述复合物的存在。所述免疫调谐剂可以包括皮质类固醇。所述免疫调谐剂可以包括环磷酰胺。所述免疫调谐剂可以包括他克莫司。

除非另外定义，在本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本文中描述了方法和材料以用于在本公开内容中使用；也可以使用本领域中已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和实例仅是举例说明性的，而并不意在进行限制。在本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过提及而以其整体合并入本文。在出现冲突的情况下，本说明书(包括定义)将会进行控制。

在附图和下面的描述中阐明本发明的一个或多个实施方案的详情。本发明的其他特征、目标和优点将会从所述描述和附图中以及从权利要求书中变得明显。

附图描述

图1为间接免疫荧光，其显示了来自血清的患者的map1b(pca-2)-特异性igg(以1:240的稀释度)与小鼠神经系统和其他器官组织的混成体的结合。图版a显示了蒲肯野细胞细胞质，并且树突被染成明亮的颜色。还看到分子层(ml)和颗粒层(gl)的突触染色。图版b显示了在小脑齿状神经元的细胞质中的强烈的免疫反应性。图版c显示了在胃的平滑肌内在肠肌神经丛和神经纤维内被染成明亮颜色的神经节。在胃粘膜内的神经也被染色。图版d显示了邻近肾血管的自主(交感)神经的强烈的免疫反应性。图版e显示了弥散的“突触”染色和锥体细胞细胞质及其树突的染色，在海马的ca-1区域中。图版f显示了在皮质中锥体细胞的树突被染色。弥散的“突触”染色也是明显的。

图2a-2b显示，pca-2igg与天然神经蛋白质相结合。a)在患者血清(泳道1和2)中通过igg(pca-2)揭示了一个共同的条带(～280kda，通过参考分子量标准参照物)，但是在对照人血清(泳道3和4)中通过igg没有揭示出这样的条带。为了验证特异性，将患者igg在推定的抗原条带和对照条带上进行亲和力纯化。b)将来自推定的抗原条带和对照条带的洗脱物重新施加至混成小鼠组织底基载玻片上，并且与在混成小鼠组织载玻片上全患者血清igg的原始免疫染色模式进行比较。来自推定的抗原条带的洗脱物揭示出相同的染色模式，如在图1中所显示的。图版a显示，在分子层(ml)和颗粒层(gl)的弥散的“突触”染色的背景上，蒲肯野细胞及其树突被染成明亮的颜色；和图版b显示了在胃的平滑肌内在肠肌神经丛和神经纤维内被染成明亮颜色的神经节。

图3a-3b显示，患者igg与map1b免疫反应性在小鼠脑中共定位。在一些区域但不是所有区域中还观察到与map1a的共定位。a)上排：商购可得的map1b自身抗体；中排：患者igg；和下排：合并的图像。a列显示了小脑蒲肯野细胞和树突，b列显示了在更高的放大倍数下的树突，c列显示了在小脑的齿状核中的神经元细胞，d列显示了邻近肾动脉血管的自主(交感)神经，和e列显示了在胃平滑肌中的具有神经纤维的肠肌神经丛。b)上排：商购可得的map1a自身抗体；中排：患者igg；和下排：合并的图像。图版a显示了肠肌神经丛，其中没有观察到共定位；观察到一些染色，但不是强烈的和弥散的。图版b显示，齿状神经元细胞未被染色。图版c显示了在胃粘膜内的染色。图版d和e显示了分别在小脑蒲肯野细胞和树突中观察到的共定位。

图4a-4b显示，在western印迹中map1b自身抗体(a)和患者的igg(b)与具有相似分子量的蛋白质相结合。小鼠脑蛋白质的western印迹揭示了商购可得的map1b抗体和患者igg与具有相似分子量的条带的结合以及染色模式。商购可得的针对map1a、map2和map2b的抗体与具有不同分子量的蛋白质相结合。版面a在较低曝光下拍摄以减少信号程度并允许与在版面b中的患者信号相比较。正常对照没有显示出条带。

图5a-5b显示了关于与不同map1b和map1a片段的结合而对血清进行的重组western印迹筛选。a)当在western印迹上筛选map1b片段1重组蛋白时，在患者血清(泳道1、2和3)中通过igg揭示了一个共同的条带(～110kda，通过参考分子量标准参照物)，但是在对照人血清(泳道4和5)中通过igg没有揭示出这样的条带。b)用40名个体pca-2-阳性患者的血清通过western印迹探测的重组map1b和map1a蛋白片段。所有的igg都与map1b片段1(多肽1-666)具有反应性；50％与片段2相结合。绿色＝阳性；黄色＝中等反应性的；橙色＝模棱两可地具有反应性的；红色＝阴性。用包含map1b片段1和map1b片段2的重叠区域的合成肽进行的western印迹揭示，残基540-693构成主要b细胞表位(在40个患者血清中的27个之中结合igg)。

图6显示了通过map1b片段1抗原来消除患者igg。在将患者血清与重组map1b一起进行温育后(吸收后，下排)，消除了患者igg的特征性染色模式(吸收前，上排)。图版a显示了小脑蒲肯野细胞和树突。图版b显示了邻近肾动脉血管的自主(交感)神经。图版c显示了在胃平滑肌中的具有神经纤维的肠肌神经丛。图版d显示了在用map1b片段1进行吸附后在来自anna-1阳性患者的小脑的齿状核中的神经元细胞，没有染色损失。

图7显示，sclc肿瘤表达map1b。泳道1-3是用map1b商业抗体进行筛选的小细胞肺肿瘤。泳道1，梅奥诊所(mayoclinic)小细胞癌细胞系(scc)-81，阳性；泳道2，scc-117阴性；泳道3，国立癌症研究所-146(sclc细胞系)阳性。泳道4为用map1b进行筛选的小鼠脑(作为阳性对照)。从中切除了肿瘤的小细胞癌患者的神经学诊断：scc2、4、17、18、24(未显示)–兰-伊肌无力综合征(lems)，scc-21、59(未显示)–无神经学症状，scc81–感觉运动周围神经病，scc117–共济失调和感觉神经病，nci-146–信息不可得。

图8显示了人微管相关蛋白1b(map1b)的氨基酸序列(seqidno:1)。加有下划线并高亮显示的残基表示片段之间的重叠。高亮显示的残基表示在map1b和map1a之间的具有8个或更多个氨基酸的同源性区域。

图9显示了人微管相关蛋白1a(map1a)的氨基酸序列(seqidno:2)。加有下划线并高亮显示的残基表示片段之间的重叠。高亮显示的残基表示在map1b和map1a之间的具有8个或更多个氨基酸的同源性区域。

图10为显示了关于95名患者的临床信息的表格。

详细描述

在呈现出具有与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症(例如，神经内分泌肿瘤)的个体的血清中发现特异性igg自身抗体标志物(pca-2)。pca-2的靶标在本文中被鉴定为map1b，其为一种微管相关蛋白，该微管相关蛋白在中枢和周围神经中遍布存在，并且在发育中的神经元和神经内分泌肿瘤两者中均高度表达。pca-2-特异性自身抗体也可以称为map1b-特异性自身抗体。

本文件提供了用于使用map1b多肽或其片段来检测在呈现出具有与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症的个体中的pca-2-特异性自身抗体的材料和方法。pca-2-特异性自身抗体的存在可以用于将所述个体诊断为具有与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症。在本文中还提供了用于治疗呈现出具有与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症的个体的材料和方法。任何适当的个体都可以如在本文中所描述的那样进行诊断或治疗。可以经历在本文中所描述的方法的个体的实例包括(而非限制)：人、非人灵长类、猴、牛类物种、猪、马、狗和猫。

任何适当的与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症都可以通过使用在本文中所描述的方法和材料来进行诊断和/或治疗。副肿瘤性神经学病症涉及在从中枢神经系统至周围神经系统的任何水平上损害神经系统的自身免疫状况或炎性状况。在一些情况下，与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症可以是与神经内分泌肿瘤相关的神经学病症。与神经内分泌肿瘤相关的副肿瘤性神经学病症包括(而非限制)：脑炎/脑病、癫痫发作、睡眠障碍、小脑功能障碍/小脑变性/小脑共济失调、视神经病、视网膜病变、运动障碍/非随意运动、眼球运动异常、周围神经病、自主神经功能障碍、神经肌肉连接综合征、兰-伊肌无力综合征(lems)、库欣综合征、抗利尿激素分泌失调综合征(siadh)、副肿瘤性小脑变性、脑脊髓炎、边缘性脑炎、脑干脑炎、斜视眼阵挛-肌阵挛-共济失调综合征和多肌炎。例如，具有lems的个体可以通过使用在本文中所描述的方法和材料来进行诊断和/或治疗。在一些情况下，与pca-2-特异性自身抗体相关的癌症可以是神经内分泌肿瘤。神经内分泌肿瘤可以在身体的许多不同部位(例如，肺、肠、胰腺、胃肠道、胸腺和甲状腺)中出现。神经内分泌肿瘤的实例包括(而非限制)：sclc、肾癌、鳞状细胞皮肤癌、肺外小细胞癌(epscc)、前列腺腺癌、原发性肝内胆管癌、尤因肉瘤、鼻咽癌、淋巴瘤、肺大细胞神经内分泌癌(lcnec)、胃肠胰腺神经内分泌肿瘤(gep-net)、垂体肿瘤、甲状腺肿瘤和髓样癌。例如，具有sclc的个体可以通过使用在本文中所描述的方法和材料来进行治疗。

map1b多肽和抗-pca-2抗体

map1b多肽(及其片段)可以用于检测pca-2-特异性自身抗体。map1b多肽序列(以及编码此类多肽的核酸)的实例可以在国立生物技术信息中心(ncbi)genbank中找到。人map1b多肽序列的实例包括(而非限制)：genbank登录号aaa18904(版本aaa18904.1；gi:473431)、cam06633(版本cam06633.1；gi:122703742)、cam12311(版本cam12311.1；gi:122703744)和p46821(版本p46821.2；gi:317373388)。另外的map1b序列可以例如在公共数据库中找到。一个代表性的人map1b序列显示在图8(seqidno:1)中。在一些情况下，map1b多肽的片段可以如在本文中所描述的那样用于检测pca-2-特异性自身抗体。可以用于检测pca-2-特异性自身抗体的map1b片段的实例可以包括(而非限制)：seqidno:1的片段(例如，seqidno:1的氨基酸1-666，seqidno:1的氨基酸576-1990，seqidno:1的氨基酸1111-1690，seqidno:1的氨基酸1611-2120，或seqidno:1的氨基酸2040-2168)。

map1b多肽或其片段可以在任何适当的情景下提供。在一些情况下，map1b多肽或其片段可以处于溶液(例如，细胞裂解物)中。在一些情况下，map1b多肽或其片段可以处于固体底基(例如，组织，例如脑(例如，小脑、中脑、大脑皮质或海马)、肾、肠、胃或其他包含周围神经成分的组织)中。

在一些情况下，map1a多肽(及其片段)可以用于检测pca-2-特异性自身抗体。一个代表性的人map1a序列显示在图9(seqidno:2)中。可以用于检测pca-2-特异性自身抗体的map1a片段的实例可以包括(而非限制)：seqidno:2的片段(例如，seqidno:2的氨基酸1-670，seqidno:2的氨基酸606-1204，seqidno:2的氨基酸1181-1720，seqidno:2的氨基酸1661-2200，或seqidno:2的氨基酸2141-2803)。

本文件还提供了编码在本文中所描述的map1b多肽(或其片段)的核酸和构建体。如在本文中所使用的，核酸(例如，map1b核酸)是指rna或dna。如在本文中关于核酸进行使用时，“分离的”是指：(i)编码map1b多肽的部分或全部的核酸序列，但是不含在基因组中通常位于编码map1b的核酸序列的一侧或两侧侧翼的编码序列；或(ii)掺入到载体中或掺入到生物体的基因组dna中从而使得所得的分子不与任何天然存在的载体或基因组dna相同的核酸。

map1b多肽可以具有偏离野生型map1b多肽序列(例如，seqidno:1)的序列，其有时被称为变体序列。例如，map1b多肽序列可以与seqidno:1具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，map1b多肽序列可以与seqidno:1具有至少85％的序列同一性、90％的序列同一性、95％的序列同一性或至少99％的序列同一性。序列同一性百分比通过下述方式来计算：确定在所比对的核酸或多肽序列中相匹配的位置的数目，将相匹配的位置的数目分别除以所比对的核苷酸或氨基酸的总数目，并乘以100。相匹配的位置是指这样的位置，在所述位置中相同的核苷酸或氨基酸出现在所比对的序列中的相同位置处。所比对的核苷酸或氨基酸的总数目是指对于比对第二序列来说所必需的map1b核苷酸或氨基酸的最小数目，并且不包括与非map1b序列(例如与map1b相融合的那些)的比对(例如，强制比对)。所比对的核苷酸或氨基酸的总数目可以相应于完整的map1b序列，或者可以相应于在本文中所定义的全长map1b序列的片段。

序列可以通过使用合并到blast(基本局部比对搜索工具)程序(其可在万维网上的ncbi.nlm.nih.gov处得到)中的由altschul等人(nucleicacidsres.，25:3389-3402(1997))所描述的算法来进行比对。可以进行blast搜索或比对以通过使用altschul等人的算法来确定在map1b核酸分子和任何其他序列或其部分之间的序列同一性百分比。blastn是用于比对和比较核酸序列之间的同一性的程序，而blastp是用于比对和比较氨基酸序列之间的同一性的程序。当采用blast程序来计算在map1b序列和另一序列之间的同一性百分比时，使用各自程序的默认参数。

map1b多肽可以获得自人、小鼠或其他哺乳动物的神经元组织、神经元细胞系或表达重组map1b核酸的经转染的细胞(例如，哺乳动物、大肠杆菌(e.coli)或酵母)，或者map1b多肽可以是合成的。多肽可以是经纯化的。“经纯化的”多肽是指构成在组分混合物中的主要组分(例如，以重量计，30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多或者99％或更多)的多肽。多肽可以通过包括亲和层析或免疫吸附亲和柱的方法来进行纯化。

在给定map1b多肽序列(参见，例如seqidno:1)的情况下，几乎任何的多肽片段可以通过例如多肽的蛋白水解切割或化学合成来产生。map1b多肽的片段可以包含一个或多个表位位点(例如，b细胞表位)。在map1b多肽内与t-细胞激活和阻抑有关的表位位点(例如，mhc-i和mhc-ii结合表位)可以通过直接研究或者通过使用计算机算法来确定。参见，例如parker等人(j.immunol.,152:163(1994))和southwood等人(j.immunol.,160:3363(1998))。

本文件还提供了具有对于map1b多肽或其抗原性片段的特异性结合亲和力的抗体，包括单克隆抗体。在本文中所描述的map1b多肽可以用于产生具有对于map1b多肽的特异性结合亲和力的单克隆或多克隆抗-map1b抗体。此类抗体可以通过使用诸如杂交瘤技术和展示技术的技术来产生。如在本文中所使用的，具有对于map1b多肽或其片段的“特异性结合亲和力”的抗-map1b抗体被定义为优先结合map1b多肽或其片段，但不结合非map1b多肽或具有非常低的对于非map1b多肽的亲和力的那些抗体。尽管在本文中所描述的map1b-特异性自身抗体是igg抗体，但是重组“抗-map1b抗体”可以是任何类别的完整抗体(例如，igg、iga、igm)，具有所希望的特异性结合亲和力的完整抗体的部分或片段(例如，fab或(fab)2片段)，经改造的单链fv分子，或嵌合分子，例如包含一种抗体(例如，鼠类来源的)的结合特异性和另一种抗体(例如，人来源的)的其余部分的抗体。

本文件还提供了包含一种或多种map1b多肽或其片段的制品(例如，试剂盒)。在本文中所描述的制品之中所包含的map1b多肽或其片段可以提供在细胞之内、在其中它们是可溶的溶液之中，或者所述map1b多肽或其片段可以以冻干形式提供。所述试剂盒可以进一步包含第二物质，所述第二物质例如提供可检测的信号。另外，试剂盒可以包含关于使用所述map1b多肽的指导和/或关于实施在本文中所描述的方法(即，检测在生物学样品中的pca-2-特异性自身抗体)的指导。

在一些情况下，试剂盒可以被设计成包含具有对于map1b多肽或其片段的结合亲和力的抗-map1b抗体。所述试剂盒还可以包含map1b多肽或其片段，以用作结合对照或用于产生标准化定量曲线。所述试剂盒可以进一步包含提供可检测的标记的第二物质。试剂盒典型地包含关于使用抗-map1b抗体(例如，用于检测或纯化map1b多肽)的指导。

检测方法

本文件还提供了用于检测pca-2-特异性自身抗体的方法。pca-2-特异性自身抗体的存在可以用于诊断与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症。在一些情况下，在具有lems的患者中pca-2-特异性自身抗体的检测可以预测sclc的存在。map1b多肽或其片段可以用在各种免疫学技术中以检测pca-2-特异性自身抗体。例如，map1b多肽可以用在免疫测定法中以检测生物学样品中的pca-2-特异性自身抗体。在免疫测定法中所使用的map1b多肽可以处于细胞裂解物(例如，全细胞裂解物或细胞级分)中，或者可以使用经纯化的map1b多肽或其片段，条件是至少一个被pca-2-特异性自身抗体所识别的抗原性位点保持对于结合来说是可用的。取决于样品的性质，可以使用免疫测定法和免疫细胞化学染色技术中的任一种或两者。酶联免疫吸附测定法(elisa)、western印迹和放射免疫测定法可以如在本文中所描述的那样用于检测在生物学样品中pca-2-特异性自身抗体的存在。

map1b多肽或其片段可以具有或不具有修饰地用于检测pca-2-特异性自身抗体。多肽可以通过将所述多肽与提供可检测的信号的第二物质共价地或非共价地相组合来进行标记。可以使用多种多样的标记物和缀合技术。可以使用的标记物的一些实例包括：放射性同位素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂、磁性颗粒等。

在本文中所使用的“生物学样品”通常是来自个体的样品。生物学样品的非限制性实例包括：血液、血清、血浆或脑脊液。另外，可以使用实体组织，例如脊髓或脑活组织检查物。

在本文中所描述的抗-map1b抗体可以用在各种免疫学技术中以用于检测map1b多肽。取决于样品的性质，可以使用免疫测定法(例如，放射免疫测定法)和/或免疫组织化学/免疫细胞化学染色技术。液相免疫测定法(例如，竞争性抑制放射免疫测定法)或固相免疫测定法(例如，抗原-捕获或western印迹分析)也可以用于检测map1b多肽。另外，酶联免疫吸附测定法(elisa)可以用于检测map1b多肽的存在。

抗-map1b抗体可以具有或不具有修饰地用于检测map1b多肽。抗-map1b抗体可以用多种多样的标记物(包括放射性同位素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂和磁性颗粒)直接地或间接地进行标记。在一些情况下，可以将具有对于map1b多肽的特异性结合亲和力的抗-map1b抗体缀合至成像剂。合适的成像剂包括但不限于放射性同位素，例如³²p、⁹⁹tc、¹¹¹in和¹³¹i。

用于检测map1b多肽和/或pca-2-特异性自身抗体的方法可以包括从个体中列数或分离pca-2-特异性自身抗体。该方法可以例如用于监测和/或评价个体的免疫应答、疾病状态和/或治疗应答。

治疗方法

本文件还提供了用于治疗其免疫系统正在产生pca-2-特异性自身抗体的个体(例如，人)的方法。

在一些情况下，map1b多肽可以如在本文中所描述的那样用于诊断个体中的与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症，并且可以向所述个体施用免疫疗法来治疗所述与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症。免疫疗法的实例包括(而非限制)：免疫调谐(例如，激活免疫疗法或阻抑免疫疗法)、抗原特异性耐受诱导策略(例如，map1b-特异性耐受诱导策略)和靶向map1b-特异性t细胞和/或b细胞的免疫疗法。可以用于阻抑免疫应答的免疫调谐剂的实例包括(而非限制)免疫抑制剂(例如，皮质类固醇、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤、他克莫司、环磷酰胺、利妥昔单抗和/或mtor抑制剂)。例如，皮质类固醇可以用于治疗与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症。可以用于靶向t细胞的免疫调谐剂包括(而非限制)环磷酰胺和/或他克莫司。例如，环磷酰胺和/或他克莫司可以用于治疗与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症。

在一些情况下，在本文中所描述的map1b多肽可以用在单采血液成分术方法中以治疗与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症。例如，用于治疗与pca-2-特异性自身抗体相关的副肿瘤性神经学病症和/或癌症的单采血液成分术可以用于从个体中去除pca-2-特异性自身抗体。用于单采血液成分术(即，从个体中抽取血液、从所述血液中去除组分并且将所述血液或者耗竭了一种或多种组分的血液输回至所述个体的过程)的方法和体外系统可以如在其他地方(参见，例如，美国专利号4,708,713；5,258,503；5,386,734；和6,409,696)所描述的那样进行使用。在一些情况下，单采血液成分术方法可以用于从个体的体液中去除pca-2-特异性自身抗体。所述方法可以包括从个体中抽取体液；从所述体液中去除实质部分的pca-2-特异性自身抗体；并且将所述体液输回至所述个体。所去除的抗体可以是任何类别的，例如igg(例如igg1、igg2、igg3、igg4)、igm、igd、iga或ige抗体。

如在本文中所使用的，“实质部分”意指去除至少20％(例如，至少：20％；30％；40％；50％；60％；65％；70％；75％；80％；85％；90％；93％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；99.8％；或甚至100％)的在去除之前在体液中存在的pca-2-特异性自身抗体。所述体液可以是血浆或任何其他体液，例如淋巴或脑脊液。按照在本文中所描述的方法，从具有pca-2-相关性自身免疫疾病的个体中耗竭pca-2-特异性自身抗体可以导致症状中的一种或多种症状的减轻或降低。

pca-2-特异性自身抗体的去除通常通过使体液与map1b多肽或其片段相接触来进行。可以将所述map1b多肽或其片段结合至固体支持物。此类固体支持物可以是(而非限制)膜、纤维、球状珠粒或颗粒，并且可以由水不溶的、优选地多孔的、生物相容的材料(例如，有机聚合物例如琼脂糖、葡聚糖和聚丙烯酰胺，或者无机多孔材料例如多孔玻璃或多孔硅胶)制成。此类材料适合于或可以经调整而适合于(例如，用适当的化学基团进行衍生化)附着map1b多肽。

当所述体液是血液时，可以将血浆和/或白血细胞与红血细胞(例如，红细胞)分开，并且可以将红血细胞输回至所述个体(有或没有白血细胞)。通常，将血细胞与人工血浆而非其原始血浆一起输回至所述个体。在去除所述体液后，可以向所述个体施用“替代液”(例如，生理盐水)。备选地，在单采血液成分术过程中可以选择性地从血浆中去除pca-2-特异性自身抗体，并且可以将血细胞与耗竭了pca-2-特异性自身抗体的血浆相混合和然后作为混合物再输注到所述个体中。

所述系统可以是连续的系统，其中例如将血液从血管(例如，动脉或静脉)中泵出并在用map1b多肽进行衍生化的固体支持物上经过，并且直接泵回到所述个体的血管中。当在不连续的系统中时，可以在使血浆在固体支持物上经过之前将血细胞与血浆分开。

本文件还提供了用于对在个体中的表达map1b多肽的细胞成像的方法。所述方法可以包括：向所述个体施用有效量的用成像剂(例如，³²p、⁹⁹tc、¹¹¹in或¹³¹i)进行标记的具有对于map1b多肽的特异性结合亲和力的抗-map1b抗体，以结合从细胞中释放出的或在细胞中可及的map1b多肽；和检测任何如此形成的复合物。抗-map1b抗体的合适量是对于使细胞成像来说有效的任何量，例如，经标记的抗-map1b抗体具有大约0.1mci至大约50.0mci。另外，抗-map1b抗体的有效量可以为大约0.01mg至大约100mg的量。

本发明将会在下面的实施例中进一步进行描述，所述实施例并不限制在权利要求书中所描述的本发明的范围。

实施例

实施例1：在与小细胞肺癌相关的副肿瘤性神经学病症中pca-2的靶标和抗原

在2000年，2型蒲肯野细胞抗体(pca-2)被描述为由小细胞肺癌(sclc)引发的副肿瘤性神经学自身免疫性的igg生物标志物，其中具有在中枢和周围神经组织以及sclc细胞中表达的～280-kda的肿瘤神经胞质抗原。将pca-2筛选合并到梅奥诊所的关于副肿瘤性神经自身抗体的综合血清学评价中。该实施例将该自身抗原鉴定为微管相关蛋白家族的成员(map1b)，并且进一步定义了pca-2的临床、肿瘤学和免疫组织化学特征。

患者

梅奥诊所机构审查委员会(mayoclinicinstitutionalreviewboard)批准了组织获取和患者病史检查。在1993年1月和2016年5月30日之间，梅奥诊所神经免疫学实验室(mayoclinicneuroimmunologylaboratory)在服务基础上测试了大约五十万份提交用于副肿瘤性神经自身抗体评价的血清或脑脊液(csf)样本。在118名具有以免疫组织化学方式或通过western印迹证明的pca-2igg的患者中，对于96名患者至少一份存档的冷冻样本是可得的(92名是血清和4名是csf)，和对于95名患者临床信息是可得的，其中22名是通过梅奥诊所的医疗记录和73名是通过与有关医师的交流。对照血清(98份)包括：33名健康受试者(mayoclinicbiobank)，17名具有各式各样的免疫性疾病的患者(6名具有系统性红斑狼疮[sle]，6名具有舍格伦综合征，5名具有高丙球蛋白血症)，15名具有多发性硬化的患者，和32名具有与igg自身抗体相关的神经学自身免疫性的患者，所述igg自身抗体显著地与小脑蒲肯野细胞的细胞质(17份pca-1阳性的)(greenlee等人,annneurol1983,14:609-13)以及与小脑蒲肯野细胞的细胞质及其树突两者(16份肌醇三磷酸受体(itpr)-1阳性的；jarius等人,jneuroinflammation2014,11:206)具有反应性。

免疫组织化学染色

间接免疫荧光测定法(ifa)：在经冷冻切片的成年小鼠组织混成体(4μm)上进行使用患者血清和csf以及商业的单克隆和多克隆抗体的筛选：小脑、中脑、大脑皮质、海马、肾和肠。切片用4％低聚甲醛固定1分钟，用在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的0.5％3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(chaps)渗透化1分钟，用正常的山羊血清(在pbs中10％)封闭1小时。用pbs漂洗后，施加患者样本(用牛肝粉末预吸收的血清，1:240稀释；未吸收的csf，1:2稀释)，或者具有下述特异性的商业igg：map1a，兔多克隆，santacruzbiotechnologyinc.(dallas,tx,usa)；map1b，小鼠单克隆，bdtransductionlaboratories,sanjose,ca,usa；map1b，兔多克隆，proteintech(rosemont,il,usa)。在40分钟和pbs洗涤后，施加物种特异性抗-igg(缀合有fitc或tritc；southernbiotechnologyassociates,inc.(birmingham,al,usa))，并且使用prolonggold防褪色介质(含有dapi；molecularprobesthermofisherscientific,usa)来封固盖玻片。使用装配有olympusdp73高性能peltier冷却17.28兆像素相机的olympusbx51偏振光显微镜来捕获荧光图像。对产生阳性结果的患者样本以双倍稀释法进行滴定以确定自身抗体检测的终点。

通过共聚焦显微术的双重染色：共定位研究采用了患者血清和对于map1a或map1b特异的商业igg。山羊igg二抗是缀合有tritc或fitc的并且特异于兔或小鼠igg(southernbiotechnologyassociates,inc.(birmingham,al,usa))，山羊抗人igg是缀合有alexafluor594的(molecularprobesthermofisherscientific,usa)。使用zeisslsm780显微镜(63x或40x水浸透镜)来捕获共聚焦图像。

蛋白纯化和测序

抗原制备：所有步骤都在4℃下进行。将成年小鼠小脑和sclc肿瘤异种移植物(lennon等人,thejournalofclinicalinvestigation2003,111:907-13；yu等人,annneurol2001,49:146-54)通过使用组织匀浆器进行匀浆，其中使用缓冲液，3ml/g(10mmhepesph7.4，1mmmgcl2，1mmedta和完全蛋白酶抑制剂混合物[rocheaindianapolis,in,usa])。通过离心(150,000g，30分钟)来使匀浆物澄清，并且将上清液贮存于-80℃。

抗体纯化：将小脑蛋白质在5％聚丙烯酰胺凝胶(page)中以电泳方式分开，然后以电泳方式转移至硝酸纤维素膜，并且在包含10％奶粉的缓冲液(20mmtris，ph7.6，137mm氯化钠，0.1％tween-20)中进行封闭。从硝酸纤维素上切下纵向边缘条(0.5cm)，并且用患者igg进行探测以定位免疫反应性条带(～280kda)。将包含处于大约280kda处的反应性条带(9.5x0.8cm)的硝酸纤维素的其余未曝光的中心区域水平地切下(并且还有来自非反应性区域的对照条)。将患者血清(以1:500稀释)施加至切下的硝酸纤维素条1小时，并且在彻底洗涤后，将结合的人igg在100mm乙酸中洗脱，中和，逆pbs进行透析，并浓缩。为了确证pca-2特异性，在小鼠组织切片上通过ifa来测试洗脱出的igg。

蛋白纯化和测序：将患者的经亲和力纯化的igg复合至g蛋白磁珠(dynabeads,invitrogenthermofisherscientific,usa)。在洗涤后，添加小脑蛋白质提取物(1小时)，重复进行洗涤，并且将珠粒在2x样品缓冲液中煮沸5分钟。将洗脱出的样品在5％(page)中进行电泳，并且通过考马斯g-250(bio-rad,hercules,california,usa)染色和通过western印迹来定位蛋白质。从经染色的凝胶上切下免疫反应性条带，还原，用碘乙酰胺进行烷基化，并且用胰蛋白酶进行消化。通过使用毫微高压液相色谱法电喷雾串联质谱法(nano-lc-esi-ms/ms)来分析在经消化的样品中的肽。

构建体：将编码全长map1a和map1b蛋白(genecopoeiaclone#hoc23132和hoc23292)的cdna用作用于使用pfx(invitrogen)或amplitaq(appliedbiosytems)dna聚合酶的扩增反应的模板。将这两种基因的编码区扩增为五个单独的片段(表1)，并且克隆到pet102d细菌表达载体(invitrogen)中。选择克隆，并且通过sanger测序来验证序列完整性。将bl-21细胞(invitrogen)用质粒dna进行转化，在抗生素选择下进行生长，并且在0.5-0.8的光密度时，用iptg(400mm)进行诱导。在37℃下额外的2.5小时后，使细胞形成粒状沉淀，并且通过提取(50mmnapo4，400mmnacl，100mmkcl，10％甘油，0.5％tritonx-100，10mm咪唑)和western印迹(马的缀合有辣根过氧化物酶的v5表位标签-特异性igg[invitrogen])来验证蛋白质表达。

用map1b进行的患者血清的吸收

在与牛肝粉末一起进行温育后，将来自2名map1b(pca-2)igg-阳性患者(患者74、82，表2)和1名阳性anna-1(抗-hu)患者的50μl血清与10μl的重组map1b蛋白片段1一起温育过夜。在温育后，在小鼠组织切片上通过ifa来检测血清。

结果

自身抗体的表征

神经抗原的免疫组织化学分布：pca-2抗原的免疫组织化学分布的最初报告记录了小脑蒲肯野神经元核周质和树突(图1a)、齿状神经元(图1b)、延伸到胃粘膜中的肠肌神经节和肠神经(图1c)和神经支配肾的交感神经(图1d)的引人注目的细胞质染色。对在延伸的小鼠组织底基中所呈现的另外的cns区域进行的检查揭示了在大脑皮质和海马的富含突触的区域上的弥散的发光(图1e、f)以及海马锥体神经元(主要为ca-1)和大脑皮质的树突的染色(图1e、1f)。

自身抗原的免疫化学表征

pca-2igg与～280kda的天然神经蛋白质相结合：用患者igg进行的小鼠脑蛋白质的western印迹探测确证了一个共同的免疫反应性条带，～280kda；对照人igg是非反应性的(图2a)。从硝酸纤维素的免疫反应性区域(而非从对照区域)洗脱出的igg复制了原始患者血清igg免疫染色模式，当施加至小鼠组织切片时(图2b；与图1相比较)。由洗脱出的igg(当固定在磁珠上时)所捕获的蛋白质的质谱法分析鉴定出三种～280kda质量的候选蛋白质：map1b(270kda)、map1a(326kda)和map2(199kda)(sato-yoshitake等人,neuron1989,3:229-38；lim等人,jbiolchem2000,275(27):20578-87)。

共聚焦显微术支持map1b为首要抗原靶标。对于map1b特异的商业igg在小鼠组织上产生与患者igg相同的染色模式(图3a)。map1a-特异性igg在一些而非所有神经系统区域中产生类似的模式(图3b)。由map2igg所产生的染色模式不与患者igg相似(未显示)。

抗原的western印迹表征：western印迹分析揭示，重组map1b具有与由患者igg所鉴定出的天然蛋白质相同的电泳迁移率(图4)；map1a和map2两者都是不同的，如由它们的已知特性所预测的那样(sato-yoshitake等人,neuron1989,3:229-38)。

map1b的片段1(包括残基1-666)包含被pca-2所识别的主要抗原性区域：map1b和map1a基因两者的编码区均被扩增为五个独立的片段(表1)，它们重叠大约60-70个残基(图8)。对于所有10个片段(map1a#1-5，map1b#1-5)，就多肽反应性igg通过western印迹来测试来自40名pca-2igg-阳性患者的血清(以1:500稀释)或csf(以1:50稀释)。在40份样本中的40份之中的igg与map1b#1相结合(图5)；在少数患者中的另外的igg与其他map片段相结合(图5)。通过western印迹，在其余57份pca-2igg阳性血清中的55份之中的igg与map1b片段1相结合。

表1.编码全长map1a和map1b蛋白的cdna充当用于pcr扩增反应的模板。每个基因的编码区被扩增为五个独立的片段，并且被克隆到细菌表达载体中。

微管相关蛋白1a和1b[智人(homosapiens)]

重组map1b蛋白取消由患者igg进行的组织结合：两名pca-2阳性患者的血清与map1b片段1一起的预温育废除了pca-2igg染色模式(图6a-c)。该预温育没有减少在具有sclc-相关的副肿瘤性神经学自身免疫性的对照患者的血清中的anna-1(抗-hu)igg的免疫染色强度(图6d)。

map1b自身免疫性的多样的神经学伴随物

对于95名患者临床信息是可得的(表3，图10)。在神经学症状发作时的中值年龄为68岁(22-89岁)；55名患者(47％)为女性，和82％(55/67)具有烟草使用史。神经学展现有不同，并且在大多数的病例中，症状和征候在发作时是亚急性的(61％)。

表2.在map1b-igg(pca-2)阳性患者中的主要神经学表现、mri发现和共存的神经抗体。

*96份可得的血清中没有一份是对于抗富亮氨酸神经胶质瘤失活1(lgi1)或接触蛋白相关蛋白样2(caspr2)抗体来说阳性的。

在50名患者中报告了周围神经病(最常见的展现)(53％)；44名具有感觉运动神经病(在16名中通过emg确证)；14名具有自主神经功能异常；和在34名患者中神经系统的其他水平受到影响。在36名患者中报告了小脑功能障碍(38％)。皮质/皮质下累及也是常常遇到的；在26名患者中报告了脑病/认知减退(27％)，其中5名具有癫痫发作。

十名患者具有可归因于前视觉系统的症状。下述发现记录在医学/实验室记录中：3名中盘水肿，4名中视神经累及(3名具有crmp-5igg)，2名中在mri上的视神经增强(1名具有crmp-5igg)，5名中视网膜病变(3名具有crmp-5igg)。

在118名患者中的79名之中(67％)检测到共存的神经抗体(表2)。两种最常见的为crmp5-igg(25％)和电压门控钙通道抗体(22％)。

在44名患者中，对于检查，mri脑报告是可得的：15名(35％)是正常的，8名(18％)在脑中具有非特异性的白质变化，和20名患者(45％)在mri上具有实质变化(表2)。最常见的疾病相关的发现是脊髓累及(5名具有t2超高强度，3名具有增强)、大脑萎缩(4名)、视神经累及(2名，1名具有增强)和颞叶累及(2名)。

在5名具有脊髓累及的患者中的4名、2名具有脑膜增强的患者中的2名和2名具有视神经累及的患者中的1名之中检测到单独的map1b-igg(其他患者具有共存的crmp-5igg)。超过一半的具有小脑或大脑萎缩和颞累及的患者具有另外的抗体，包括crmp5-igg和anna-1。

对于29名患者，csf检查的结果是可得的：15名(52％)具有多形性白细胞增多(中值白细胞计数，20个，范围6-162个，正常参考范围≤5个/高倍视野)；21名(74％)具有升高的蛋白质(中值60mg/dl，范围37-203，正常≤35mg/dl)。

map1b-igg(pca-2)的肿瘤学关联

在84名具有足够的肿瘤学评价信息的患者中，在66名中发现了癌症(79％；表3)。在44名异乎寻常地为血清阳性的患者中检测频率更高(89％)。肺癌是最常见的(所有癌症的80％)。小细胞癌以3倍的程度比非小细胞肺癌更常见(46％和17％，p<0.01)。在55％的病例中，癌症诊断遵循神经学展现。对于39名具有sclc和足够的随访信息的患者中的14名，中值存活为54个月(范围为3-164个月)。

表3.在具有足够的肿瘤学评价的pca-2igg-阳性的患者中检测到的癌症的数目(％频率)和类型。

*肾癌(1)，鳞状细胞皮肤癌(1)，肺外小细胞癌-胰腺(1)，前列腺腺癌(2)，原发性肝内胆管癌(1)，尤因肉瘤(1)，鼻咽癌(1)，淋巴瘤(1)。

**65名经组织学证实，2名基于pet/成像

***均为女性

对于仅22名患者可得的关于存活的长期随访数据

na＝没有可得的数据

用商业的map1b-特异性igg对从10个sclc肿瘤细胞系中提取的蛋白质进行的western印迹分析确证了在6个sclc肿瘤细胞系中的map1b蛋白表达(图7)。

对于仅26名患者，关于对免疫疗法的应答的数据是可得的：14名具有医师报告的来自免疫抑制的受益(神经学症状得到稳定或改善)；16名中的8名具有有益的对皮质类固醇的应答，4名中的3名具有有益的对血浆去除术的应答，2名中的2名具有有益的对环磷酰胺的应答，和2名中的0名具有有益的对高剂量iv免疫球蛋白的应答。在用于癌症的化学疗法后，在15名患者中的11名之中报告了一些神经学益处。

这些结果证明，map1b(即，pca-2自身抗原)代表了在副肿瘤性神经学病症中的新型靶标，其具有高的关于sclc的预测值。相比于其他认可的副肿瘤性神经自身抗体而言，它的相对高的盛行证明在综合副肿瘤性神经自身抗体评价中对其进行测试是正确的。

其他实施方案

应当理解，尽管本公开内容已经结合其详细描述进行了描绘，但是前面的描述旨在举例说明，而非限制本公开内容的范围，本公开内容的范围由所附的权利要求书的范围来限定。其他方面、优点和修饰在下面的权利要求书的范围之内。

序列表

<110>mayofoundationformedicaleducationandresearch

<120>用于评价和治疗癌症的材料和方法

<130>07039-1596wo1

<150>us62/400,420

<151>2016-09-27

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2468

<212>prt

<213>智人

<400>1

metalathrvalvalvalglualathrgluprogluproserglyser

151015

ilealaasnproalaalaserthrserproserleuserhisargphe

202530

leuaspserlysphetyrleuleuvalvalvalglygluilevalthr

354045

glugluhisleuargargalaileglyasnilegluleuglyilearg

505560

sertrpaspthrasnleuileglucysasnleuaspglngluleulys

65707580

leuphevalserarghisseralaargpheserprogluvalprogly

859095

glnlysileleuhishisargseraspvalleugluthrvalvalleu

100105110

ileasnproseraspglualavalserthrgluvalargleumetile

115120125

thraspalaalaarghislysleuleuvalleuthrglyglncysphe

130135140

gluasnthrglygluleuileleuglnserglyserpheserphegln

145150155160

asnpheilegluilephethraspglngluileglygluleuleuser

165170175

thrthrhisproalaasnlysalaserleuthrleuphecysproglu

180185190

gluglyasptrplysasnserasnleuasparghisasnleuglnasp

195200205

pheileasnilelysleuasnseralaserileleuproglumetglu

210215220

glyleusergluphethrglutyrleusergluservalgluvalpro

225230235240

serpropheaspileleugluproprothrserglyglypheleulys

245250255

leuserlysprocyscystyrilepheproglyglyargglyaspser

260265270

alaleuphealavalasnglypheasnmetleuileasnglyglyser

275280285

gluarglyssercysphetrplysleuilearghisleuaspargval

290295300

aspserileleuleuthrhisileglyaspaspasnleuproglyile

305310315320

asnsermetleuglnarglysilealagluleugluglugluglnser

325330335

glnglyserthrthrasnserasptrpmetlysasnleuileserpro

340345350

aspleuglyvalvalpheleuasnvalprogluasnleulysasnpro

355360365

gluproasnilelysmetlysargserilegluglualacysphethr

370375380

leuglntyrleuasnlysleusermetlysprogluproleuphearg

385390395400

servalglyasnthrileaspprovalileleupheglnlysmetgly

405410415

valglylysleuglumettyrvalleuasnprovallysserserlys

420425430

glumetglntyrphemetglnglntrpthrglythrasnlysasplys

435440445

alaglupheileleuproasnglyglngluvalaspleuproileser

450455460

tyrleuthrservalserserleuilevaltrphisproalaasnpro

465470475480

alaglulysileileargvalleupheproglyasnserthrglntyr

485490495

asnileleugluglyleuglulysleulyshisleuasppheleulys

500505510

glnproleualathrglnlysaspleuthrglyglnvalprothrpro

515520525

valvallysglnthrlysleulysglnargalaaspserarggluser

530535540

leulysproalaalalysproleuproserlysservalarglysglu

545550555560

serlysglugluthrprogluvalthrlysvalasnhisvalglulys

565570575

proprolysvalgluserlysglulysvalmetvallyslysasplys

580585590

proilelysthrgluthrlysproservalthrglulysgluvalpro

595600605

serlysglugluproserprovallysalagluvalalaglulysgln

610615620

alathraspvallysprolysalaalalysglulysthrvallyslys

625630635640

gluthrlysvallysprogluasplyslysgluglulysglulyspro

645650655

lyslysgluvalalalyslysgluasplysthrproilelyslysglu

660665670

glulysprolyslysglugluvallyslysgluvallyslysgluile

675680685

lyslysgluglulyslysgluprolyslysgluvallyslysgluthr

690695700

proprolysgluvallyslysgluvallyslysgluglulyslysglu

705710715720

vallyslysgluglulysgluprolyslysgluilelyslysleupro

725730735

lysaspalalyslysserserthrproleuserglualalyslyspro

740745750

alaalaleulysprolysvalprolyslysglugluservallyslys

755760765

aspservalalaalaglylysprolysglulysglylysilelysval

770775780

ilelyslysgluglylysalaalaglualavalalaalaalavalgly

785790795800

thrglyalathrthralaalavalmetalaalaalaglyilealaala

805810815

ileglyproalalysgluleuglualagluargserleumetserser

820825830

progluaspleuthrlysasppheglugluleulysalaglugluval

835840845

aspvalthrlysaspilelysproglnleugluleuilegluaspglu

850855860

glulysleulysgluthrgluprovalglualatyrvalileglnlys

865870875880

gluarggluvalthrlysglyproalagluserproaspgluglyile

885890895

thrthrthrgluglygluglyglucysgluglnthrproglugluleu

900905910

gluprovalglulysglnglyvalaspaspileglulysphegluasp

915920925

gluglyalaglyphegluglusersergluthrglyasptyrgluglu

930935940

lysalagluthrgluglualaglugluproglugluaspglygluglu

945950955960

hisvalcysvalseralaserlyshisserprothrgluaspgluglu

965970975

seralalysalaglualaaspalatyrileargglulysarggluser

980985990

valalaserglyaspaspargalaglugluaspmetaspglualaile

99510001005

glulysglyglualagluglnserglugluglualaaspgluglu

101010151020

asplysalagluaspalaargglugluglutyrgluproglulys

102510301035

metglualagluasptyrvalmetalavalvalasplysalaala

104010451050

glualaglyglyalaglugluglntyrglypheleuthrthrpro

105510601065

thrlysglnleuglyalaglnserproglyarggluproalaser

107010751080

serilehisaspgluthrleuproglyglyserglusergluala

108510901095

thralaseraspglugluasnarggluaspglnproglugluphe

110011051110

thralathrserglytyrthrglnserthrilegluileserser

111511201125

gluprothrprometaspglumetserthrproargaspvalmet

113011351140

seraspgluthrasnasnglugluthrgluserproserglnglu

114511501155

phevalasnilethrlystyrgluserserleutyrserglnglu

116011651170

tyrserlysproalaaspvalthrproleuasnglypheserglu

117511801185

glyserlysthraspalathraspglylysasptyrasnalaser

119011951200

alaserthrileserproprosersermetglugluasplysphe

120512101215

serargseralaleuargaspalatyrcyssergluvallysala

122012251230

serthrthrleuaspilelysaspserileseralavalserser

123512401245

glulysvalserproserlysserproserleuserproserpro

125012551260

proserproleuglulysthrproleuglygluargservalasn

126512701275

pheserleuthrproasngluilelysvalseralaglualaglu

128012851290

valalaprovalserprogluvalthrglngluvalvalgluglu

129513001305

hiscysalaserprogluasplysthrleugluvalvalserpro

131013151320

serglnservalthrglyseralaglyhisthrprotyrtyrgln

132513301335

serprothraspglulysserserhisleuprothrgluvalile

134013451350

glulysproproalavalprovalserpheglupheseraspala

135513601365

lysaspgluasngluargalaservalserprometaspglupro

137013751380

valproaspsergluserproileglulysvalleuserproleu

138513901395

argserproproleuileglysergluseralatyrgluserphe

140014051410

leuseralaaspasplysalaserglyargglyalagluserpro

141514201425

phegluglulysserglylysglnglyserproaspglnvalser

143014351440

provalserglumetthrserthrserleutyrglnasplysgln

144514501455

gluglylysserthraspphealaproilelysgluaspphegly

146014651470

glnglulyslysthraspaspvalglualametserserglnpro

147514801485

alaleualaleuaspgluarglysleuglyaspvalserprothr

149014951500

glnileaspvalserglnpheglyserphelysgluaspthrlys

150515101515

metserilesergluglythrvalserasplysseralathrpro

152015251530

valaspgluglyvalalagluaspthrtyrserhismetglugly

153515401545

valalaservalserthralaservalalathrserserphepro

155015551560

gluprothrthraspaspvalserproserleuhisalagluval

156515701575

glyserprohisserthrgluvalaspaspserleuservalser

158015851590

valvalglnthrprothrthrpheglngluthrglumetserpro

159516001605

serlysgluglucysproargprometserileserproproasp

161016151620

pheserprolysthralalysserargthrprovalglnasphis

162516301635

argsergluglnsersermetserileglupheglyglngluser

164016451650

progluglnserleualametasppheserargglnserproasp

165516601665

hisprothrvalglyalaglyvalleuhisilethrgluasngly

167016751680

prothrgluvalasptyrserproseraspmetglnaspserser

168516901695

leuserhislysileproprometglugluprosertyrthrgln

170017051710

aspasnaspleusergluleuileservalserglnvalgluala

171517201725

serproserthrserseralahisthrproserglnilealaser

173017351740

proleuglngluaspthrleuseraspvalalaproproargasp

174517501755

metserleutyralaserleuthrserglulysvalglnserleu

176017651770

gluglyglulysleuserprolysseraspileserproleuthr

177517801785

proarggluserserproleutyrserprothrpheseraspser

179017951800

thrseralavallysglulysthralathrcyshisserserser

180518101815

serproproileaspalaalaseralagluprotyrglyphearg

182018251830

alaservalleupheaspthrmetglnhishisleualaleuasn

183518401845

argaspleuserthrproglyleuglulysaspserglyglylys

185018551860

thrproglyaspphesertyralatyrglnlysproglugluthr

186518701875

thrargserproaspglugluasptyrasptyrglusertyrglu

188018851890

lysthrthrargthrseraspvalglyglytyrtyrtyrglulys

189519001905

ilegluargthrthrlysserproseraspserglytyrsertyr

191019151920

gluthrileglylysthrthrlysthrprogluaspglyasptyr

192519301935

sertyrgluileileglulysthrthrargthrprogluglugly

194019451950

glytyrsertyraspileserglulysthrthrserproproglu

195519601965

valserglytyrsertyrglulysthrgluargserargargleu

197019751980

leuaspaspileserasnglytyraspaspsergluaspglygly

198519901995

histhrleuglyaspprosertyrsertyrgluthrthrglulys

200020052010

ilethrserpheproglusergluglytyrsertyrgluthrser

201520202025

thrlysthrthrargthrproaspthrserthrtyrcystyrglu

203020352040

thralaglulysilethrargthrproglnalaserthrtyrser

204520502055

tyrgluthrseraspleucystyrthralaglulyslysserpro

206020652070

serglualaargglnaspvalaspleucysleuvalsersercys

207520802085

glutyrlyshisprolysthrgluleuserproserpheileasn

209020952100

proasnproleuglutrpphealaserglugluprothrgluglu

210521102115

serglulysproleuthrglnserglyglyalapropropropro

212021252130

glyglylysglnglnglyargglncysaspgluthrproprothr

213521402145

servalsergluseralaproserglnthraspseraspvalpro

215021552160

progluthrgluglucysproserilethralaaspalaasnile

216521702175

aspsergluaspglusergluthrileprothrasplysthrval

218021852190

thrtyrlyshismetaspproproproalaprovalglnasparg

219522002205

serproserproarghisproaspvalsermetvalaspproglu

221022152220

alaleualailegluglnasnleuglylysalaleulyslysasp

222522302235

leulysglulysthrlysthrlyslysproglythrlysthrlys

224022452250

serserserprovallyslysseraspglylysserlysproleu

225522602265

alaalaserprolysproalaglyleulysgluserserasplys

227022752280

valserargvalalaserprolyslyslysgluservalglulys

228522902295

alaalalysprothrthrthrprogluvallysalaalaarggly

230023052310

gluglulysasplysgluthrlysasnalaalaasnalaserala

231523202325

serlysseralalysthralathralaglyproglythrthrlys

233023352340

thrthrlysserseralavalproproglyleuprovaltyrleu

234523502355

aspleucystyrileproasnhisserasnserlysasnvalasp

236023652370

valgluphephelysargvalargsersertyrtyrvalvalser

237523802385

glyasnaspproalaalaglugluproserargalavalleuasp

239023952400

alaleuleugluglylysalaglntrpglyserasnmetglnval

240524102415

thrleuileprothrhisaspsergluvalmetargglutrptyr

242024252430

glngluthrhisglulysglnglnaspleuasnilemetvalleu

243524402445

alaserserserthrvalvalmetglnaspgluserpheproala

245024552460

cyslysilegluleu

2465

<210>2

<211>2803

<212>prt

<213>智人

<400>2

metaspglyvalalaglupheserglutyrvalsergluthrvalasp

151015

valproserpropheaspleuleugluproprothrserglyglyphe

202530

leulysleuserlysprocyscystyrilepheproglyglyarggly

354045

aspseralaleuphealavalasnglypheasnileleuvalaspgly

505560

glyserasparglyssercysphetrplysleuvalarghisleuasp

65707580

argileaspservalleuleuthrhisileglyalaaspasnleupro

859095

glyileasnglyleuleuglnarglysvalalagluleuglugluglu

100105110

glnserglnglysersersertyrserasptrpvallysasnleuile

115120125

serprogluleuglyvalvalphepheasnvalproglulysleuarg

130135140

leuproaspalaserarglysalalysargserilegluglualacys

145150155160

leuthrleuglnhisleuasnargleuglyileglnalagluproleu

165170175

tyrargvalvalserasnthrilegluproleuthrleuphehislys

180185190

metglyvalglyargleuaspmettyrvalleuasnprovallysasp

195200205

serlysglumetglnpheleumetglnlystrpalaglyasnserlys

210215220

alalysthrglyilevalleuproasnglylysglualagluileser

225230235240

valprotyrleuthrserilethralaleuvalvaltrpleuproala

245250255

asnprothrglulysilevalargvalleupheproglyasnalapro

260265270

glnasnlysileleugluglyleuglulysleuarghisleuaspphe

275280285

leuargtyrprovalalathrglnlysaspleualaserglyalaval

290295300

prothrasnleulysproserlysilelysglnargalaaspserlys

305310315320

gluserleulysalathrthrlysthralavalserlysleualalys

325330335

argglugluvalvalglugluglyalalysglualaargsergluleu

340345350

alalysgluleualalysthrglulyslysalalysgluserserglu

355360365

lysproproglulysproalalysprogluargvallysthrgluser

370375380

serglualaleulysalaglulysarglysleuilelysasplysval

385390395400

glylyslyshisleulysglulysileserlysleugluglulyslys

405410415

asplysglulyslysgluilelyslysgluarglysgluleulyslys

420425430

aspgluglyarglysgluglulyslysaspalalyslysgluglulys

435440445

arglysaspthrlysprogluleulyslysileserlysproaspleu

450455460

lysprophethrprogluvalarglysthrleutyrlysalalysval

465470475480

proglyargvallysileaspargserargalaileargglyglulys

485490495

gluleusersergluproglnthrproproalaglnlysglythrval

500505510

proleuprothrileserglyhisarggluleuvalleuserserpro

515520525

gluaspleuthrglnaspphegluglumetlysargglugluargala

530535540

leuleualagluglnargaspthrglyleuglyasplysprophepro

545550555560

leuaspthralaglugluglyproproserthralaileglnglythr

565570575

proproservalproglyleuglyglnglugluhisvalmetlysglu

580585590

lysgluleuvalprogluvalproglugluglnglyserlysasparg

595600605

glyleuaspserglyalagluthrglugluglulysaspthrtrpglu

610615620

glulyslysglnargglualagluargleuproaspargthrgluala

625630635640

arggluglusergluprogluvallysgluaspvalileglulysala

645650655

gluleugluglumetglugluvalhisproseraspgluglugluglu

660665670

aspalathrlysalagluglyphetyrglnlyshismetglnglupro

675680685

leulysvalthrproargserargglualapheglyglyarggluleu

690695700

glyleuglnglylysalaproglulysgluthrserleupheleuser

705710715720

serleuthrthrproalaglyalathrgluhisvalsertyrilegln

725730735

aspgluthrileproglytyrsergluthrgluglnthrileserasp

740745750

glugluilehisaspgluproglugluargproalaproproargphe

755760765

histhrserthrtyraspleuproglyprogluglyalaglyprophe

770775780

glualaserglnproalaaspseralavalproalathrserglylys

785790795800

valtyrglythrprogluthrgluleuthrtyrprothrasnileval

805810815

alaalaproleualagluglugluhisvalserseralathrserile

820825830

thrglucysasplysleuserserphealathrservalalagluasp

835840845

glnservalalaserleuthralaproglnthrglugluthrglylys

850855860

serserleuleuleuaspthrvalthrserileproserserargthr

865870875880

glualathrglnglyleuasptyrvalproseralaglythrileser

885890895

prothrserserleuglugluasplysglyphelysserproprocys

900905910

gluasppheservalthrglygluserglulysargglygluileile

915920925

glylysglyleuserglygluargalavalgluglugluglugluglu

930935940

thralaasnvalglumetserglulysleucysserglntyrglythr

945950955960

provalpheseralaproglyhisalaleuhisproglygluproala

965970975

leuglyglualaglugluargcysleuserproaspaspserthrval

980985990

lysmetalaserproproproserglyproproseralathrhisthr

99510001005

prophehisglnserprovalgluglulyssergluproglnasp

101010151020

pheglnglualaaspsertrpglyaspthrlysargthrprogly

102510301035

valglylysgluaspalaalaglugluthrvallysproglypro

104010451050

glugluglythrleuglulysgluglulysvalproproproarg

105510601065

serproglnalaglnglualaprovalasnileaspgluglyleu

107010751080

thrglycysthrileglnleuleuproalaglnasplysalaile

108510901095

valphegluilemetglualaglygluprothrglyproileleu

110011051110

glyalaglualaleuproglyglyleuargthrleuproglnglu

111511201125

proglylysproglnlysaspgluvalleuargtyrproasparg

113011351140

serleuserprogluaspalagluserleuservalleuserval

114511501155

proserproaspthralaasnglngluprothrprolysserpro

116011651170

cysglyleuthrgluglntyrleuhislysaspargtrpproglu

117511801185

valserprogluaspthrglnserleuserleuserglugluser

119011951200

proserlysgluthrserleuaspvalserserlysglnleuser

120512101215

progluserleuglythrleuglnpheglygluleuasnleugly

122012251230

lysgluglumetglyhisleumetglnalagluaspthrserhis

123512401245

histhralaprometservalprogluprohisalaalathrala

125012551260

serproprothraspglythrthrargtyrseralaglnthrasp

126512701275

ilethraspaspserleuasparglysserproalaserserphe

128012851290

serhisserthrproserglyasnglylystyrleuproglyala

129513001305

ilethrserproaspgluhisileleuthrproaspserserphe

131013151320

serlysserprogluserleuproglyproalaleugluaspile

132513301335

alailelystrpgluasplysvalproglyleulysaspargthr

134013451350

sergluglnlyslysgluprogluprolysaspgluvalleugln

135513601365

glnlysasplysthrleugluhislysgluvalvalgluprolys

137013751380

aspthralailetyrglnlysaspglualaleuhisvallysasn

138513901395

glualavallysglnglnasplysalaleugluglnlysglyarg

140014051410

aspleugluglnlysaspthralaleugluglnlysasplysala

141514201425

leugluprolysasplysaspleugluglulysasplysalaleu

143014351440

gluglnlysasplysileprogluglulysasplysalaleuglu

144514501455

glnlysaspthralaleugluglnlysasplysalaleuglupro

146014651470

lysasplysaspleugluglnlysaspargvalleugluglnlys

147514801485

glulysileprogluglulysasplysalaleuaspglnlysval

149014951500

argservalgluhislysalaprogluaspthrvalalaglumet

150515101515

lysaspargaspleugluglnthrasplysalaprogluglnlys

152015251530

hisglnalaglngluglnlysasplysvalserglulyslysasp

153515401545

glnalaleugluglnlystyrtrpalaleuglyglnlysaspglu

155015551560

alaleugluglnasnileglnalaleuglugluasnhisglnthr

156515701575

glngluglngluserleuvalglngluasplysthrarglyspro

158015851590

lysmetleugluglulysserproglulysvallysalametglu

159516001605

glulysleuglualaleuleuglulysthrlysalaleuglyleu

161016151620

glugluserleuvalglngluglyargalaarggluglngluglu

162516301635

lystyrtrpargglyglnaspvalvalglnglutrpglngluthr

164016451650

serprothrargglugluproalaglygluglnlysgluleuala

165516601665

proalatrpgluaspthrserprogluglnaspasnargtyrtrp

167016751680

argglyarggluaspvalalaleugluglnaspthrtyrtrparg

168516901695

gluleusercysgluarglysvaltrppheprohisgluleuasp

170017051710

glyglnglyalaargprohistyrthrglugluarggluserthr

171517201725

pheleuaspgluglyproaspaspgluglngluvalproleuarg

173017351740

gluhisalathrargserprotrpalaseraspphelysaspphe

174517501755

glngluserserproglnlysglyleugluvalgluargtrpleu

176017651770

alagluserprovalglyleuproprogluglugluasplysleu

177517801785

thrargserprophegluileileserproproalaserpropro

179017951800

glumetvalglyglnargvalproseralaproglyglngluser

180518101815

proileproaspprolysleumetprohismetlysasnglupro

182018251830

thrthrprosertrpleualaaspileproprotrpvalprolys

183518401845

aspargproleuproproalaproleuserproalaproglypro

185018551860

prothrproalaprogluserhisthrproalaprophesertrp

186518701875

glythralaglutyraspservalvalalaalavalglnglugly

188018851890

alaalagluleugluglyglyprotyrserproleuglylysasp

189519001905

tyrarglysalagluglygluarggluglugluglyargalaglu

191019151920

alaproasplysserserhisserserlysvalproglualaser

192519301935

lysserhisalathrthrgluprogluglnthrgluproglugln

194019451950

arggluprothrprotyrproaspgluargserpheglntyrala

195519601965

aspiletyrgluglnmetmetleuthrglyleuglyproalacys

197019751980

prothrarggluproproleuglyalaalaglyasptrppropro

198519901995

cysleuserthrlysglualaalaalaglyargasnthrserala

200020052010

glulysgluleuserserproileserprolysserleuglnser

201520202025

aspthrprothrphesertyralaalaleualaglyprothrval

203020352040

proproargprogluproglyprosermetgluproserleuthr

204520502055

proproalavalproproargalaproileleuserlysglypro

206020652070

serproproleuasnglyasnileleusercysserproasparg

207520802085

argserproserprolysgluserglyargserhistrpaspasp

209020952100

serthrseraspsergluleuglulysglyalaarggluglnpro

210521102115

glulysglualaglnserproserproprohisproilepromet

212021252130

glyserprothrleutrpprogluthrglualahisvalserpro

213521402145

proleuaspserhisleuglyproalaargproserleuaspphe

215021552160

proalaseralapheglypheserserleuglnproalapropro

216521702175

glnleuproserproalagluproargseralaprocysglyser

218021852190

leualapheserglyaspargalaleualaleualaproglypro

219522002205

prothrargthrarghisaspglutyrleugluvalthrlysala

221022152220

proserleuaspserserleuproglnleuproserproserser

222522302235

proglyalaproleuleuserasnleuproargproalaserpro

224022452250

alaleusergluglyserserserglualathrthrprovalile

225522602265

serservalalagluargpheserproserleuglualaalaglu

227022752280

glngluserglygluleuaspproglymetgluproalaalahis

228522902295

serleutrpaspleuthrproleuserproalaproproalaser

230023052310

leuaspleualaleualaproalaproserleuproglyaspmet

231523202325

glyaspglyileleuprocyshisleuglucysserglualaala

233023352340

thrglulysproserpropheglnvalprosergluaspcysala

234523502355

alaasnglyprothrgluthrserproasnproproglyproala

236023652370

proalalysalagluasngluglualaalaalacysproalatrp

237523802385

gluargglyalatrpprogluglyalagluargserserargpro

239023952400

aspthrleuleuserprogluglnprovalcysproalaglygly

240524102415

serglyglyproproserseralaserprogluvalglualagly

242024252430

proglnglycysalathrgluproargprohisargglygluleu

243524402445

serproserpheleuasnproproleuproproserileaspasp

245024552460

argaspleuserthrglugluvalargleuvalglyargglygly

246524702475

argargargvalglyglyproglythrthrglyglyprocyspro

248024852490

valthraspgluthrproprothrseralaseraspserglyser

249525002505

serglnseraspseraspvalproprogluthrgluglucyspro

251025152520

serilethralaglualaalaleuaspseraspgluaspglyasp

252525302535

pheleuprovalasplysalaglyglyvalserglythrhishis

254025452550

proargproglyhisaspproproproleuproglnproasppro

255525602565

argproserproproargproaspvalcysmetalaaspproglu

257025752580

glyleusersergluserglyargvalgluargleuargglulys

258525902595

glulysvalglnglyargvalglyargargalaproglylysala

260026052610

lysproalaserproalaargargleuaspleuargglylysarg

261526202625

serprothrproglylysglyproalaaspargalaserargala

263026352640

proproargproargserthrthrserglnvalthrproalaglu

264526502655

glulysaspglyhisserprometserlysglyleuvalasngly

266026652670

leulysalaglyprometalaleuserserlysglysersergly

267526802685

alaprovaltyrvalaspleualatyrileproasnhiscysser

269026952700

glylysthralaaspleuaspphepheargargvalargalaser

270527102715

tyrtyrvalvalserglyasnaspproalaasnglygluproser

272027252730

argalavalleuaspalaleuleugluglylysalaglntrpgly

273527402745

gluasnleuglnvalthrleuileprothrhisaspthrgluval

275027552760

thrargglutrptyrglnglnthrhisgluglnglnglnglnleu

276527702775

asnvalleuvalleualaserserserthrvalvalmetglnasp

278027852790

gluserpheproalacyslysilegluphe

27952800