用于核酸测序的系统和方法与流程
本申请要求于2016年7月20日提交的美国临时专利申请号62/364,489、于2016年8月15日提交的美国临时专利申请号62/375,197、于2016年11月4日提交的美国临时专利申请号62/418,101以及于2017年1月10日提交的美国临时专利申请号62/444,700的权益，其各自通过引用整体并入本文。
背景技术：
人类基因组已经引起了对快速核酸分析技术的兴趣，包括适用于小规模和大规模应用的核酸测序。目前可用的核酸测序技术包括荧光核苷酸的检测；聚合酶活性质子副产物的检测；以及(iii)通过纳米孔对电流的检测。在测序的背景下，重要的考虑因素包括准确性、速度、读取长度、成本、仪器大小和复杂性，以及产生测序信息所需的核酸模板的量。遗憾的是，由于现有测序技术的缺陷，大规模基因组计划通常仍然过于昂贵和/或不可行。现有的测序技术(如上面提到的那些)通常有样品制备、准确性和/或可扩展性问题，这些问题对其主流实施提出了重大挑战。
技术实现要素：
本文认识到对感测包括核酸测序反应在内的生物反应的改进的系统和方法的需要。本文提供的系统和方法可用于对与珠子相关的核酸或与聚合物膜相关的核酸进行测序。在一些情况下，衍生自测序反应的信号在缓冲液的组成和浓度下被检测，这由于珠子相对于检测这些信号的一个或多个传感器的移动而降低了系统灵敏度。
本公开内容提供了用于样品分析或鉴别如核酸测序的方法和系统。本公开内容提供了可在不使用颗粒(如珠子)的情况下实现样品制备和鉴别(例如，测序)的方法和系统。与其他系统和方法相比，这可使样品能够以显著降低的成本和复杂性来进行制备和鉴别。
本公开内容还提供了用于改进核酸分析的系统和方法，其克服了现有的缺陷并允许低成本、可扩展的核酸测序技术。随着对人类疾病遗传基础的了解增加，针对临床应用的准确、可负担且可扩展的准确核酸分析工具的需求将不断增加。本公开内容提供了利用使用电子传感器可检测的氧化还原介体部分进行核酸测序的系统和方法。
在一方面，本公开内容提供了用于对核酸模板进行测序的方法，该方法包括：(a)使核酸模板与含有核苷酸群体的感测流体接触，其中所述核酸模板与偶联到珠子的引物杂交，该珠子被定位成接近于传感器阵列中的传感器，其中所述传感器包含至少两个电极，并且其中所述感测流体具有体电导率并且所述珠子的表面具有表面电导率，以提供小于约1的杜坎数(dukhinnumber)；(b)在将所述核苷酸群体的至少一个核苷酸掺入生长的核酸链中时，使用所述传感器检测所述珠子的德拜层内的电导率变化，该生长的核酸链衍生自所述引物且与所述核酸模板互补；(c)洗涤所述传感器阵列，以从所述传感器阵列去除所述核苷酸群体的未掺入核苷酸；以及(d)重复(a)-(c)以获得所述核酸模板的序列信息。
在一些实施方案中，所述至少两个电极的给定电极暴露于所述感测流体。在一些实施方案中，(b)进一步包括在所述至少一个核苷酸掺入时检测所述珠子的德拜层内的阻抗变化。在一些实施方案中，在稳态下检测所述德拜层内的阻抗变化。在一些实施方案中，所述至少两个电极定位在所述珠子的德拜层内。在一些实施方案中，所述感测流体具有约0.15毫摩尔至约6毫摩尔的溶质浓度。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在(b)之前：(i)使所述传感器阵列与探测流体接触，其中所述探测流体具有比与所述珠子的表面相关的电导率大至少约50倍或小至少约50倍的体电导率；以及(ii)使用传感器检测指示接近于所述传感器的所述珠子的存在的信号。在一些实施方案中，由所述探测流体的体电导率和所述珠子的表面的电导率确定的杜坎数远小于1。在一些实施方案中，由所述探测流体的体电导率和所述珠子的表面的电导率确定的杜坎数远大于1。在一些实施方案中，(b)、(c)和(d)仅在观察到指示珠子占据的信号的所述传感器阵列的传感器处进行。
在一方面，本公开内容提供了用于确定传感器阵列位点处的珠子占据的方法，该方法包括：(a)使传感器阵列与多个珠子接触，其中所述传感器阵列包含多个各自具有至少两个电极的传感器，以在接近于所述多个传感器中的单个传感器的给定位置处提供所述多个珠子中的给定珠子；(b)使所述传感器阵列与探测流体接触，所述探测流体具有比与所述给定珠子的表面相关的电导率大至少约50倍或小至少约50倍的体电导率；(c)使用所述单个传感器检测指示接近于所述传感器的所述给定珠子的存在的信号；以及(d)将所述传感器阵列的给定位置鉴定为被所述给定珠子占据。
在一些实施方案中，所述探测流体具有约0.01毫摩尔至约1摩尔的溶质浓度。在一些实施方案中，由所述探测流体的体电导率和所述珠子的表面的电导率确定的杜坎数远小于1。在一些实施方案中，由所述探测流体的体电导率和所述珠子的表面的电导率确定的杜坎数远大于1。在一些实施方案中，所述方法进一步包括偶联到所述给定珠子的核酸。在一些实施方案中，所述信号包括电流。在一些实施方案中，所述单个传感器的给定电极定位在所述给定珠子的德拜层内。
在一方面，本公开内容提供了用于处理核酸样品的方法，该方法包括：(a)提供包含第一组液滴和第二组液滴的混合物，其中所述第一组液滴的第一液滴包含(i)珠子，(ii)重组酶，(iii)聚合酶，和(iv)来自所述核酸样品的核酸分子，并且其中所述第二组液滴的第二液滴包含增加所述重组酶处理所述核酸分子的速率以允许所述引物与所述核酸分子杂交从而在聚合酶存在的情况下进行引物延伸反应的活化剂，从而由所述核酸分子生成扩增产物；(b)将所述混合物中的所述第一液滴与所述第二液滴合并，以产生作为第三组液滴的一部分的第三液滴，其中所述第三液滴包含偶联所述核酸分子、重组酶、引物和聚合酶的所述珠子；以及(c)进行所述引物延伸反应，以从所述第三液滴中的核酸分子生成所述扩增产物。
在一些实施方案中，所述第一液滴进一步包含缓冲液、盐、拥挤试剂(crowdingagent)、dntp、引物或其任何组合。在一些实施方案中，所述第二液滴进一步包含引物、dntp、atp、重组酶加载酶、单链dna结合蛋白、atp再生单元、缓冲液、盐和拥挤试剂。在一些实施方案中，所述活化剂是镁盐。在一些实施方案中，所述第三液滴的形成包括使混合物进行低速搅拌或摇动。在一些实施方案中，所述引物延伸反应在等温条件下发生。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括引导所述第三组液滴通过障碍物组，以控制所述第三组液滴中的每个液滴的形状或大小。在一些实施方案中，所述障碍物组具有梳状结构。在一些实施方案中，所述第三组液滴中的每个液滴的形状或大小由流速、压力、障碍物形状和障碍物大小来控制。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括用包含乳液破坏剂和失活剂的破坏混合物破坏所述第三组液滴，其中破坏所述第三组液滴形成均匀溶液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用捕获珠子捕获多个偶联到扩增产物的珠子，以形成多珠子复合物。在一些实施方案中，所述捕获珠子仅与偶联到扩增产物的珠子结合。在一些实施方案中，所述多珠子复合物明显大于非复合珠子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括引导珠子通过障碍物组，以通过大小选择分离所述多珠子复合物与所述非复合珠子。
在一方面，本公开内容提供了用于对核酸分子进行测序的方法，该方法包括：(a)激活传感器，所述传感器包含含有至少两个电极的支撑物和邻近于所述支撑物的聚合物材料，其中所述至少两个电极暴露于包含所述聚合物材料的溶液中，其中所述聚合物材料在测序反应期间保持所述核酸分子；(b)使所述核酸分子进行测序反应，以产生指示所述核酸分子的单个碱基的信号；(c)在所述测序反应期间，使用所述传感器的至少两个电极检测所述信号；以及(d)使用(c)中检测到的所述信号生成所述核酸分子的序列。
在一些实施方案中，所述至少两个电极包含化学惰性导电材料。在一些实施方案中，所述支撑物包含表面改性的氧化硅或金属氧化物。在一些实施方案中，所述聚合物材料与所述表面改性的氧化硅或金属氧化物偶联。在一些实施方案中，所述聚合物材料桥接或覆盖所述至少两个电极。
在一些实施方案中，所述聚合物材料是水凝胶。在一些实施方案中，所述水凝胶包含反应性和非反应性共聚单体。在一些实施方案中，所述聚合物材料是多孔聚合物整料。在一些实施方案中，所述多孔聚合物整料是包含反应性官能团的均聚物、共聚物或三元共聚物。
在一些实施方案中，所述聚合物材料接种有引物，并且其中所述引物与所述聚合物材料反应性偶联。在一些实施方案中，所述引物参与扩增反应以形成克隆集落。在一些实施方案中，所述引物以1皮摩尔至4000皮摩尔范围内的浓度接种。在一些实施方案中，所述扩增反应是侵入性扩增、桥式扩增、野火扩增(wildfireamplification)、重组酶聚合酶扩增或采用限制方法的聚合酶链反应。
在一些实施方案中，在所述测序反应期间，所述至少两个电极与具有所述核酸分子的德拜层偶联。在一些实施方案中，所述核苷酸掺入核酸分子在所述德拜层内进行。在一些实施方案中，指示所述单个碱基的所述信号是电化学信号。在一些实施方案中，指示所述单个碱基的所述信号是阻抗信号。在一些实施方案中，指示所述单个碱基的所述信号在稳态条件期间检测。
在一方面，本公开内容提供了用于对核酸分子进行测序的系统，该系统包含：传感器，其包含含有至少两个电极的支撑物和邻近于所述支撑物的聚合物材料，其中在使用期间，所述至少两个电极暴露于包含所述聚合物材料的溶液，其中所述聚合物材料在测序反应期间保持所述核酸分子，该测序反应产生指示所述核酸分子的单个碱基的信号；以及可操作地耦合到所述传感器的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被编程为(i)使所述核酸分子进行测序反应，以产生指示所述核酸分子的单个碱基的信号；(ii)在所述测序反应期间，使用所述传感器的至少两个电极检测所述信号；以及(iii)使用(ii)中检测到的所述信号生成所述核酸分子的序列。
在一些实施方案中，所述至少两个电极包含化学惰性导电材料。在一些实施方案中，所述支撑物包含表面改性的氧化硅或金属氧化物。在一些实施方案中，所述聚合物材料与所述表面改性的氧化硅或金属氧化物偶联。在一些实施方案中，所述聚合物材料桥接或覆盖所述至少两个电极。
在一些实施方案中，所述聚合物材料是水凝胶。在一些实施方案中，所述水凝胶包含反应性和非反应性共聚单体。在一些实施方案中，所述聚合物材料是多孔聚合物整料。在一些实施方案中，所述多孔聚合物整料是包含反应性官能团的均聚物、共聚物或三元共聚物。
在一些实施方案中，所述聚合物材料接种有引物，并且所述引物与所述聚合物材料反应性偶联。在一些实施方案中，所述引物参与扩增反应以形成克隆集落。在一些实施方案中，所述引物以约1皮摩尔至约4000皮摩尔范围内的浓度接种。在一些实施方案中，所述扩增反应是侵入性扩增、桥式扩增、野火扩增、重组酶聚合酶扩增或采用限制方法的聚合酶链反应。
在一些实施方案中，在测序反应期间，所述至少两个电极与所述核酸分子的德拜层偶联。在一些实施方案中，所述核苷酸掺入所述核酸分子在所述德拜层内进行。在一些实施方案中，指示所述单个碱基的所述信号是电化学信号。在一些实施方案中，指示所述单个碱基的所述信号是阻抗信号。在一些实施方案中，指示所述单个碱基的所述信号在稳态条件期间检测。
在一方面，本公开内容提供了用于对核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：(a)将模板核酸分子栓系到传感器或接近所述传感器的表面；(b)产生栓系到所述传感器或接近所述传感器的表面的伸长复合物，其中所述伸长复合物包含(i)与所述模板核酸分子相关的核酸聚合酶和(ii)与所述模板核酸分子杂交的寡核苷酸；(c)在足以使与模板核酸分子互补的核苷酸与所述伸长复合物相关联的条件下，使所述伸长复合物与包含核苷酸的溶液接触，其中所述核苷酸的给定核苷酸与氧化还原介体部分进行偶联；(d)当所述核苷酸与所述伸长复合物相关联时，使用所述传感器检测指示所述氧化还原介体部分的信号；(e)将所述核苷酸掺入所述寡核苷酸中，以使所述氧化还原介体部分从所述核苷酸释放；以及(f)重复(c)-(e)，从而对所述模板核酸分子进行测序。
在一些实施方案中，多个克隆模板核酸分子栓系到所述传感器或接近所述传感器的表面。在一些实施方案中，所述多个克隆模板核酸分子借助于聚合酶步移(walking)产生。在一些实施方案中，所述伸长复合物通过所述聚合酶栓系到所述传感器或接近所述传感器的表面。在一些实施方案中，在(c)的每次迭代中，所述溶液仅包含核苷酸腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、尿嘧啶(u)或胸腺嘧啶(t)或其变体中的一种，并且(c)的每次迭代使所述伸长复合物与不同的核苷酸接触。
在一些实施方案中，所述氧化还原介体部分包括有机化合物、有机金属化合物、纳米颗粒或金属。在一些实施方案中，多个氧化还原介体部分与所述核苷酸结合。在一些实施方案中，所述伸长复合物通过结合对栓系到所述传感器或接近所述传感器的表面。在一些实施方案中，所述结合对是生物素-链霉亲和素结合对。在一些实施方案中，所述氧化还原介体部分与核苷酸的磷酸连接。在一些实施方案中，所述核苷酸在约10至约500毫秒(ms)的时间段内与所述伸长复合物相关联。在一些实施方案中，所述传感器在多个传感器中，并且其中所述多个传感器中的给定传感器是可单独寻址的。
从其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案的以下详细描述中，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。将会理解，本公开内容能够具有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和描述将被视为本质上是说明性的而不是限制性的。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入于此，其程度如同具体地和个别地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的具体描述和附图(本文也称为“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解；在附图中：
图1示意性地描绘了示例集成式测序平台；
图2a-图2f示出了示例传感器阵列和传感器使用；图2a示出了示例传感器阵列的示意图；图2b示出了具有携带核酸的珠子的示例传感器阵列的示意图，其中珠子被固定至传感器阵列；图2c示出了具有珠子的示例传感器阵列的示意图，其中珠子携带核酸并被固定至传感器阵列从而与适用于核酸扩增的试剂接触；图2d示出了示例传感器阵列的示意图，其中核酸扩增发生在定位于传感器阵列的各个传感器处的珠子上；图2e示出了从示例传感器阵列去除试剂的示意图；图2f示出了示例传感器阵列的示意图，其中核酸在传感器阵列的各个位置处被测序；
图3示出了示例检测装置；
图4示出了示例计算机系统，其被编程或以其他方式配置用于控制、调节或实现本文所述的装置、系统和方法；
图5示意性地描绘了示例珠子传感器结构配置
图6示意性地描绘了珠子表面处和与珠子表面邻近的体相流体中的电导性的示例；
图7图示描绘了缓冲液浓度对与传感器相关的珠子运动所观察到的电流灵敏度的影响的示例；
图8图示描绘了示例传感器阵列上的珠子占据的示例；
图9图示描绘了与示例传感器阵列上的珠子占据有关的示例数据；
图10示意性地描绘了处理核酸样品的方法；
图11a-图11f示意性地描绘了基于障碍物的乳化及其阵列。图11a示出了流向障碍物的液滴；图11b示出了由于剪切力在物体周围变形的液滴；图11c示出了液滴在障碍物周围的分裂；图11d示出障碍物可具有任意形状；图11e示出障碍物可限制在流动池中；并且图11f示出了障碍物的阵列；
图12a-图12e示意性地描绘了将障碍物阵列集成到微流体射流装置中以供乳液生成；图12a示出了微流体通道内的障碍物阵列；图12b示出了阵列的复用；图12c示出了芯片上扩增的示例；图12d示出了使用膜阀和泵移动液体；图12e示出了膜泵的封闭图；
图13示意性地描绘了乳液分两步的破乳和失活；
图14a-图14d示意性地描绘了基于障碍物的珠子分选；图14a示出了表现为扩增的未扩增珠子；图14b示出了通过使用障碍物对于扩增珠子与未扩增珠子的分离；图14c示出了分离方法的不同实现；图14d示出了分离方法的进一步实现；
图15示意性地描绘了将富集模块集成到微流体射流装置中；
图16a-图16d示意性地描绘了使用障碍物阵列的乳化。图16a示出了障碍物阵列；图16b示出了另一个障碍物阵列；图16c示出了在流体被引导通过障碍物阵列之前的原始乳液；图16d示出了流体被引导通过阵列后的乳液；
图17示意性地描绘了珠子核酸测序和无珠子核酸测序的系统；
图18示意性地描绘了溶液中线性聚合物链的热力学运动；
图19示意性地描绘了与固体支持物和引物偶联的缠结聚合物网络；
图20示意性地描绘了苯硫醇化(benzthiolated)引物与溴乙酰胺丙基丙烯酰胺(brapa)之间的反应；
图21a-图21d示意性地描绘了多孔聚合物整料(ppm)薄膜的制备；图21a示出了待改性的支撑物表面；图21b示出了可聚合硅烷基团的表面改性；图21c示出了聚合前的体系；图21d示出了聚合后的体系；
图22示意性地描绘了ppm薄膜制备的聚合化学；
图23示意性地描绘了用缀合至ppm薄膜的引物进行的杂交-去杂交(hyb-dehyb)测定；
图24示意性地描绘了用于制备引物缀合的聚合物涂覆的支撑物以及引物密度可视化的程序；
图25示意性地描绘了有和无硅烷活化的引物缀合支撑物的引物密度；
图26a-图26c示意性地描绘了关于聚合物涂覆支撑物的固定化引物布置和在扩增反应中建立限制的方法；图26a示意性地描绘了引物向聚合物涂覆的支撑物的固定；图26b示意性地描绘了表面限制扩增方法；图26c示出了根据起始模板浓度的扩增后模板密度；
图27示出了扩增反应前后引物密度的可视化；
图28示出了支撑物表面扩增模板的引物延伸和核酸掺入的电子检测；
图29示出了在测序实验期间fam标记的引物延伸的毛细管电泳读出；
图30a和图30b示出了引物密度的可视化和核酸掺入支撑物表面上的电子检测；图30a示出了扩增反应前后引物密度的可视化；图30b示出了累积核酸掺入的可视化和核酸掺入的电子检测；
图31a和图31b示出了用碱性溶液冲洗前后缀合至聚合物涂覆的支撑物偶联的引物密度；图31a示出了用碱性溶液冲洗前的引物密度；图31b示出了用碱性溶液冲洗后的引物密度；
图32示出了用于将引物缀合至ppm薄膜的薄层池；
图33示出了缀合至ppm薄膜的引物低聚物表面的检测；
图34a和图34b示出了示例克隆扩增方法；图34a示意性地描绘了用于产生核酸分子的克隆集落的示例方法；图34b示意性地描绘了核酸集落存在于其上的示例表面；以及
图35示意性地描绘了用于使用氧化还原介体对核酸分子进行测序的示例方法。
具体实施方式
尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用对本文所述的本发明实施方案的各种替代。
如本文所用的术语“邻近于”一般是指紧邻于、接近于或者在感测或电子范围(或距离)内的。例如，邻近于第二物体的第一物体可与第二物体接触，或者可以不与第二物体接触但可以接近该第二物体。邻近于另一个物体的物体可具有一个或多个中间物体(例如，层)。在一些示例中，邻近于第二物体的第一物体处于第二物体的约0微米(μm)、0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm或100μm内。
如本文所用，术语“扩增”和“核酸扩增”可互换使用，通常是指产生核酸的一个或多个拷贝或“扩增产物”或“扩增子”。核酸的扩增可以是线性的、指数的或其组合。核酸扩增方法的非限制性示例包括逆转录、引物延伸、聚合酶链反应、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增、重组酶聚合酶扩增(rpa)和多重置换扩增(mda)。在一些实施方案中，扩增产物可以是dna。在靶rna扩增的情况下，可通过rna的逆转录获得dna，随后dna的扩增可用于产生扩增的dna产物。在dna扩增的情况下，可使用dna扩增。dna扩增方法的非限制性示例包括聚合酶链反应(pcr)、pcr的变体(例如，实时pcr、等位基因特异性pcr、装配pcr、不对称pcr、数字pcr、乳液pcr、拨出pcr、解旋酶依赖性pcr、巢式pcr、热启动pcr、反向pcr、甲基化特异性pcr、微引物pcr、多重pcr、巢式pcr、重叠延伸pcr、热不对称交错pcr、降落pcr)和连接酶链反应(lcr)。在一些情况下，核酸扩增取决于热循环条件。在其他情况下，核酸扩增是等温的。
如本文所用的术语“珠子”通常是指适合于与核酸或其他生物分子结合的任何类型的颗粒。珠子可具有规则形状，包括球形和非球形形状，以及1:1的长宽比和非1:1的长宽比。在一些情况下，珠子具有规则形状(例如，球形珠子)或可具有不规则形状(例如，包含多个磁性材料区域的球状珠子)。珠子可包含任何类型的合适材料，其非限制性示例包括金属、陶瓷、磁性材料、聚合物及其组合。在一些情况下，珠子是磁性的，并且通过施加到珠子上的磁力可进行操纵/固定。珠子的非限制性示例包括纳米珠(例如，纳米棒、纳米球、纳米壳、纳米管、核酸纳米球等)、微珠(例如，微球、微珠等)、量子点、细胞、聚合物支架及其组合。
术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”在本文可互换使用，并且通常是指包含一个或多个核酸亚单位或核苷酸的分子。核酸可包含选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的一个或多个核苷酸。核苷酸通常包含核苷以及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸(po3)基团。核苷酸可包含核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中糖为脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可为核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸可为脱氧核糖核苷多磷酸，例如，脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，其可选自脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、尿苷三磷酸(dutp)和脱氧胸苷三磷酸(dttp)，其包含可检测标签，如发光标签或标记物(例如，荧光团)。核苷酸可包含可掺入正在生长的核酸链中的任何亚单位。这样的亚单位可为a、c、g、t或u，或者对一种或多种互补a、c、g、t或u具有特异性，或与嘌呤(即，a或g或其变体)或嘧啶(即，c、t或u或其变体)互补的任何其他亚单位。在一些示例中，核酸为脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或其的衍生物或变体。核酸可以是单链或双链的。在一些情况下，核酸分子是环状的。此外，核酸可具有任何合适的长度，如至少约100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb或50kb的长度。
核酸可包含一种或多种非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。这样的核苷酸的示例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基辫苷、肌苷、n6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-d46-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤、氨基烯丙基-dutp(aa-dutp)和氨基己基丙烯酰胺-dctp(aha-dctp)。核酸还可在碱基部分(例如，在通常可与互补核苷酸形成氢键的一个或多原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。
术语“核酸测序”和“测序”可互换使用，通常是指核酸的核苷酸序列的确定。在一些情况下，确定核酸的整个核苷酸序列。在其他情况下，仅确定核酸的核苷酸序列的一部分。核酸测序可以以任何合适的方式进行，包括通过合成测序。在合成测序中，核苷酸通常通过酶如聚合酶的作用，依次掺入与待测序的模板核酸杂交的引物(例如，生长的核酸链)中。在掺入每个核苷酸期间和/或之后，可检测指示掺入的信号。当这些信号与特定类型的核苷酸(例如，具有a、t、c、g或u碱基的核苷酸)相关时，信号可用于确定掺入的特定核苷酸，并因此通过碱基配对规则确定待测序模板核酸的互补核苷酸。重复核苷酸掺入和检测的过程，直至确定核酸序列。
如本文所用的术语“聚合酶”通常是指能够催化聚合反应的任何酶。聚合酶可以是天然存在的或可以是合成的。在一些情况下，聚合酶是核酸聚合酶，其能够促进核苷酸向与模板核酸杂交的引物(例如，生长的核酸链)的顺序掺入。核酸聚合酶的示例包括dna聚合酶、rna聚合酶、热稳定聚合酶、野生型聚合酶、修饰的聚合酶、大肠杆菌(e.coli)dna聚合酶i、t7dna聚合酶、噬菌体t4dna聚合酶φ29(phi29)dna聚合酶、taq聚合酶、tth聚合酶、tli聚合酶、pfu聚合酶、pwo聚合酶、vent聚合酶、deepvent聚合酶、ex-taq聚合酶、la-taq聚合酶、sso聚合酶、poc聚合酶、pab聚合酶、mth聚合酶、es4聚合酶、tru聚合酶、tac聚合酶、tne聚合酶、tma聚合酶、tca聚合酶、tih聚合酶、tfi聚合酶、platinumtaq聚合酶、tbr聚合酶、tfl聚合酶、tth聚合酶、pfutubo聚合酶、pyrobest聚合酶、pwo聚合酶、kod聚合酶、bst聚合酶、sac聚合酶、klenow片段、具有3'至5'外切核酸酶活性的聚合酶，及其变体、修饰产物和衍生物。在一些实施方案中，聚合酶为单亚基聚合酶。此外，聚合酶可具有相对较高的持续性，即，聚合酶持续将核苷酸掺入引物而不释放引物与其杂交的核酸模板的能力。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指用作核酸分子的单体或亚单位的有机分子，如脱氧核糖核酸(dna)分子或核糖核酸(rna)分子。在一些实施方案中，核苷酸还可以是肽核酸(pna)核苷酸或锁核酸(lna)核苷酸。
如本文所用，术语“引物”通常是指用作核酸合成如聚合酶链反应(pcr)的起始点的核酸链。在一个示例中，在dna样品的复制期间，催化复制的酶在引物与dna样品连接的3'端开始复制，并复制相对的链。
如本文所用，术语“克隆”通常是指至少一些、基本上全部或全部传感器区域的群体具有相同的核酸序列。可能有两个与单个样品核酸片段相关的群体，可用于“配对”、“配对端”或其他类似的方法；该群体可在传感器区域内以大致相似的数量存在，并且可在传感器区域上随机分布。
如本文所用，术语“限制”通常是指在一个传感器区域中产生的物质、部分或分子(如dna)，其与相同或基本相同的传感器区域保持相关连，以保持或基本上保持传感器区域的克隆性质。
如本文所用，术语“样品”通常是指生物样品。生物样品的示例包括核酸分子、氨基酸、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪或病毒。在一个示例中，生物样品是包含一个或多个核酸分子的核酸样品。
如本文所用，术语“试剂”通常是指一种或多种可用于使用样品制备或分析的物质。样品制备可包括样品处理。样品制备的示例是核酸扩增反应，如聚合酶链反应(pcr)。用于与核酸扩增反应一起使用的试剂的示例包括一种或多种引物和聚合酶，以及辅因子(例如，镁或锰)。在一些情况下，核酸扩增不是pcr反应。
如本文所用，术语“表面改性的”或“表面改性”通常是指其中化学或物理(例如，电子)特征已经变化或改变的表面。化学表面改性可包括用酸、碱或臭氧处理表面。化学改性的表面可与反应性接头偶联。反应性接头可包括但不限于硅烷偶联剂、同双官能交联剂、异双官能交联剂、三官能交联剂、双官能螯合剂、生物素化试剂或任何其他反应性官能团。物理表面改性可包括但不限于湿法蚀刻和干法蚀刻。
检测生物分子的系统
本公开内容提供了可包含多个组件的集成式测序平台。该集成式测序平台可用于多种应用，如对来自活受试者的核酸样品进行测序。
在核酸测序的背景下，可向传感器阵列提供包含克隆的核酸群体的珠子(例如，通过流体流动，可能通过与传感器阵列相关联的一个或多个流体通道(例如，微流体通道))，并且珠子固定至传感器位点。在珠子固定后，可使适合于核酸测序的试剂与传感器阵列连续接触以对与给定传感器位点相关的珠子上的核酸进行测序。例如，在第一轮中，传感器阵列可以与包含引物的流体接触，引物可与核酸杂交，并且通过聚合酶的作用以模板指导的方式延伸。然后可洗涤阵列，以去除任何非杂交的引物。在第二轮中，传感器阵列可与包含适用于引物延伸的试剂(例如，聚合酶、辅因子、合适的缓冲液)和特定的已知核苷酸(例如，a、t、c、g或u)的流体接触。发生掺入，并且在发生掺入的阵列位点处，那些位点处的传感器可通过任何合适的方式检测指示掺入的信号，包括本文其他各处所述的那些方式中的一种或多种。在检测到信号时，信号可被解释为将特定的已知核苷酸掺入模板。在一些情况下，信号大小/强度可用于确定在给定位点处有多少特定的已知核苷酸掺入核酸，诸如在已知核苷酸掺入超过一次的情况下(例如，在重复模板互补的情况下)。然后可洗涤传感器阵列，并对于用于测序的每个剩余的已知核苷酸重复该循环，然后对每个核酸样品核苷酸重复整个循环组，直到对结合至珠子的样品核酸进行测序。
例如，位点由包含核酸的克隆群体的珠子占据传感器阵列可以与包含与克隆核酸杂交的引物的流体接触。然后可洗涤传感器阵列，随后在合适的缓冲液中与包含含腺嘌呤的核苷酸、聚合酶和任何必需辅因子的流体接触。含腺嘌呤的核苷酸可以掺入杂交引物，其中克隆核酸上的下一个模板位点是含胸腺嘧啶的核苷酸。然后可洗涤阵列，并对每个含鸟嘌呤的核苷酸、含胸腺嘧啶的核苷酸和含胞嘧啶的核苷酸重复掺入和洗涤循环。一旦四种类型的核苷酸已经与传感器阵列接触，该循环还可重复另一组以与四种类型的核苷酸中每一种接触，直到与珠子结合的样品核酸被测序。
在一些情况下，核酸(例如，脱氧核糖核酸(dna))扩增和测序可在同一阵列上顺序进行，甚至同时进行。在这样的情况下，阵列可包括对给定阵列位置处的扩增和感测中的一者或两者有用的组件。除了具有可以固定珠子的特征外，给定的阵列位点可以包括一个或多个电极。所述一个或多个电极可包括可提供产生虚拟阱的电场以将试剂限制于阵列位点的一个或多个单独的电极，以及用作传感器的一个或多个单独的电极。在一些情况下，一个或多个电极可包括既可提供电场又可用作传感器的一个或多个电极。
传感器阵列可合并到集成式测序平台中。集成式测序平台可包括核酸(例如，dna)提取模块、文库构建模块、扩增模块、提取模块和测序模块中的一种或多种。在一些实施方案中，系统可以是单独的和/或是模块化形式的。在一些实施方案中，集成式测序平台可包括这些系统中的一个、两个、三个、四个或所有五个系统。在一些情况下，模块可集成在单一单元(例如，微流体装置)、单一阵列(例如，可重复使用的传感器阵列)甚至单一装置中。集成式测序平台的示例可见于pct专利申请号pct/us2011/054769、pct专利申请号pct/us2012/039880、pct专利申请号pct/us2012/067645、pct专利申请号pct/us2014/027544、pct专利申请号pct/us2014/069624和pct专利申请号pct/us2015/020130，这些申请各自通过引用整体并入本文。
图1示意性地描绘了集成式测序平台的示例。集成式测序平台包括文库构建模块(例如，核酸文库构建系统)，该文库构建模块可包含核酸片段化元件和大小选择元件中的一者或两者。如图1的示例中所示，文库构建系统在单一单元116中包含核酸(例如，dna)片段化和大小选择元件。提供至片段化和大小选择单元116的核酸112可从生物样品(例如，细胞110)提取并在片段化之前与生物样品中的其他材料分离120。片段化和大小选择单元116可被配置用于经由下文所述的元件和方法产生核酸片段，如可具有或可不具有平端的双链核酸片段。片段化和大小选择单元116可包含一个或多个微流体通道122，其中可安设核酸以及一组片段化珠子124。可通过任何合适的方法(例如，加压注射、电泳移动、重力进料、热诱导的移动、超声移动和/或诸如此类)将核酸(例如，dna)提取系统(例如，图1所示的)中收集的核酸112输送或“注射”至核酸(例如，dna)片段化和大小选择单元116中。类似地，可通过任何合适的方法将片段化珠子124输送至核酸(例如，dna)片段化元件和大小选择单元116中。
片段化元件和/或大小选择单元116可包含泵126，以在微流体通道122内产生流体(例如，包含核酸(例如，dna)和片段化珠子124的流体)移动。例如，泵126可为蠕动泵、旋转泵或往复泵。在一些实施方案中，泵126可包含与微流体通道122流体连通的一个或多个微流体元件，并且可具有柔性的侧壁，该柔性侧壁在变形时于微流体通道122内产生流动。然而，在其他实施方案中，作为替代或除此之外，可使用另一种合适的策略在微流体通道122内产生移动流体，非限制性示例包括流体的选择性加热和冷却、微流体通道的气动加压、电泳运动等。
如图1所示，可将由大小选择单元116生成的片段114与能够结合片段114的珠子134一起转移至扩增单元132。扩增单元132可包含各自能够保持珠子的特征阵列。珠子可经由磁力(例如，经由磁性特征)、静电力(例如，经由一个或多个电极)或经由结合对的成员(例如，经由核酸与偶联至阵列的核酸的杂交)而结合至阵列。在一些情况下，可以以稀释的浓度将片段提供至扩增单元，以获得样品核酸分子与珠子的期望比例。可小心控制提供至扩增单元132的珠子134和片段114的流速，使得平均少于一个片段与给定的珠子相关联。这样的比例可有助于确保在扩增单元132中产生的扩增子群体的克隆性质。片段114与珠子的结合可通过任何合适的途径实现，包括与偶联至珠子的寡核苷酸杂交、共价连接、相关的结合配体对或任何其他结合技术。结合可以是不可逆共价结合、可逆共价结合或可逆非共价结合。
向阵列提供用于结合片段的扩增的试剂，然后可以以任何合适的方式进行片段的扩增，包括通过聚合酶链反应(pcr)、链置换扩增、等温扩增或任何其它合适的扩增方法，以产生珠子群体，每个珠子包含核酸的克隆群体。核酸扩增可在多个循环中进行。一旦在使阵列与第一组核酸片段接触之后完成第一轮扩增，就可以洗涤该阵列以便移除任何未结合的扩增子和溶液中的其他试剂。在洗涤后，通过使阵列与另外的核酸片段接触，然后将那些片段暴露于适用于核酸扩增的试剂，可以完成第二轮扩增。在克隆扩增完成的情况下(例如，在一些珠子上没有保留结合位点)，第二片段可以仅结合至尚未包含扩增子的珠子，这是因为具有来自第一轮扩增的扩增子的位点可能满载了扩增子。该过程可以重复任意数目的扩增循环，直到捕获位点耗尽。利用多轮扩增可以帮助消除双泊松分布问题，并帮助确保每个传感器位点仅关联于一个核酸序列，但最大限度地占据阵列位点。
在一些情况下，可实施通过一个或多个电极在给定阵列位点处产生的虚拟阱(例如，通过电场和/或磁场产生)，以将扩增试剂限制在给定阵列位点。虚拟阱可允许核酸在传感器位置处扩增，而不会使反应物与阵列的其他传感器的反应物交叉污染。虚拟阱内的扩增可帮助产生扩增子的克隆群体。
一旦扩增完成，但在测序之前，扩增产生的克隆珠子可被运输至富集单元138，该富集单元将具有扩增子的珠子与没有核酸的珠子分离。富集模块可包括将包含扩增子的珠子与不包含扩增子的珠子进行分选的任何方法。分选方法可包括大小选择、电泳分选或珠子捕获分选。分选珠子捕获可包括通过杂交、配体对结合或任何其他可逆结合技术将包含扩增子的珠子与捕获部分相关联。在一些情况下，分离方法可利用在电泳分选器中实施的电泳方法。在电泳分选器中，空珠子(例如，没有核酸的珠子)以及受到不完全扩增的珠子或包含过短核酸的珠子可以通过分选器组件在珠子上产生的电泳力(例如，通过施加电场)与包含期望扩增子的珠子进行分选。
电泳分选器可包含能够接受已分选的珠子的一个或多个通道。具有期望扩增产物的珠子可具有足够的电荷，以通过它们与电场的相互作用被引导至出口通道。已分选的珠子可从出口通道收集，并将其提供返回扩增系统以供扩增。此外，没有适当量的扩增产物和/或没有足够长度的扩增子的珠子可流过电泳分选器，并且替代地被引导至废物通道。珠子可以从废物通道收集，并可以在适当清洁以去除任何不期望的物质后重新用于另一个扩增循环或其他目的。例如，可用漂白剂如过氧化氢洗涤珠子，以帮助确保珠子上没有残留污染物，使得它们可被重复使用。
富集系统和电泳分选器的其他示例描述于pct专利申请号pct/us2011/054769、pct专利申请号pct/us2012/039880、pct专利申请号pct/us2012/067645、pct专利申请号pct/us2014/027544和pct专利申请号pct/us2014/069624中，这些申请各自通过引用整体并入本文。
一旦分离完成，可将具有扩增子的珠子140提供给测序单元(例如，包含传感器阵列136的测序单元)并进行测序。克隆珠子的富集可在测序之前完成。在一些情况下，克隆珠子的富集在测序之前未完成。在这样的情况下，将扩增过程中产生的扩增材料直接提供给测序单元，并对结合至克隆珠子的核酸进行测序。
测序单元可包含一个或多个传感器阵列，每个阵列包含多个位点。阵列的给定位置可包括传感器，并且在一些情况下，包括将珠子固定在给定位点并邻近于其传感器的力机构。在一些情况下，力机构可以是磁体，例如永磁体或电磁体。由磁体施加的磁力可固定响应于磁力的珠子(例如，包含磁性材料的珠子)。在一些情况下，力机构包括产生静电力的一个或多个元件(例如，一个或多个电极)。由一个或多个元件施加的静电力可固定响应于静电力的珠子(例如，包含带电物质如核酸的珠子)。在一些情况下，传感器阵列的给定位点包含可固定珠子的物理沟槽或孔。在一些情况下，传感器阵列的给定位点包含结合对的一个成员的一个或多个分子，其可结合包含结合对的另一成员的珠子。这样的成员包括可与偶联至珠子的另一寡核苷酸杂交的寡核苷酸、可与另一种偶联至珠子的链霉亲和素和生物素结合的链霉亲和素或生物素。此外，在一些情况下，感测阵列可以没有孔并且可以是基本上平面的。
传感器阵列的给定位置处的传感器可以是任何合适的传感器。在一些情况下，传感器是电子传感器。电子传感器可包含一个或多个电极(在一些情况下，包含至少两个电极)，其能够测量指示阻抗变化、电荷变化、离子浓度变化以及/或者与珠子和/或偶联至珠子的物质相关联的电导率变化中的一种或多种的信号。在一些情况下，传感器可包括纳米针和/或纳米桥传感器和/或光学传感器。纳米针和/或纳米桥传感器可能能够检测ph值变化、电荷变化、电导率变化和阻抗变化中的一种或多种。纳米桥和纳米针传感器更详细描述于美国专利公开号us2012/0138460、pct专利申请号pct/us2011/054769、pct专利申请号pct/us2012/039880、pct专利申请号pct/us2012/067645、pct专利申请号pct/us2014/027544和pct专利申请号pct/us2014/069624和pct专利申请号pct/us2015/020130，其各自通过引用整体并入本文。
此外，传感器阵列的一个或多个传感器可以是可独立寻址的。可独立寻址的传感器是阵列中的单个传感器，其响应可独立于阵列中其他传感器的响应进行检测。可独立寻址的传感器还可以指阵列中的单个传感器，其可独立于阵列中的其他传感器进行控制。
传感器的感测可基于与固定在接近于传感器的珠子和/或与珠子相关的物质(例如，核酸)相关联的局部ph变化、局部阻抗变化、局部热检测、局部电容变化、局部电荷浓度(或其变化)和局部电导率变化中的一种或多种。这些测量中的一种或多种的变化可通过涉及与珠子偶联的物质的反应(例如，核酸测序反应)和/或涉及与珠子偶联的物质的结合事件(例如，核酸杂交)来影响。这样的测量可通过直接检测以下各项或检测指示以下各项的信号而作出：固定在接近于传感器的珠子或与珠子偶联的物质(例如，核酸)的局部ph变化、局部阻抗变化、局部热检测、局部电容变化、局部电荷浓度(或其变化)和局部电导率变化。
在一些情况下，这些变化中的一种或多种可以是珠子或者偶联至珠子的物质(例如，核酸)或传感器的德拜层(或德拜长度)内的变化。德拜层可具有被称为德拜长度的特征厚度或长度。此外，在一些情况下，感测发生在(i)珠子(ii)与珠子相关的核酸相关的物质或(iii)传感器的德拜层(或德拜长度)内。德拜层可以是电(或电子)双层，是具有围绕珠子、偶联至珠子或传感器的物质以及/或者传感器的厚度的电荷或电导边界层。在一些情况下，感测发生在跨越传感器和珠子的德拜层内。此外，在传感器包括一个或多个电极(例如，至少两个电极)的情况下，一个或多个电极可以电偶联至珠子或偶联至珠子的物质(例如，核酸)的德拜层。在一些情况下，一个或多个电极可在珠子或偶联至珠子的物质(例如，核酸)的德拜层内。这样的传感器配置描述于例如pct专利申请号pct/us2011/054769、pct专利申请号pct/us2012/039880、pct专利申请号pct/us2012/067645、pct专利申请号pct/us2014/027544和pct专利申请号pct/us2014/069624，其各自通过引用整体并入本文。
来自传感器的信号可瞬时检测或在稳态条件下检测。在瞬时信号检测模式中，检测发生在生物事件如核苷酸掺入期间或紧随其后。在稳态检测中，传感器的读取可在生物事件或掺入事件“完成”之后发生。信号的稳态变化可持续保持，直到向传感器周围的环境引入变化。相对于瞬时检测模式，稳态测量可提供一些优势。传感器可以以需要较少数据的方式使用，因为传感器可能不再需要以高数据速率读取。
在图2a-图2f中描绘了组合式扩增和测序阵列的示例以及示例阵列的使用。如图2a中所示，阵列200配置在基底201(例如，本上平面的基底)上，该基底可包含传感器(例如，纳米传感器)，该传感器有时与平台内限定的微流体通道连通。传感器可关联于基底201并且基底201还可关联于磁性元件210以及电极元件205和207。磁珠可以由该磁性元件210或者电极元件205和207定位于传感器上。磁性元件可形成局部磁场并且电极元件可形成局部电场，以便在阵列200的各种传感器处定位珠子。此外，磁场和/或电场可在阵列200的占据位置处创建针对珠子的约束区。
如图2b中所示，可以将包含核酸240(例如，核酸片段)的样品输送到阵列200。核酸240可以是任何合适的核酸类型，包括本文其他各处描述的核酸类型。在一些情况下，核酸240向阵列200的引入可经由与阵列200相关联的微流体通道进行。如图所示，阵列200可配置有预局域化的磁珠220，并且磁珠可关联于能够与核酸240杂交的引物，使得核酸240被珠子220捕获并变得与之相关联。磁珠220可经由磁性元件210和/或电极元件205和207而定位于阵列200上。替代地或附加地，引物可附接于、结合于或关联于阵列200的位置处的传感器，并用于在该传感器处捕获核酸240。
如图2c中所示，可以同时地、预先地或随后地向阵列200中引入试剂260(例如，聚合酶、脱氧核糖核苷酸(dtnp)和额外的引物)。在一些情况下，试剂260的引入可经由流过与阵列200相关联的微流体通道而进行，使得试剂260通过流动而与磁珠220接触。经由来自适当的阵列元件的磁力和/或静电力，可在试剂260通过流动而与磁珠220相接触时和/或在随后的扩增期间将磁珠220维持在期望的位置。
如图2d中所示，可以克隆扩增与磁珠220相关联的核酸240，以在磁珠220的表面上产生扩增的核酸245。克隆扩增可以使用任何合适的方法来完成，该方法包括本文所述的方法，如pcr、引物延伸反应、等温扩增或其他技术。
如图2e中所述，在核酸240的扩增之后，可以洗涤280阵列200上的磁珠220，从而移除溶液中未结合的扩增子247和试剂260。结果可以是包含与阵列位置相关联的扩增的核酸245的克隆组的磁珠220。洗涤280可通过任何合适的方法来完成，举例而言，诸如在足以移除溶液中未结合的扩增子247和试剂260但不足以使磁珠220从其在阵列上的相应位置脱离的流速下用缓冲溶液洗涤。
如图2f中所示，继而可以使另一等份的试剂270(例如，聚合酶、引物等)和单独核苷酸285的顺序循环与传感器阵列相接触(例如，通过流动)，从而使核苷酸掺入磁珠220的扩增的核酸245中。核苷酸能够以单独的循环引入(例如，循环1＝a、循环2＝t等)。在每个循环之间可存在使用缓冲液的洗涤步骤以帮助减少来自未掺入的核苷酸的污染的可能。用于测序反应的聚合酶可以是与用于扩增反应的聚合酶相同类型的聚合酶，或者可以是不同种类的聚合酶，并且可以在引入核苷酸之前或与其一起引入。对每个循环期间掺入的核苷酸的检测可用于对扩增的核酸245进行测序，并且因此用于对原始样品核酸240进行测序。检测可例如经由电极205和207中之一或全部两者而发生。在一些情况下，电极205和207可通过测量磁珠220和/或与磁珠220相关联的扩增的核酸(或其他核酸)245的局部阻抗变化来检测核苷酸掺入事件。例如，这样的测量可通过直接测量局部阻抗变化或测量指示局部阻抗变化的信号而进行。在一些情况下，阻抗的检测发生在磁珠220和/或与磁珠220相关联的扩增的核酸245的德拜长度(例如，德拜层)内。还可以通过直接测量局部电荷变化或局部电导率变化或指示如本文其他各处所述的那些变化中的一种或多种的信号来测量核苷酸掺入事件。电荷变化或电导率变化的检测可发生在磁珠220和/或与磁珠220相关联的扩增的核酸245的德拜长度(例如，德拜层)内。
例如，组合式扩增和测序系统的其他示例可见于pct专利申请号pct/us2011/054769、pct专利申请号pct/us2012/039880、pct专利申请号pct/us2012/067645、pct专利申请号pct/us2014/027544和pct专利申请号pct/us2014/069624，其各自通过引用整体并入本文。
在测序完成之后，可将珠子从阵列分离，将珠子从结合的物质分离，并洗涤珠子和阵列中的任一者或两者。洗涤后，珠子和阵列可随后重新使用以进行另一轮扩增和/或测序。珠子从阵列的分离可例如通过移除/逆转用于将珠子保持就位的磁场和/或电场而完成。附加地或作为替代，还可以使用能够施加足够克服用于将珠子保持就位的磁力和/或静电力的力的流体流动和/或其他类型的场(例如，外部磁场、外部电场)来从阵列分离珠子。
虽然本文关于核酸和核酸测序反应以及核酸杂交进行了描述，但本文所述的系统、装置和方法可用于不同的生物或生物化学部分和反应的各种其他应用和检测。此类应用的非限制性示例包括抗体-抗原检测、蛋白质或肽检测、蛋白质或肽结合/相互作用反应、细胞分析、药物发现或筛选、配体结合检测、病原体检测、法医分析、小分子检测和反应检测或其他类型的分析。蛋白质检测可通过反应的直接测量、通过夹心测定测量或通过利用适体的测量来进行。在这些应用的背景下，可以通过将物质或参与待监测反应的物质偶联至珠子上并使用本文所述的感测方法进行感测。在一些情况下，扩增和/或感测平台可用于医疗应用，包括照护点(point-of-care)诊断。
本文所述的扩增和/或感测平台可包装在一个或多个装置中。该装置可执行方法的任一种或多种操作，包括但不限于核酸提取、片段化、文库制备、固定化(例如，在珠子上)、扩增、约束、珠子富集、测序或数据分析和通信。在一些情况下，装置是检测系统的一部分。该系统可包括多个装置中的单个装置。此外，该系统可包括单个模块或可包括多个模块。每个装置可进行相同的生物检测或不同的生物检测。装置可通过包括例如无线连接在内的任何合适类型的连接彼此通信。
示例装置如图3所示。图3示出了检测装置301、具有感测阵列的可移除芯片302，以及可插入生物检测装置301并从其移除的试剂储器303。芯片302可以是单用途芯片或多用途芯片。芯片可以是一次性的(例如，由环保的材料形成)和/或可以是可重复使用的。此外，感测阵列可被配置为本文所述的感测阵列，并使用本文所述的感测方法操作。在一些情况下，感测阵列还包括用于在传感器阵列位置处产生电场的电极。在这样的情况下，核酸扩增和感测可在感测阵列的给定位置处进行。
在一些示例中，试剂储器303包含引物、核苷酸和聚合酶，以供核酸测序。生物检测装置301可包含屏幕304，该屏幕304可包含用户界面，如图形用户界面。屏幕304可使得用户能够操作装置301，如进行核酸测序。生物检测装置301可包含被配置用于接受可移除芯片302的端口305。在一些示例中，当可移除芯片302插入至装置301中时，可使用芯片302的感测阵列和试剂储器303中的试剂来进行核酸测序。在一些情况下，所述装置进一步包含一个或多个与感测阵列流体连通的流体流动路径。该流体流动路径还可与包含用于生物反应(例如，核酸测序)的一种或多种试剂的一个或多个储器连通。在一些情况下，该流体流动路径可在乳液中或在没有乳液的情况下向感测阵列提供珠子。
在一些情况下，所述装置进一步包含耦接至感测阵列的计算机处理器(或其他电子逻辑)。该计算机处理器可被编程为从感测阵列接收信号，该信号指示物质或与该物质相关的反应的直接电子签名。
所述装置可以是是便携式的，使得其可以容易地由用户或机器运输。例如，该机器可以是可在载具上运输的。在一些示例中，该载具为汽车、摩托车、踏板车、直升机、飞机、卡车、军用载具、航天器或机器人。在一些情况下，所述感测装置可提供在载具上。该载具可为汽车、摩托车、踏板车、直升机、飞机、卡车、军用载具、航天器或机器人。该装置的重量和占用空间可被封闭在可控物中，以帮助使得装置便携。在一些情况下，装置可以包括具有相对较小占用空间的壳体，装置组件位于该壳体中。此外，装置可由导致该装置的重量相对较轻的材料构成。在一些示例中，壳体具有小于或等于约250,000(平方毫米)mm2、200,000mm2、150,000mm2、100,000mm2、50,000mm2、10,000mm2、5,000mm2或1,000mm2的占用空间，并且装置具有小于或等于约200磅、175磅、150磅、125磅、100磅、75磅、50磅、25磅或10磅的重量。
本公开内容提供了被编程用于实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图4示出了计算机系统401，其被编程或以其他方式配置用于操作装置组件、启动和执行操作协议以及/或者处理和分析从感测获得的数据。计算机系统401可调节本公开内容的感测装置、系统和方法(例如，用于生物检测的方法)的各个方面。在一些实施方案中，如本文其他各处所述，计算机系统401可从传感器接收信号并确定局部阻抗、局部电荷和/或局部电导率的变化。
计算机系统401可以是用于生物检测的装置或系统的部分，或者与该装置或系统分开。在一些示例中，系统401与用于生物检测的装置或系统如核酸测序装置集成。例如，系统401可被包含在还含有感测阵列的壳体中，该感测阵列可经由可移除的芯片提供。
计算机系统401包括中央处理器(cpu，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)405，该中央处理器405可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统401还包括存储器或存储器位置410(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元415(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口420(例如，网络适配器)以及外围装置425，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器410、存储单元415、接口420和外围装置425通过诸如主板等通信总线(实线)而与cpu405通信。存储单元415可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统401可借助于通信接口420而可操作地耦接到计算机网络(“网络”)430。网络430可以是因特网、互联网和/或外联网，或者是与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络430是电信和/或数据网络。网络430可包括一个或多个计算机服务器，这可以实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，网络430可借助于计算机系统401实现对等网络，这可以使得耦合到计算机系统401的装置能够起到客户端或服务器的作用。
cpu405可以执行一系列机器可读指令，这可以体现于程序或软件中。所述指令可存储在存储器位置，诸如存储器410中。由cpu405执行的操作的示例可以包括读取、解码、执行和回写。
存储单元415可存储文件，诸如驱动程序、文库和保存的程序。存储单元415可存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统401可包括一个或多个附加的数据存储单元，所述附加数据存储单元位于计算机系统401的外部，诸如位于通过内联网或因特网而与计算机系统401通信的远程服务器上。
计算机系统401可通过网络430而与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统401可与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式pc)、板状或平板计算机(例如，
本文所述的方法可通过存储在计算机系统401的电子存储位置上(例如，存储器410或电子存储单元415上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现。该机器可执行或机器可读代码能够以软件的形式提供。在使用过程中，该代码可由处理器405执行。在一些情况下，该代码可从存储单元415检索并存储在存储器410中以供处理器405随时访问。在一些情况下，可排除电子存储单元415，并且机器可执行指令存储在存储器410上。
所述代码可被预编译并被配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可在运行时进行编译。所述代码能够以编程语言来提供，该编程语言可被选择用以使该代码能够以预编译或即时编译的方式执行。
本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统401，可以体现在编程中。所述技术的各个方面可被认为是通常被携载或体现于某种类型的机器可读介质中的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可存储在电子存储单元上，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可包括计算机的任何或所有的有形存储器、处理器等，或者其关联的模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以随时为软件编程提供非暂时性存储。全部的软件或其部分可以不时通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这样的通信例如可实现软件从一个计算机或处理器向另一计算机或处理器的加载，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地装置之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及在各种空中链路上使用的光波、电波和电磁波。携带这些波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性的有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供用以执行的指令的任何介质。
因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码等，可采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如在任何计算机中的任何存储装置等，诸如可用于实现附图中所示数据库的存储装置等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴线缆；铜线和光纤，其包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(rf)和红外(ir)数据通信期间生成的波。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、cd-rom、dvd或dvd-rom、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔洞图案的任何其他物理存储介质、ram、rom、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存储器芯片或匣、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的线缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多介质可参与向处理器传送一个或多个指令的一个或多个序列以供执行。
计算机系统401可包括电子显示器435或与其通信，该电子显示器435包括用于提供例如装置操作的输出或读出以及/或者在感测期间和/或从感测获得的信号的用户界面(ui)。这样的读出可包括核酸测序读出，如构成给定核酸样品的核酸碱基的序列。ui的示例包括但不限于图形用户界面(gui)和基于网络的用户界面。电子显示器435可为计算机监视器，或者电容式或电阻式触摸屏。
用于检测传感器占据和减轻运动伪影的方法
虽然珠子的固定将珠子与传感器阵列的给定位置相关联，但珠子仍然可相对于电极移动，使传感器感测的信号的收集和分析复杂化。本公开内容提供了可以减少、最小化和/或消除与传感器位点处的珠子移动相关的感测复杂性的感测方法。通常，这样的方法利用能够减少、最小化和/或消除未占据的传感器位点、背景噪声、信号伪影以及与珠子移动相关的其他信号问题的有害影响和效率低下的流体条件。
离子的总体流动在远离珠子较大距离处相对不受珠子存在的影响，并且与在其中发生感测的体相流体的电导率(σb)成比例。然而，在短距离处，双电层(例如，在德拜长度内)具有与珠子表面处的电导率(σs)成比例的表面电流。这些电导率之间的关系可以用杜坎数(du)表示。杜坎数是无量纲量，定义为表面电导率(σs)与流体体电导率(σb)乘以珠子大小(d)之比：du＝σs/(σbd)。在感测的背景下，杜坎数在数值上表示由传感器测量的总电流中珠子的表面电导率的贡献。当体相流体的电导率基本上等于珠子表面处的电导率(σs≈(σbd)，du≈1)时，信号采集可能对珠子的移动不太敏感。替代地或附加地，当体相流体的电导率略大于珠子表面处的电导率(σs<(σbd)，du<1)时，信号采集可能对珠子的移动不太敏感。
本公开内容的一个方面提供了用于对核酸模板进行测序的方法。该方法包括：(a)使核酸模板与含有核苷酸群体的感测流体接触，其中核酸模板与引物杂交并偶联至珠子，该珠子被定位成接近于传感器阵列中的传感器，其中该传感器包含至少两个电极，并且其中感测流体具有体电导率而珠子的表面具有表面电导率，以提供小于约1的杜坎数；(b)在将核苷酸群体中的至少一个核苷酸掺入生长的核酸链中时，使用传感器检测珠子的德拜层内的电导率变化，其中生长的核酸链衍生自引物并且与核酸模板互补；(c)洗涤传感器阵列，以从传感器阵列去除核苷酸群体的未掺入核苷酸；以及(d)重复(a)-(c)以获得核酸模板的序列信息。
在一些实施方案中，体电导率在珠子表面电导率的约+/-500％内、约+/-300％内、约+/-100％内、约+/-50％内或约+/-10％内。在一些实施方案中，可从感测流体和珠子表面的电导率确定的杜坎数小于或等于约1、小于或等于约0.95、小于或等于约0.9、小于或等于约0.8、小于或等于约0.7、小于或等于约0.6、小于或等于约0.5、小于或等于约0.4、小于或等于约0.3、小于或等于约0.2、小于或等于约0.1或更小。在一些实施方案中，可从感测流体和珠子表面的电导率确定的杜坎数大于或等于约0.1、大于或等于约0.2、大于或等于约0.3、大于或等于约0.4、大于或约等于0.5、大于或等于约0.6、大于或等于约0.7、大于或等于约0.8、大于或约等于约0.9、大于或约等于约1或更大。在一些实施方案中，可从感测流体和珠子表面电导率确定的杜坎数在约0.08与1之间、约0.1与1之间、约0.2与1之间、约0.3与1之间、约0.4与1之间。约0.5与1之间、约0.6与1之间、约0.7与1之间、约0.8与1之间、或约0.9与1之间。感测流体可包含对核酸模板近侧测序所必需的反应组分。反应组分可包括聚合酶或聚合反应酶、缓冲液、盐、辅因子、三磷酸腺苷和拥挤试剂中的一种或多种。核苷酸可借助聚合酶或聚合反应酶掺入。传感器的给定电极可暴露于感测流体。电极可以在珠子的德拜层内或在待测序的核酸分子的德拜层内。传感器可在掺入核苷酸时进一步检测在珠子的德拜层内的阻抗变化。电导率的变化和阻抗的变化可瞬时检测或在稳态条件下检测。
感测流体可包括氯化镁(mgcl2)、硫酸镁(mgso4)、氯化钠(nacl)和氯化钾(kcl)中的一种或多种，或包含所需电导率的任何其他缓冲液。感测流体可具有小于约100毫摩尔(mm)、小于约50mm、小于约25mm、小于约15mm、小于约10mm、小于约8mm、小于约6mm、小于约4mm、小于约2mm、小于约1mm、小于约0.8mm、小于约0.6mm、小于约0.4mm、小于约0.2mm、小于约0.1mm或更小的溶质浓度。感测流体可具有约0.1mm至8mm、约0.15mm至6mm、约0.2mm至4mm、约0.5mm至2mm的溶质浓度。
在另一方面，本公开内容提供了用于确定传感器阵列的位点处的珠子占据的方法。该方法包括：(a)使传感器阵列与多个珠子接触，其中传感器阵列包含多个传感器，每个传感器具有至少两个电极，以提供在多个传感器中接近于单个传感器的给定位置处的多个珠子中的给定珠子；(b)使传感器阵列与探测流体接触，该探测流体具有比与给定珠子表面相关的电导率大至少约50倍或小至少约50倍的体电导率；(c)使用单个传感器检测指示接近于传感器的给定珠子的存在的信号；以及(d)将传感器阵列的给定位置鉴定为被给定珠子占据。
传感器阵列可用于检测在单个传感器的感测接近度内的珠子的存在。检测在传感器的接近度内的珠子可包括使感测阵列与探测流体接触。探测流体可具有比与珠子表面相关的电导率大至少约50倍或小至少约50倍的体电导率。传感器可用于检测指示接近于传感器的珠子的存在的信号。在一些实施方案中，与探测流体相关的电导率比与珠子表面相关的电导率大至少约100倍、大至少约500倍、大至少约1000倍、大至少约5000倍或更大。在一些实施方案中，与探测流体相关的电导率比与珠子表面相关的电导率小至少约100倍、小至少约500倍、小至少约1000倍、小至少约5000倍或更小。
探测流体可具有比给定珠子的德拜层的电导率大至少约50倍或小至少约50倍的体电导率。与探测流体相关的电导率可比给定珠子的德拜层的电导率大至少约100倍、大至少约500倍、大至少约1000倍、大至少约5000倍或更大。与探测流体相关的电导率可比给定珠子的德拜层的电导率小至少约100倍、小至少约500倍、小至少约1000倍、小至少约5000倍或更小。
探测流体可以是任何合适的缓冲液，其具有与珠子表面处的电导率不同或大不相同的电导率，非限制性示例包括氯化镁(mgcl2)、硫酸镁(mgso4)、氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)缓冲液或任何其他缓冲液。此外，探测流体可具有任何合适浓度的溶质，使得流体的电导率与珠子表面处的电导率不同或大不相同。例如，流体中溶质的浓度可以为约0.01mm(毫摩尔)至约1摩尔(m)、0.01mm至约500mm、0.01mm至约50mm、0.01mm至约25mm、0.01mm至约10mm、0.1mm至约10mm、0.1mm至约8mm、0.1mm至约6mm、0.1至约4mm、0.1至约2mm或0.1至约1mm。
杜坎数可从探测流体的电导率和珠子表面电导率来确定，并且可小于1、大于1、远小于1或远大于1。体电导率可在德拜层的电导率的约+/-500％内。使传感器阵列与探测流体接触可允许测量接近于传感器位置的珠子是否存在。珠子可与核酸分子偶联。在检测核苷酸掺入之前或期间，可进行接近于传感器的珠子的存在的检测。在感测接近度内没有珠子的传感器可被排除在感测之外，并且可不用于检测核酸分子的序列。替代地或附加地，具有感测接近度内的珠子的传感器可用于检测核酸分子的序列。检测在传感器的感测接近度内的珠子的存在的信号可包括电流。包含电流的信号可包括电导率或阻抗信号。
图5示意性地描绘了示例传感器和珠子配置。参考图5，珠子500位于接近于第一电极502和第二电极504。珠子500可(在任何方向上)移动距离504。移动可由各种因素引起，包括，例如布朗运动、流体流动、装置振动的扩散或其组合。在一些情况下，珠子500在信号检测期间连续移动，使信号获取和分析复杂化，具有较高的背景噪声和较低的信噪比。
在感测发生于其中的流体(例如，缓冲液)中，物质的组成和浓度可影响与珠子移动相关的感测问题的突出程度。图6示意性地描绘了附近的电荷环境的示例。参考图6，包含正离子600和负离子605的缓冲液可以在珠子610附近流动和/或传导电流。当体相流体的电导率基本上等于或等于珠子表面处电导率(σs＝或≈(σbd)，du＝或≈1)时，信号获取对珠子的移动可能不太敏感。例如，感测发生于其中的流体的电导率可在珠子表面处的电导率的约正负(+/-)500％内、约+/-450％内、约+/-400％内、约+/-350％内、约+/-300％内、约+/-250％内、约+/-200％内、约+/-150％内、约+/-100％内、约+/-50％内、约+/-40％内、约+/-30％内、约+/-20％内、约+/-10％内、约+/-5％内或约+/-1％内。在一些示例中，珠子在其表面处的电导率在流体电导率的约+/-300％内、约+/-250％内、约+/-200％内、约+/-150％内、约+/-125％内、约+/-100％内、约+/-95％内、约+/-90％内、约+/-85％内、约+/-80％内、约+/-75％内、约+/-70％内、约+/-65％内、约+/-60％内、约+/-55％内、约+/-50％内、约+/-45％内、约+/-40％内、约+/-35％内、约+/-30％内或约+/-25％内。
感测发生于其中的流体可以是任何合适的缓冲液，其具有基本上等于或等于珠子表面处的电导率的电导率，非限制性示例包括氯化镁(mgcl2)、硫酸镁(mgso4)、氯化钠(nacl)和氯化钾(kcl)缓冲液。此外，感测发生于其中的流体可具有任何合适浓度的溶质，使得流体的电导率等于或基本上等于珠子表面处的电导率。例如，流体中溶质的浓度可以是约0.01mm(毫摩尔)至约1摩尔(m)、0.01mm至约500mm、0.01mm至约50mm、0.01mm至约25mm、0.01mm至约10mm、0.1mm至约10mm、0.1mm至约8mm、0.1mm至约6mm、0.1至约4mm、0.1至约2mm或0.1至约1mm。
图7图示描绘了从评价du对用电极对观察到的信号的影响的示例感测实验获得的数据。参考图7，纵轴是无量纲电流(ir/ib)而水平轴是du，在水平轴左侧(例如，朝向10-3)表示相对较高浓度的缓冲液，在水平轴右侧(例如，朝向103)表示相对较低浓度的缓冲液。图表上的每条线表示珠子相对于传感器移动的不同距离(δx)，范围为0至约0.8微米(μm)。注意，在电导率在du＝0.1和du≈1之间(即，近似相等)的区域中，感测对珠子移动最不敏感(例如，δx的所有值给出大致相同的电流信号)。换言之，当珠子相对于传感器电极移动时，传感器未检测到电流的显著变化。相反，如图7所示，在du数较高时，信号变化705相对较大。如本文其他各处所述，这种信号差异可用于检测在传感器位置处的珠子。
此外，可利用感测发生于其中的流体的体电导率与珠子表面电导率的差异来鉴别被珠子占据的传感器阵列位点。将传感器阵列暴露于du>或>>1或者du<或<<1的探测流体可导致相对较大的信号变化，该变化可被检测和解释以指示珠子在给定传感器处的存在。通过排除从与珠子(并因此与分析物)不相关联的传感器采集的数据，鉴别被珠子占据的传感器可减小收集的数据量。减少的数据采集可提高数据处理的速度并降低复杂性。此外，这样的差异可用于确定在感测期间或之后珠子是否从特定传感器位置丢失或获得。实际上，传感器可在感测之前或之后的任何时间点暴露于du>或>>1或者du<或<<1的流体，以便确定传感器阵列位点的珠子占据。对于感测，可用du＝或≈1或者0.1<du≤1的流体替换该流体，以便最小化信号采集问题，如本文其他各处所述。
在使用探测流体以评估传感器阵列的各个位点处的珠子占据的情况下，珠子表面处的电导率可以是与探测流体的电导率充分不同(例如，更大或更小)的任何电导率，以使得在珠子占据的传感器位点处产生可观察的信号变化。在一些情况下，探测流体的电导率比珠子表面的电导率大至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约500倍、至少约1000倍、至少约5000倍、至少约10000倍、至少约50000倍或至少约100000倍。在一些情况下，探测流体的电导率比珠子表面的电导率小至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约500倍、至少约1000倍、至少约5000倍、至少约10000倍、至少约50000倍或至少约100000倍。
此外，如前所述，从探测流体和珠子表面的电导率可确定的du可以是任何合适的数值，使得du充分大于或小于1，从而可观察到充分的信号变化。例如，可从探测流体和珠子表面的电导率确定的du可以是至少约0.0001、至少约0.001、至少约0.01、至少约0.1、至少约1、至少约10、至少约100、至少约1000或至少约10000或更大。在其他示例中，可从探测流体和珠子表面的电导率确定的du可以是小于约10000、小于约1000、小于约100、小于约10、小于约1、小于约0.1、小于约0.01、小于约0.001或更小。在一些示例中，可从探测流体和珠子表面的电导率确定的du可以是约0.001至约0.9、约0.01至约0.9、约1.1至约10000、约10至约10000、或约1.1至约1000、约10至约1000或约100至约1000。
探测流体可以是任何合适的缓冲液，其具有与珠子表面处的电导率不同或大不相同的电导率，非限制性示例包括氯化镁(mgcl2)、硫酸镁(mgso4)、氯化钠(nacl)和氯化钾(kcl)缓冲液。此外，探测流体可具有任何合适浓度的溶质，使得流体的电导率与珠子表面处的电导率不同或大不相同。例如，流体中溶质的浓度可以是约0.01mm(毫摩尔)至约1摩尔(m)、0.01mm至约500mm、0.01mm至约50mm、0.01mm至约25mm、0.01mm至约10mm、0.1mm至约10mm、0.1mm至约8mm、0.1mm至约6mm、0.1至约4mm、0.1至约2mm或0.1至约1mm。
图8示出了从示例传感器占据实验获得的实验数据。图8示出了30x30传感器阵列的图像800，其中各种传感器位点被珠子占据(800的白色圆圈)。图8还示出了通过将传感器阵列暴露于探测流体而产生的信号输出图805，该探测流体具有与珠子表面处的电导率充分的电导率差异以使得在占据位点处观察到信号变化(例如，805的黑色区域)。相反，在未被珠子占据的区域中没有观察到信号变化(例如，805的白色区域)。照片800中的视觉上占据和非占据的位点与输出图805上被指示为占据的位点之间的对应良好，验证了该方法的有效性。
在另一个示例中，在将传感器阵列暴露于每种流体的示例实验中评估在探测流体(例如，du>或>>1或者du<或<<1)和感测流体(例如，du＝或≈1)中区别珠子占据的传感器与未占据的传感器的可行性。图9图示描绘了实验结果。如图9所示，在探测流体中测量的信号区分了占据位点与未占据位点，如图9的标绘图905中的信号分离所示。相反，在感测流体中测量的信号无法区分占据的传感器位点与未占据的传感器位点，如图9的标绘图900中缺少信号分离所示。
用于处理核酸样品的方法
在一方面，本公开内容提供了用于处理核酸样品的方法。该方法可包括提供包含第一组液滴和第二组液滴的混合物。第一组液滴的第一液滴可包含(i)珠子，(ii)重组酶，(iii)聚合酶，和(iv)来自核酸样品的核酸分子。第二组液滴的第二液滴可包含增加重组酶处理核酸分子的速率以允许引物与核酸分子杂交从而在聚合酶存在的情况下进行引物延伸反应的活化剂，从而由核酸分子生成扩增产物。
在混合物中，第一液滴可与第二液滴合并，以生成作为第三组液滴的一部分的第三液滴。第三液滴可包含偶联核酸分子、重组酶、引物和聚合酶的珠子。
可进行引物延伸反应以从第三液滴中的核酸分子生成扩增产物。例如，引物延伸反应可包括进行等温重组酶聚合酶扩增(rpa)或聚合酶延伸反应(pcr)。
图10图示说明了用于处理核酸样品的方法的示例。包含第一组液滴和第二组液滴的混合物可合并以形成第三组液滴。第三组液滴的形成可在第三液滴的限制下激活引物延伸反应。
包含第一组和第二组液滴的混合物可进一步包含油相如矿物油，以及乳化剂如tegosoftdec或abilwe09。
液滴可含有额外组分。例如，第一组液滴可含有缓冲液、盐、拥挤试剂、dntp和引物。同样含有缓冲液、盐、拥挤试剂、dntp和引物的第二组液滴还可含有atp、重组酶加载酶、单链dna结合蛋白和atp再生单元(例如，atp再生化合物)。
在一些实施方案中，包含在第二液滴内的活化剂可以是镁盐。示例镁盐包括但不限于氯化镁和乙酸镁。
通过低速搅动可快速实现第三液滴的形成，近似为至多约10分钟、至多约5分钟、至多约1分钟、至多约30秒、至多约10秒、至多约10秒、至多约5秒或更短。该搅动可包括搅拌和/或摇动。
在一些情况下，第三组液滴被引导通过一组障碍物以控制第三组液滴中每个的形状或大小。例如，障碍物可以是柱，并且可由以各种结构图案布置的各种形状和大小构成。障碍物的形状可包括三角形、正方形、菱形和/或圆形。结构图案可包括如梳状结构等布置。障碍物和结构图案可在弹性或非弹性基底上形成。障碍物和结构图案可通过光刻、冲压、蚀刻、机械加工、模塑或任何其他制造方法形成。第三组液滴的大小和形状可进一步由用于引导液滴通过该组障碍物的流速和压力控制。流速和压力可通过加压储器或隔膜泵控制。图11a-图11f示意性地示出了障碍物和这样的障碍物的使用的示例。图11a图示了接近于障碍物1104的水相1101。水相1101可包含引物结合的珠子1102并且可以被连续油相1103包围。流动可将水相液滴朝向障碍物运输，这可由于剪切力而引起液滴变形并伸长1105，如图11b所示。图11c示出，液滴在通过示例障碍物后分裂成两个子液滴1106a和1106b。子液滴1106a和1106b可各自包含单个引物结合珠子1102。障碍物可具有任何任意形状，如图11d所示，如圆形1104、方形1105、菱形1106和三角形1107。此外，障碍物可放置在流动池中，参见图11e。流动池可由两个侧壁1107a和1107b形成，障碍物可在侧壁1107a与1107b之间形成结构阵列1112图案。如图11f所示，结构阵列可由行1108中障碍物的间隔和数目所定义。另外的行可由列偏移1109和行偏移1110定义。阵列的边界还可包含部分障碍物1111。
包含障碍物阵列的流动池可进一步整合到用于乳液产生的微流体射流装置中。图12a-图12e示意性地示出了将障碍物阵列集成到用于乳液产生的微流体射流装置中的示例。图12a示出了放置在具有入口通道1203和出口通道1204的微流体乳液生成器装置1201中的障碍物阵列1112。图12b示出了两个复用阵列。阵列的复用可以通过例如单个入口通道1203、两个阵列1112a和1112b以及出口通道1204a和1204b来实现。图12c示出了用于芯片上扩增的示例装置。芯片上扩增反应可通过用携带流体1205的通道连接试剂室、混合器、乳液生成器和温育器来进行。流体的运输可通过连接到试剂隔室的外部压力源和压力管线1206以及阀1207实现。阀和压力可由控制单元控制。作为对加压试剂室的替代，如图12d和图12e所示的芯片上隔膜阀和泵可用于移动液体。隔膜泵1208a的封闭形式可由具有真空和/或压力连接器1212的气动层1209、膜1211a以及液压层1210a和1210b组成。流体可使用入口1213进入泵，并且可经由出口1214离开泵。可通过向气动层施加真空以使膜1211b变形而打开隔膜泵1208b，并且液体可进入泵隔室。向气动层施加压力可关闭泵，并且液体可以流出泵隔室。可由小型隔膜泵制成的环绕阀120可以引导液体流动。
第三组液滴可被破坏。破坏第三组液滴的结果可以是形成均匀溶液。可通过添加破坏混合物进行破坏。作为替代，这可通过搅拌乳液进行。在引物延伸反应完成后，可破坏第三组液滴。图13示意性地示出了乳液破乳的示例。
在一些情况下，破坏混合物可由溶解在乳液破坏剂中的失活剂组成。可使用各种乳液破坏剂，包括聚乙二醇样化合物，如三甘醇。还可使用各种失活剂，如十二烷基硫酸四烷基铵化合物。有效失活剂的示例是十二烷基硫酸四丁基铵。
在一些实施方案中，偶联到扩增产物的珠子可被捕获珠子捕获以形成多珠子复合物。多珠子复合物可明显大于非复合珠子。多珠子复合物可比非复合珠子大约2倍、大约4倍、大约6倍、大约8倍、大约10倍、大约15倍、大约25倍、大约50倍、大约100倍或更大。所使用的捕获珠子可被选择，使其仅结合偶联到扩增产物的珠子。捕获珠子可包含任何可逆地结合到珠子的部分，诸如通过缔合/解离相互作用或杂交事件。多珠子复合物的形成可实现偶联到扩增产物的珠子的分离和富集。富集可通过大小选择进行。或者，可使用磁性捕获珠子，以使得富集能够使用磁体进行。
在一些情况下，可通过引导珠子通过一组障碍物来进行大小选择，其中非复合的珠子可穿过一组障碍物，而多珠子复合物不能。例如，障碍物可以是柱，并且可由以各种结构图案布置的各种形状和大小组成。大小选择截止值可由障碍物形状、间隔或结构控制。障碍物的形状可包括三角形、正方形、菱形和/或圆形。结构图案可包括如梳状结构等布置。大小选择可进一步由障碍物形状、障碍物间隔和/或障碍物结构控制。
障碍物可用于分选珠子。图14a-图14d示意性地示出了基于障碍物的珠子分选的示例。由于泊松分布，珠子的子集可偶联到扩增产物1401，而大部分珠子可能不偶联到扩增产物1402。扩增的珠子可被单独标记，也可被更大的捕获珠子1403捕获，形成多珠子复合物1404，如图14a所示。可使用包含障碍物阵列1405的微流体富集模块实现多珠子复合物与非复合珠子的分离。图14b示出了示例富集模块。珠子的混合物可通过入口通道1406a进入模块。障碍物阵列1104可产生过滤器样结构，使非复合珠子能够穿过，而可拒绝较大的多珠子复合物。通道出口1408可显示多珠子复合物的富集，并且通道出口1407a可仅包含非复合珠子。富集部分可再循环到入口1406a。或者，可使用图14c所示的不同实现方案，其包含唯一的出口通道1407b。在该实现方案中，捕获的多珠子复合物可保留在障碍物进入通道1406b中，并且挣脱可能需要流动逆转。图14d所示的该构思的进一步实现方案可包含鞘流1411，以提高富集的有效性。
图15示意性地示出了集成到微流体装置中的富集模块1512的集成的示例。基于鞘流的富集模块可连接到四个隔膜泵1208，隔膜泵1208可转而连接到阀。储器1可含有包含多珠子复合物和非复合珠子的珠子混合物。储器3可含有缓冲水溶液。隔膜泵可使流体能够从储器1和3通过富集模块。在珠子混合物穿过富集模块后，储器2可收集非复合珠子的部分。含有多珠子复合物的珠子混合物部分可经由连接器通道1501再循环到储器1，从而使得再次穿过富集模块。再次穿过富集模块可以提高富集水平，从而实现多珠子复合物与非复合珠子的足够高的配比。
图16a-图16d示出了被引导通过障碍物阵列的原始乳液。图16a和图16b示出了以梳状或六边形密堆积布置的圆形障碍物的示例阵列。图16c示出了在被引导通过障碍物阵列之前的原始乳液。原始乳液具有较大且不均匀的液滴大小。大液滴可易于相互作用、重新组合并形成更大的液滴。图16d示出了在被引导通过障碍物阵列后的乳液。与原始乳液相比，在被引导通过障碍物阵列后的液滴大小更小且更均匀。更小、更均匀的液滴可比原始乳液的液滴更稳定。
用于无珠子核酸测序的方法
本公开内容提供了用于无珠子核酸测序的方法和系统。这可包括使用如本文所述的核酸扩增反应，如侵入性扩增，如美国专利公开号2015/0344943中所述，其各自通过引用整体并入本文。
在一方面，本公开内容提供了用于处理核酸样品的方法。该方法可包括激活包含可含有至少两个电极的支撑物和邻近于支撑物的聚合物材料的传感器。电极可暴露于含有聚合物材料的溶液中。聚合物材料可在测序反应过程中保持核酸分子。测序反应可产生指示核酸分子的单个碱基的信号。在测序反应期间，传感器的电极可用于检测指示核酸分子的单个碱基的信号。信号可瞬时测量或在稳态条件下测量。
该方法可包括进行测序反应，该反应可产生指示可伴随核苷酸掺入核酸分子的阻抗变化的信号。在测序反应期间，传感器的电极可用于检测指示核苷酸掺入核酸分子的阻抗信号。
在另一方面，本公开内容提供了用于处理核酸样品的系统。该系统可包含含有至少两个电极的支撑物和邻近于支撑物的聚合物材料。电极可暴露于包含聚合物材料的溶液中，并且聚合物材料可在测序反应期间保持核酸分子。测序反应可产生指示核酸分子的单个碱基的信号。传感器可偶联到可操作传感器的一个或多个计算机处理器。计算机处理器可被编程用于使核酸分子进行测序反应，并使用传感器的电极检测指示核酸分子的单个碱基的信号。计算机处理器还可被编程用于使用检测到的信号生成核酸分子序列。该系统可配置用于测量瞬时信号、稳态信号或者瞬时和稳态信号两者。
该系统可包括测序反应，其可产生指示伴随核苷酸掺入核酸分子的阻抗变化的信号。传感器可偶联到操作传感器的一个或多个计算机处理器，并可被编程用于使用电极检测指示阻抗变化的信号。计算机处理器也可被编程用于使用阻抗变化生成核酸分子序列。
传感器可用于检测各种生物事件。生物事件可包括但不限于dna测序、病原体的捕获和检测、蛋白质和生物标记物检测以及其他分子诊断。
图17示出了用于基于珠子的测序方法和无珠子测序方法的示例系统。在该示例中，缀合的生物分子是核酸分子。在珠子方法中，两个电极接触点处存在有限量的核酸分子，这可导致信号强度不佳。此外，由于粒径的多分散性，该示例中的磁珠可横向滑动。横向滑动可导致珠子与电极失去接触，产生信号噪声。横向滑动还可导致非闭合电路，从而导致信号丢失。通过控制分子量，物理缠结的聚合物材料可桥接两个电极或覆盖电极，从而使生物事件的检测最大化。
基于珠子的方法的另一个缺点可能是溶液中线性聚合物链的热力学移动的可能性。图18示出了磁珠的示例，其中聚合物接头连接至15碱基的引物。包含聚(环氧乙烷)链的接头长度为85个原子。如果完全延伸，则珠子附近区域的电导率可类似于体电导率。然而，当85原子的接头塌缩时，其可产生可能有助于背景噪声、改变线性并影响其他未知信号参数的抗扰域(restivelydomain)。物理缠结的聚合物材料可减轻这种延伸和塌缩现象。
电极可由化学惰性导电材料形成，如一种或多种金属(例如，铂、金或钛)。电极可由导电金属氧化物形成，例如但不限于，氧化铟锡(ito)。支撑物可包含氧化物(例如氧化硅)，如二氧化硅或金属氧化物。支撑物可进行表面改性以使聚合物材料能够反应性偶联到支撑物表面。表面改性可包括通过用酸、碱、紫外线-臭氧处理或等离子体处理进行化学改性。表面改性可允许接头分子的反应性偶联。接头分子可包括交联剂或偶联剂。交联剂的非限制性示例包括零长度交联剂、同双官能交联剂、异双官能交联剂和三官能交联剂。偶联剂的非限制性示例包括生物素化试剂和硅烷偶联剂。例如，表面可以用氨基-烷基烷氧基硅烷改性。氨基-烷基烷氧基硅烷可作为将聚合物材料偶联到支撑物的偶联剂。氨基-烷基烷氧基硅烷可含有一至三个可与基底表面上的羟基基团反应的烷氧基基团。氨基-烷基烷氧基硅烷的氨基官能团可被其他官能团取代和/或还可含有能够与聚合物材料偶联的二级反应性组分(例如，官能团)。示例官能团可包括丙烯酰胺、丙烯酸酯、硫醇、马来酰亚胺、羧酸酯、nhs酯、四氟苯酯、五氟苯酯、环氧化物、生物素或链霉亲和素部分。聚合物材料可桥接或覆盖电极。
聚合物材料可以是凝胶，如水凝胶。水凝胶可包含非反应性和反应性共聚单体。水凝胶可含有丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙二醇、丙烯酰胺、环氧化物、乙烯醇或(羟乙基)甲基丙烯酸单体中的一种或多种。水凝胶可包含反应性共聚物，该共聚物可包含例如含水溶性非反应性共聚单体，这样的单体的非限制性示例包括丙烯酸2-羟乙酯、乙烯基甲基醚、丙烯酰胺和n,n-二甲基丙烯酰胺。在一些情况下，水凝胶还可包含反应性共聚单体，其可以是或可以不是水溶性的。例如，反应性共聚单体的摩尔分数可以是约0.001至10、约0.01至10、约0.001至1或约0.01至1。在一些情况下，聚(n,n-二甲基丙烯酰胺-共-五氟苯基丙烯酸酯)可用于形成水凝胶。在其他情况下，含有溴乙酰胺戊基丙烯酰胺(brapa)的共聚物可单独或与其它聚合物结合用于形成水凝胶。
图19示出了偶联到二氧化硅支撑物的水凝胶的示例。水凝胶可提供物理缠结的聚合物网络。物理缠结可在一定程度上限制热力学延伸和塌缩。带电荷的核酸分子及其抗衡阳离子以及分布在整个水凝胶中的其他离子的存在可阻止形成电阻区域。水凝胶的使用可改善生物分子的有效负载密度，并且可足够灵活以允许其他分子如酶渗透，从而进行酶促反应。在一些示例中，15碱基的引物的表面密度可以是2.0x105至1.2x106，其可比用磁珠观察到的表面密度高一个数量级(参见例如图18)。
水凝胶可接种有引物寡核苷酸。水凝胶可接种有约1皮摩尔(pm)至10,000pm、约1pm至约8,000pm、约1pm至约6,000pm、约1pm至4,000pm、约1pm至2,000pm、约1pm至1,000pm、约1pm至500pm或约1pm至250pm的引物寡核苷酸。在一些实施方案中，水凝胶接种有多于1pm、多于10pm、多于50pm、多于100pm、多于500pm、多于1,000pm、多于2,000pm、多于4,000pm、多于6,000pm、多于8,000pm、多于10,000pm或更多的引物寡核苷酸。在一些实施方案中，水凝胶接种有少于约10,000pm、少于约8,000pm、少于约6,000pm、少于约4,000pm、少于约2,000pm、少于约1,000pm、少于约500pm、少于约100pm、少于约50pm、少于约10pm、少于约5pm、少于约1pm或更少的引物寡核苷酸。引物可以是与水凝胶反应性的。引物可含有反应性亲核体。反应性亲核体可以是硫醇。例如，包含苄基硫醇基团的引物可以是有效的亲核体。
图20示出了至少部分由brapa组成的水凝胶的结构图。brapa可在原子转移自由基聚合期间充当支化剂并且用作生物分子缀合的反应性基团。brapa可与丙烯酰胺和其他含乙烯基的单体共聚，以在支撑物表面上形成薄膜水凝胶。残留的溴乙酰胺基团与各种亲核体反应，包括硫醇化的寡核苷酸。该反应的示例是苯硫醇化的引物b与聚合物链的溴乙酰胺侧基缀合。
聚合物材料可以是多孔聚合物整料(ppm)。ppm可以是包含反应性官能团的均聚物、共聚物或者三元共聚物(terepolymer)。反应性官能团可与多种化学部分反应，包括但不限于，伯胺、仲胺、巯基、羟基基团、硫醇基团和羧酸基团。反应性官能团可由羧酸、n-羟基琥珀酰亚胺、4,4'-二甲基二氢唑酮的侧基(pendant)、或者四氟苯酚和五氟苯酚的酯组成。
ppm可使用多种方法聚合，包括化学、热或uv辐射方法。图21a-图21d和图22示出了用ppm薄膜制作支撑物的方法。图21a示出了通过异丙醇漂洗和rca溶液浸泡预先清洁的基底表面。图21b示出了由(3-丙烯酰基氧基丙基)三甲氧基硅烷改性的基底表面，其可向表面引入可聚合官能团。图21c示出了反应性单体(例如五氟苯基丙烯酸酯或乙烯基二氢唑酮)、多官能交联剂和致孔剂溶剂中的引发剂的溶液，其分配在基底表面上以准备聚合。光引发剂可用于引发聚合反应。光引发剂可以是生物分子光引发剂，其可包含二苯甲酮和α,α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮。这种引发剂混合物可使光聚合反应能够在露天进行。在一些情况下，可在聚合之前将作为释放物的具有氟化表面的玻璃盖置于单体混合物上。图21d示出了具有ppm薄膜的支撑物。聚合后，释放并去除盖，用己烷冲洗ppm膜并空气干燥，得到ppm的反应性薄膜，用于生物缀合。
图22图示了接枝到基底表面的ppm的制备的说明性示例。简言之，可将具有可聚合表面部分的二氧化硅基底暴露于交联剂、致孔剂和引发剂，并用uv暴露处理，然后洗涤，以形成共价连接到基底表面的ppm膜。然后ppm膜可以是反应性的并用于生物缀合。
ppm可接种有引物寡核苷酸。ppm可接种有约1皮摩尔(pm)至10,000pm、约1pm至约8,000pm、约1pm至约6,000pm、约1pm至4,000pm、约1pm至2,000pm、约1pm至1,000pm、约1pm至500pm或约1pm至250pm的引物寡核苷酸。在一些实施方案中，ppm接种有多于1pm、多于10pm、多于50pm、多于100pm、多于500pm、多于1,000pm、多于2,000pm、多于4,000pm、多于6,000pm、多于8,000pm、多于10,000pm或更多的引物寡核苷酸。在一些实施方案中，ppm接种有少于约10,000pm、少于约8,000pm、少于约6,000pm、少于约4,000pm、少于约2,000pm、少于约1,000pm、少于约500pm、少于约100pm、少于约50pm、少于约10pm、少于约5pm、少于约1pm或更少的引物寡核苷酸。引物可含有各种与ppm反应的反应性基团。反应性基团的示例包括伯胺和仲胺、巯基、羟基基团、硫醇基团和羧酸。
引物密度可通过杂交-去杂交(hyb-dehyb)测定和picogreen可视化确定。图23示出了用表面缀合的引物和与引物互补的fam标记的寡核苷酸进行hyb-dehyb测定的示意图。图24图示了用于制备引物缀合支撑物的工艺流程和用于确定引物缀合的技术。
在是否使用硅烷以活化基底表面的情况下，均可实现聚合物接枝。图25示出了在使用和不使用硅烷的情况下制备的多种基底表面的改进的引物密度。在没有硅烷的情况下，可发现引物密度更高。在不存在硅烷基团的情况下，聚合物材料可通过形成酯键而直接偶联到支撑物表面，而不是与氨基硅烷偶联剂形成酰胺键。在不存在氨基硅烷偶联剂的情况下获得更高的引物密度，并且酯键在多次100毫摩尔(mm)naoh洗涤下仍然存在，这是出乎意料的。
引物可参与扩增反应。在扩增反应期间，引物可形成克隆集落，或者引物可覆盖支撑物的整个表面并形成草坪型覆盖物。引物可以以1pm至4000pm的浓度接种。接种密度对于克隆集落的形成可能是关键的。例如，如果接种密度过高并且引物过于靠近，则草坪型覆盖物将形成混合集落，这可能不允许使用限制性的扩增方法。如果接种密度过低，则将不能有效利用支撑物。接种后，模板可进行扩增反应。可使用各种扩增反应，但是选择的方法可包括使用限制性扩增方案的方法或可与限制性方法组合的扩增方案。扩增方案的示例包括聚合酶链反应、重组酶聚合酶扩增、侵入性扩增、桥式扩增和野火扩增。
关于聚合物涂覆支撑物的固定化引物布置和系统中的示例限制使用如图26a-图26c所示。图26a和图26b示出了侵入性扩增，一种表面限制扩增方法的示意图。简言之，不可延伸的侵入物可促进靶标核酸的双链体在紧邻支撑物表面处打开。靶标核酸双链体的打开可以允许模板与表面固定化引物杂交，这可以导致引物延伸和扩增。图26c示出了来自浓度滴定实验的根据起始模板浓度的扩增后模板密度。在该示例中，使用3pm至4000pm的接种浓度。在40pm至4000pm，系统可以是饱和的(即，预期形成模板草坪)，并且几乎观察不到扩增水平的变化。在较低的接种浓度下，扩增水平可能下降，这可解释为形成不同的集落。
可使用fam-picogreen可视化使引物接种密度和扩增可视化。图27示出了引物接种后和扩增后fam-picogreen可视化的示例。
测序反应可生成电化学信号。信号可指示单个核酸碱基。电化学信号可包括阻抗、电位、循环伏安、光谱或电流信号。在其他情况下，可使用非电化学技术来监测信号。非电化学技术可包括荧光光谱、表面等离子体共振或悬臂技术。
在测序期间，电极可偶联到德拜层(或双层)。待测序的核酸也可在德拜层内，使得测序反应可发生在层内。德拜层内核苷酸向核酸分子的掺入可生成可测量的信号。可测量的信号可以是电化学信号或阻抗信号。信号可瞬时或在稳态条件下的期间测量。
引物延伸可通过电子检测来监测。图28示出了在支撑物表面上扩增的核酸模板的引物延伸和核苷酸掺入的电子检测的示例结果。在支撑物表面上扩增的核酸模板可与引物和聚合酶结合，并暴露于含有所有四种核苷酸的溶液。含有所有四种核苷酸的溶液被称为径流混合物。图28示出了在将径流混合物引入支撑物上之后电子信号的跳跃。图28中的多条迹线可表示不同组的传感器观察到的电子信号的跳跃，或者在用参考或背景信号校正后的跳跃信号。由于核苷酸掺入，电子信号的跳跃可表明引物延伸。
引物延伸还可通过毛细管电泳来验证。图29示出了在径流或测序实验期间，fam标记的引物的延伸的毛细管电泳读出。延长的链可在径流或测序反应后用氢氧化钠熔化，并可在毛细管电泳上运行。四个支撑物(191a、191b、191c和191d)使用径流或测序进行延伸并显示完全延伸。延伸的链的大小大于120个碱基对对照的大小，这基于扩增模板的大小所预计。存在的较小峰值可接近系统的噪声水平。
从引物缀合到径流或测序实验对支撑物的监测的示例如图30a和图30b所示。图30a示出了引物缀合后和靶标扩增后的fam-picogreen显微图。图30b示出了由径流或测序实验导致的累积fam-picogreen显微图和电子信号。
用于氧化还原介导测序的方法
氧化还原介体部分可以是包含一个或多个能够参与氧化还原反应例如还原或氧化的组分(例如，官能团)的任何物质。在氧化反应中，氧化还原介体部分将一个或多个电子献给另一物质，使氧化还原介体部分失去一个或多个电子交给另一物质，产生氧化的氧化还原介体部分。此外，在还原反应中，氧化还原介体部分可接受来自另一物质的一个或多个电子，使氧化还原介体部分从另一物质获得一个或多个电子，产生还原的氧化还原介体部分。在一些情况下，氧化还原介体部分可在氧化反应中献出电子，但在还原反应中不能容易地从另一物质获得电子。在其他情况下，氧化还原介体部分可以在还原反应中接收电子，但在氧化反应中不能容易地将电子献给另一物质。此外，在其他情况下，氧化还原介体部分既可以在氧化反应中将电子献给另一物质，又可在还原反应中从另一物质获得电子。此外，氧化还原介体部分的电荷将根据其氧化态的而有所变化。根据其氧化状态，氧化还原介体部分可带正电荷、中性或带负电荷。
给定氧化还原介体部分及其氧化和/或还原形式的氧化和/或还原的循环可循环发生，使得电子在氧化还原介体部分与另一物质之间反复转移。例如，在氧化还原介体部分在氧化反应中献出电子的情况下，氧化还原介体部分可将其电子献给另外的物质以形成氧化的氧化还原介体部分和还原的另外物质。然后，氧化的氧化还原介体部分可在还原反应中接受来自还原的另外物质的电子，从而再生氧化还原介体部分。在另一示例中，在氧化还原介体部分在还原反应中接受来自另外物质的电子的情况下，氧化还原介体部分可接受来自另外物质的电子以形成还原的氧化还原介体部分和氧化的另外物质。然后，还原的氧化还原介体部分可将电子返回献给氧化的另外物质，以再生氧化还原介体部分。在氧化还原介体部分可容易地献出和接受电子的情况下，两种类型的循环均可发生。在电子于物质间循环的过程中，氧化还原介体部分可从中性变为带负电荷，反之亦然；从带正电荷变为中性，或反之亦然；从带一种正电荷到更高的正电荷(例如，+1到+2)；从带一种负电荷到更高的负电荷(例如，-1到-2)；从带一种正电荷到更低的正电荷(例如，+2到+1)；或者从带一种负电荷到更低的负电荷(例如，-2到-1)。
氧化还原介体部分可包含有机化合物、有机金属化合物、纳米颗粒、一种或多种金属、另一合适的材料及其组合。在一些情况下，各自具有多个氧化还原活性分子的纳米颗粒用作氧化还原介体部分。在一些情况下，氧化还原介体分子是水溶性的，这可有助于其参与水相反应和/或检测方案。
氧化还原介体部分的非限制性示例包括二茂铁衍生物，如烷基二茂铁、乙酸二茂铁、烷基二茂铁二甲基甲酰胺、乙酰基二茂铁、丙酰基(propoyl)二茂铁、丁酰基二茂铁、戊酰基二茂铁、己酰基二茂铁、辛酰基二茂铁、苯甲酰基二茂铁、1,1'-二乙酰基二茂铁、1,1'-二丁酰基二茂铁、1,1'-二己酰基二茂铁、乙基二茂铁、丙基二茂铁、正丁基二茂铁、戊基二茂铁、己基二茂铁、1,1'-二乙基二茂铁、1,1'-二丙基二茂铁、1,1'-二丁基二茂铁、1,1'-二己基二茂铁、环戊烯基二茂铁、环己烯基二茂铁、3-二茂铁基丙酸、4-二茂铁基丁酸、4-二茂铁基丁酸、5-二茂铁基戊酸、3-二茂铁基丙酸酯、4-二茂铁基丁酸酯、4-二茂铁基丁酸酯、5-二茂铁基戊酸酯、二甲基氨基甲基二茂铁、1,1-二羧基二茂铁、羧基二茂铁和乙烯基二茂铁；卟啉衍生物，如氢卟啉、二氢卟酚、菌绿素、异菌绿素、十氢卟啉、corphin、卟啉酞菁、咕啉(pyrrocorphin)以及金属络合卟啉，包括镁卟啉、锌卟啉和铁卟啉；醌衍生物，如2,5-二氯-1,4-苯醌、亚甲蓝、甲基-1,4-苯醌、蒽醌和1,4-二苯酚；1,4-二羟基-2-萘甲酸；以及纳米颗粒，如cds纳米颗粒和zns纳米颗粒。
如本文其他各处所述，氧化还原介体可与核苷酸偶联。氧化还原介体部分可共价或非共价，直接或间接地与核苷酸偶联。在一些情况下，氧化还原介体部分与核苷酸的磷酸基团(例如，末端磷酸或γ-磷酸)连接。在一些情况下，多个氧化还原介体部分可与核苷酸相关联。此外，在一些情况下，核苷酸可包含约2个氧化还原介体部分、约4个氧化还原介体部分、约6个氧化还原介体部分、约8个氧化还原介体部分、约10个氧化还原介体部分、约15个氧化还原介体部分、约20个氧化还原介体部分、约30个氧化还原介体部分、约50个氧化还原介体部分或更多。在一些情况下，核苷酸可与至少约2个氧化还原介体部分、至少约4个氧化还原介体部分、至少约6个氧化还原介体部分、至少约8个氧化还原介体部分、至少约10个氧化还原介体部分、至少约15个氧化还原介体部分、至少约20个氧化还原介体部分、至少约30个氧化还原介体部分或至少约50个氧化还原介体部分相关联。
在一方面，本公开内容提供了用于核酸分子测序的方法。该方法可以包括将模板核酸分子栓系在传感器附近。该方法可进一步包括产生栓系在传感器附近的伸长复合物，其中伸长复合物包含与模板核酸分子相关联的核酸聚合酶以及与模板核酸分子杂交的寡核苷酸(例如引物)。伸长复合物还可包含随后掺入寡核苷酸的核苷酸。该方法可进一步包括使伸长复合物与包含核苷酸的溶液接触，使得与邻近于寡核苷酸位置处的模板核酸分子互补(complimentary)的核苷酸变得与伸长复合物相关联，其中该核苷酸与氧化还原介体部分相关联。该方法可进一步包括当核苷酸与伸长复合物相关联时，用传感器检测氧化还原介体部分。该方法可进一步包括将核苷酸掺入寡核苷酸中，从而从核苷酸释放氧化还原介体部分。可通过一个或多个循环重复本文所述的操作，以对模板核酸分子进行测序。
在一些情况下，多个克隆模板核酸分子栓系在传感器附近。克隆性表面扩增可用于使给定的传感器位点处的模板核酸分子的拷贝数加倍。适用的扩增方法描述于美国专利5,641,658、美国专利公开号2013/0231254a1、美国专利公开号2013/0225421a1、美国专利公开号2013/0281307a1、美国专利公开号2016/0032371a1和美国专利公开号2012/0156728a1，其各自通过引用整体并入本文。
图34a示意性地描绘了克隆扩增的示例过程，有时称为“聚合酶步移”。如图34a所示，单链核酸模板3400可接种到表面3402上(例如，邻近于传感器、在传感器上)，表面3402包含与核酸链的区段(例如，3'区段或5'区段)互补的第一引物3404。可添加聚合酶(例如，链置换聚合酶)3406，并且第一引物3404可在引物延伸反应中延伸，从而合成第一互补链3408。单链核酸模板3400的固定端与表面固定的第一引物3404以及第一引物3404的额外拷贝(在图34a中表示为第二引物3410)处于碱基配对平衡。因此，单链核酸模板3400的固定端可与第一引物3404去杂交并与第二引物3410杂交，使得单链核酸模板3400与第一互补链3408和第二引物3410两者杂交。然后，聚合酶3406在引物延伸反应中延伸第二引物3410，置换第一互补链3408，使得第一互补链3408脱离成为单链。此外，产生与单链核酸模板3400杂交的第二互补链3411。
然后可添加游离引物3412，并与置换的第一互补链3408的非表面固定端杂交，随后通过聚合酶在引物延伸反应中延伸，以产生第三互补链3411。该方案的各个阶段可重复另外的循环，产生原始单链核酸的指数扩增。在核酸分子文库的单链模板核酸分子接种到表面3402的不同区域使得每个区域仅接受平均每个区域至多1个单链模板核酸分子3400的情况下，扩增可以是克隆的，使得表面3402被多个不同的集落覆盖。克隆性的实现是由于在该方案的各个阶段不释放合成的链。在一些情况下，由该方案产生的集落不混杂(例如，生长到彼此之间)，这可允许比泊松接种浓度的核酸模板更好。其上存在核酸的各种克隆集落3416的示例表面3414图示描绘于图34b中。
模板核酸固定在适当接近于传感器或在传感器上的表面上，并且可以是模板核酸分子群体(例如，克隆群体，包括如本文其他各处所述产生的模板核酸分子的克隆群体)的成员。可使用如本文其他各处所述的可逆共价、不可逆共价或可逆非共价偶联将模板核酸固定在表面。非共价偶联的示例包括杂交和结合对相互作用。可使用氧化还原介导的核酸测序来对模板核酸进行测序。在这样的测序方案中，引物可与模板核酸分子结合，并且核酸聚合酶可掺入提供给模板核酸分子的核苷酸，并包括可由传感器检测的偶联的氧化还原介体部分。传感器通过传感器与氧化还原介体部分之间电子的重复交换(例如，献出/接受、氧化/还原)来检测氧化还原介体部分。在传感器处产生并指示这些电子交换的信号由电耦合到传感器的电子组件检测，以确定掺入与氧化还原部分相关联的核苷酸。对模板核酸的许多拷贝的克隆群体进行测序可提供合适的信噪比，因为由于在整个群体中并行掺入氧化还原介体部分可测量更多数量的交换。
在一些情况下，模板核酸分子或模板核酸分子群体单独且依次暴露于一组不同类型的核苷酸(例如，具有碱基a、t或u、c或g的核苷酸)中的每一种，在应用不同类型的核苷酸之间进行洗涤步骤。已知在特定核苷酸与模板核酸或模板核酸分子群体接触的任何给定点，观察到的信号可与该特定核苷酸的掺入相关。在一些情况下，每种不同类型的核苷酸与不同的氧化还原介体部分相关联，其中每种不同的氧化还原介体部分指示与其相关联的核苷酸类型。在其他情况下，两种或更多种不同类型的核苷酸与相同的氧化还原介体部分相关联。在一些情况下，所有不同类型的核苷酸与相同的氧化还原介体部分相关联。在不同类型的核苷酸包含相同的氧化还原介体部分的情况下，用不同核苷酸单独接触允许在暴露于模板核酸分子或模板核酸分子群体的不同核苷酸之间检测相同的氧化还原介体。在任何给定时间仅存在一种核苷酸，并且核苷酸的身份是已知的。
在其他情况下，模板核酸分子或模板核酸分子群体同时暴露于一组不同类型的核苷酸。在这样的情况下，每种类型的核苷酸与不同的氧化还原介体部分相关联。每种不同的氧化还原介体部分可产生可以用于鉴别掺入的特定核苷酸的不同信号。氧化还原介导测序的其他方法可见于美国专利公开号2013/0109577，其各自通过引用整体并入本文。
任何合适类型的传感器可用于氧化还原介导的测序。在一些情况下，表面与传感器相关联或包含传感器。在一些情况下，传感器是纳米间隙电极。纳米间隙电极可具有彼此间隔“扩散距离”的两个电极。在一些情况下，电极间隔约10,000纳米(nm)、约1,000nm、约500nm、约100nm、约50nm、约10nm或约5nm。在一些情况下，电极间隔小于约10,000nm、小于约1,000nm、小于约500nm、小于约100nm、小于约50nm、小于约10nm或小于约5nm。
在一些情况下，传感器包含单个电极，该电极的极性以一定时间间隔切换。在一些情况下，时间间隔为约5纳秒(ns)、约10ns、约50ns、约100ns、约500ns、约1毫秒(ms)、约5ms、约10ms、约50ms或约100ms。在一些情况下，时间间隔为至多约5纳秒(ns)、至多约10ns、至多约50ns、至多约100ns、至多约500ns、至多约1毫秒(ms)、至多约5ms、至多约10ms、至多约50ms或至多约100ms。在一些情况下，时间间隔为至少约5纳秒(ns)、至少约10ns、至少约50ns、至少约100ns、至少约500ns、至少约1毫秒(ms)、至少约5ms、至少约10ms、至少约50ms或至少约100ms。
在一些情况下，表面与多个传感器相关联或包含多个传感器，每个传感器具有栓系的待测序的核酸模板。在一些情况下，表面是传感器的表面。在一些情况下，每个传感器可与模板核酸分子的克隆群体相关联。可存在任何合适数目的传感器，包括约50个传感器、约100个传感器、约500个传感器、约1000个传感器、约5000个传感器、约10000个传感器、约50000个传感器、约100000个传感器、约500000个传感器、约1000000个传感器、约5000000个传感器、约10000000个传感器、约50000000个传感器或更多。在一些情况下，存在至少约50个传感器、至少约100个传感器、至少约500个传感器、至少约1000个传感器、至少约5000个传感器、至少约10000个传感器、至少约50000个传感器、至少约100000个传感器、至少约500000个传感器、至少约1000000个传感器、至少约5000000个传感器、至少约10000000个传感器、至少约50000000个传感器或更多。在一些情况下，每个传感器是单独可寻址的(即，能够单独控制和/或提供单独的信号)。
在一些情况下，除了模板核酸分子或模板核酸分子群体之外，在测序期间用于核苷酸掺入的聚合酶也结合至表面或传感器，使得核苷酸的掺入发生在更接近传感器处。聚合酶可以共价或非共价结合至表面或传感器。例如，通过结合对(例如，生物素/链霉亲和素)的成员的结合，可实现非共价结合。可用该对中的一个成员修饰表面或传感器，并用该对中的另一个成员修饰聚合酶。该对的两个成员的结合将聚合酶栓系到表面或传感器。此外，聚合酶与表面或传感器的结合有效地将包含聚合酶、测序引物和待掺入核苷酸的伸长复合物栓系在传感器附近。更接近的伸长复合物定位将与伸长复合物的核苷酸相关联的氧化还原介体部分定位成更接近传感器。氧化还原介体部分更接近传感器可改善两种物质之间的电子转移，从而导致测序期间更准确和/或更灵敏的信号检测。在一些情况下，在形成伸长复合物之前，将伸长复合物的成员(例如，聚合酶)栓系到表面或传感器。在一些情况下，在形成伸长复合物之后，将伸长复合物的成员(例如，聚合酶)栓系到表面或传感器。
核苷酸可与伸长复合物(栓系的或游离的)相关联达任何适当的时间段。在一些情况下，可用于检测的时间段为约5毫秒(ms)、约10ms、约50ms、约100ms、约1000ms或约5000ms。此外，可用于检测的时间段可根据例如是否使用栓系聚合酶/伸长复合物、进行测序的特定模板等而变化。在一些情况下，可用于检测的时间段为至少约5毫秒(ms)、至少约10ms、至少约50ms、至少约100ms、至少约1000ms或至少约5000ms。在一些情况下，可用于检测的时间段为约10至约500毫秒(ms)。
图35示意性地描绘了示例氧化还原介导的测序方法。参考图35，在与传感器3502相关联的表面(例如，接近于传感器3502的表面、传感器3502的表面)上提供待测序的固定模板核酸3500。为简单起见，仅示出模板核酸3500的单个拷贝，但可存在多个拷贝，包括至少约10个拷贝、至少约100个拷贝、至少约1000个拷贝、至少约10000个拷贝、至少约100000个拷贝或至少约1000000个拷贝。引物3504在模板核酸3500相对于传感器的远端处(如图所示)、在近端处或在远端与近端之间的任何点处与模板核酸3500杂交。然后使结合的引物-模板复合物与聚合酶接触，该聚合酶可与结合对的第一成员3508相关联，诸如生物素-链霉亲和素结合对的一个成员。模板核酸3500、聚合酶3506和引物3504形成伸长复合物3512，其在一些情况下可包含额外的辅因子。
用结合对的第二成员3510修饰表面，如未与聚合酶结合的生物素-链霉亲和素结合对的另一成员。通过模板核酸3500及其相关的伸长复合物的运动，聚合酶3506通过其第一成员3508与第二成员3510结合，并且定位在传感器3502附近。或者，聚合酶3506与表面的栓系可用其他非共价策略实现，或者可共价实现。聚合酶3506与表面的栓系将伸长复合物定位在传感器3502附近，使得当与氧化还原介体部分相关联的核苷酸被伸长复合物结合时，氧化还原介体部分非常接近于传感器3502并在传感器3502附近聚集。
在形成伸长复合物的栓系(其可导致如图35所示的模板核酸3500的环化)之后，模板核酸分子和相关联的伸长复合物可与包含与氧化还原介体部分3516相关联的特定类型的核苷酸3514的单独的、顺序的溶液相接触。对于每种溶液，核苷酸在适当的时候结合，并且在洗涤以去除未结合的核苷酸后可通过传感器3502测量任何核苷酸掺入，并且用下一种核苷酸溶液重复该过程。重复该循环，直至模板核酸3500被测序。如图35的示例中所示，核苷酸3514(例如，处于核苷三磷酸形式(dntp))通过接头与氧化还原介体部分3516偶联。在一些情况下，氧化还原介体部分3516与核苷酸3514的末端磷酸连接，并在核苷酸3514掺入时释放。然后，氧化还原介体部分3516一旦释放3520就远离传感器3502扩散。
实施例
实施例1.用于油包水乳化的油相的制备。
可使用在水中制备的油相来制备乳液。油包水乳液的油相可通过混合4.007g(12.2wt％)来自sigma-aldrich的轻质矿物油、4.802g(14.6wt％)来自evonik的abilwe09和24.0g(73.2wt％)来自evonik的tegosoftdec来制备。
实施例2.油包水乳液的制备。
油包水乳液可用以下两步法制备。首先制备微乳液。将1ml“实施例1”中所述的油相移液到2毫升(ml)聚丙烯螺旋盖管中。向相同的管添加100微升(μl)的te，ph8(10mmtris(用hcl调节至指定的ph)和1mmedta)，并使用mini-beadbeater以1680次振荡/分钟乳化1分钟。在第二步中，制备所谓的粗滴(crude)乳液。将300μl的te，ph8移液至先前产生的微乳液，并使用以下的mini-beadbeater设置进行乳化：1000次振荡/分钟，持续30秒。
实施例3.使用障碍物阵列的乳化。
引导乳液通过障碍物阵列可实现液滴大小的控制。使用障碍物阵列进行乳化的示例如图16a-图16d所示。障碍物阵列具有圆形障碍物(直径40μm，高40μm，行内偏移80μm，行间偏移60μm)。使用注塑生产微流体芯片。部分铜模具如图16a所示。图16b示出了注塑的聚丙烯部件。评估障碍物阵列的有效性。图16c示出了通过对300μl水相(15mmtris缓冲液，ph8、60mm乙酸钾、3.3％peg3500)和700μl油/表面活性剂混合物(73.2％tegosoftdec、14.6％abilwe09、12.2％轻质矿物油)进行四次脉冲的涡旋(设置8)产生的原始乳液。通过光学显微镜验证了大小非常不均匀的较大乳液液滴的形成。图16d示出了通过障碍物阵列处理后的原始乳液。引导原始乳液通过障碍物阵列的压力为40磅/平方英寸(psi)的压力。通过光学显微镜测量障碍物阵列的性能。
实施例4.破坏/破碎油包水乳液的有机溶剂的筛选。
乳液可通过使用破坏剂进行破坏。如表1所示，筛选各种与水混溶的有机溶剂以破坏/破碎油包水乳液，以便获得澄清的溶液，可从中分离磁珠并用水性介质洗涤。为了获得均匀的澄清溶液，将溶液在50℃下加热。在“破坏/破碎”溶剂中添加吐温20，尤其是三甘醇，可排除加热，并在混合后立即产生均匀的澄清溶液，如表2所示。使用三甘醇的另一个优点是其低蒸气压及其无臭无毒的特性。
表1.油相可混溶的水混溶性有机溶剂的筛选。
表2.吐温20破坏/破碎油包水乳液的效果。
实施例5.十二烷基硫酸四丁基铵(tbads)的制备。
一种破坏剂是四丁基铵(tbads)。为了制备tbads，将13.1g(～13.0ml或1.7meqx13＝22meq)的dowex50wx8氢型填充到色谱柱(1.3cmid，20cm长度)中。用～50ml的去离子水冲洗柱，直至洗脱液的ph值达到ph5.5(初始ph≤4)。将十二烷基硫酸钠(sds)以2.0227g(7.0毫当量，即7.01毫摩尔(mm))sds与5毫升(ml)去离子(di)水的比例溶解在去离子水中。将sds溶液转移到柱中并用50ml去离子水洗脱。洗脱液的最终ph值为5.5，合并的洗脱液的ph值为2.5。向十二烷基硫酸洗脱液逐滴添加45％四丁基氢氧化铵，直至ph值达到7(～4.3ml)。反应溶液通过旋转蒸发进行浓缩，随后冷冻干燥，在环境温度下得到3.0g(5.9mmol，84％产率)的粘性透明油状物。
实施例6.使用三甘醇/tbads破坏油包水乳液。
破坏油包水乳液和使酶失活的常规方法使用四个步骤。期望将四个步骤组合成单个步骤过程。由于sds不溶于非水溶剂，因此将其转化为四丁基铵盐(tbads)可能是有用的。tbads在三甘醇和油相中可混溶(参见实施例4)。如表3所示，通过混合三甘醇、吐温20和tbads来制备tbads破坏/破碎介质。表3中的第3和第4项在涡旋5秒后立即得到均匀的澄清溶液。
表3.使用新的tbads破坏/破碎介质破坏油包水乳液。
实施例7.验证——从破碎的油包水乳液获得的扩增磁珠的测试。
可根据表4制备含tbads的乳液破坏介质。磁珠上的乳化和限制性重组酶聚合酶扩增可通过形成微乳液、组装扩增反应、形成产生限制性扩增反应液滴的粗滴乳液、乳液的扩增和温育、含有扩增珠子的乳液的离心、以及去除上清液(透明油相)来进行。使用以2-丁醇作为基准，并使用含tbads的乳液破坏介质，按照常规方法破破坏乳液。将400μl含tbads的乳液破坏介质的等分试样添加至乳液/珠子混合物。涡旋～30秒后，通过添加600μl的tris乙二胺四乙酸(te)缓冲液ph8来稀释混合物。在另外的涡旋步骤和在台式微型离心机中短暂旋转后，使用磁体收集珠子。最终将在螺旋盖管的侧壁处形成磁珠沉淀。此时，去除并丢弃整个上清液。用1mltet(10mmtris(用盐酸调节至指定的ph8)、1mm乙二胺四乙酸(edta)和0.05％tritonx-100)洗涤珠子。使用流式细胞仪测定评估珠子纯度和工作流性能。基于流式细胞仪数据(表5)，与基准2-丁醇破坏程序相比，用含tbads的介质破坏乳液不改变性能。
表4.含tbads的乳液破坏介质。
表5.含tbads的乳液破坏介质的验证。
实施例8：15个碱基引物缀合的支撑物的制备
在包含出口和入口端口的组装室内进行15个碱基引物缀合的支撑物的制备。最初通过用从洗瓶注入的过量去离子(di)水、甲醇和异丙醇的冲洗来清洁支撑物。冲洗后，将支撑物在环境温度下在定轨振荡器上浸入溶于异丙醇中的0.3m氢氧化钠(naoh)的等分试样达30分钟。去除naoh-异丙醇溶液，引入0.3mnaoh的异丙醇溶液的新鲜等分试样，并在环境温度下在定轨振荡器上再温育30分钟，然后用过量的去离子水、异丙醇冲洗，并用氮气吹干。支撑物通过在环境温度下在定轨振荡器上与溶液包含3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷在无水乙腈中的2％溶液的等分试样一起温育30分钟而进行甲硅烷基化。去除硅烷溶液后，引入新鲜的等分试样，并再温育30分钟，然后用乙腈冲洗并用氮气吹干。将支撑物在60℃的加热板上加热2分钟。聚合物接枝通过在环境温度下在定轨振荡器上将甲硅烷基化的支撑物与包含1:1(或4:1)摩尔比的聚(二甲基丙烯酰胺-共-五氟苯基丙烯酸酯)在含有0.5％w/v三丁胺的乙腈中0.5％w/v溶液的等分试样一起温育60分钟来进行。在聚合物接枝后，用乙腈和去离子水冲洗支撑物。引物缀合通过在环境温度下在定轨振荡器上将聚合物接枝的支撑物与包含15％w/v的15碱基引物的钠盐和1.5％w/v的三乙胺的等分试样在去离子水中的溶液一起温育18小时来进行。缀合后，用tris-edta-triton(tet)缓冲液(含有0.1％tritonx-100的tris-edta(te)缓冲液)、te缓冲液和退火缓冲液冲洗支撑物。支撑物在4℃下与储存缓冲液(含有0.05％tritonx-100和0.01％叠氮化钠的1xte缓冲液)一起储存。
实施例9：杂交-去杂交(hyb-dehyb)测定对引物负载的确定
使用hyb-dehyb测定来确定引物负载。测定首先通过用2x150μl的退火缓冲液洗涤支撑物并用氮气吹干来进行，该支撑物位于包含出口和入口的室内。在洗涤后，将支撑物与5mmfamanti-b的20μl等分试样在70℃下一起温育2分钟，然后将样品在黑暗中冷却至环境温度达2分钟。去除残留的famanti-b溶液，用2x100μltet缓冲液(10mmte缓冲液加0.1％tritonx-100，ph8)冲洗支撑物，然后用2x100μl的10mmte缓冲液ph8冲洗支撑物。去除残留的缓冲液，并将200μl移液管端头插入室的出口端口。使用200μl移液管端头将10μl新鲜制备的100mm氢氧化钠的等分试样通过室的入口分配到室中，确保室没有气泡，并且入口保持被移液管端头插入。将支撑物温育1.5分钟，通过入口端口取回100mmnaoh溶液，并分配到30μl的3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)的0.3m水溶液中。10μl的100mmnaoh的注射再重复三次，每次将100mmnaoh冲洗液分配到相同的30μl的0.3mmops溶液中，得到四份100mmnaoh冲洗液的10μl等分试样与一份0.3mmops的30μl等分试样的混合物。向该混合物添加130μl的10mmte缓冲液，得到200μl的总体积。样品在qubitaf488中运行，并读取绿色相对荧光单位(rfu)数。使用先前建立的校准，可确定15碱基引物的量。用10mmte缓冲液冲洗室，以确保残留的naoh已被去除。
实施例10：聚合物/引物涂层的fam-picogreen可视化
聚合物/引物涂层可使用fam-picogreen可视化。根据实施例10中所述的方案，可首先通过将famanti-b杂交到15碱基引物进行可视化。然后用tet缓冲液冲洗室。冲洗后，将4μl的picogreen溶液(原始picogreen试剂在te中的100倍稀释)注入室中进行3次，在黑暗中温育2分钟。然后用400μl负载缓冲液充满室，并拍摄荧光显微照片。在成像后，冲洗室，并用移液管移除tet缓冲液。在移除负载缓冲液后，用50μl等分试样的100mmnaoh溶液将室浸泡2分钟，用过量的tet缓冲液冲洗，用储存缓冲液充满，并在4℃储存在水蒸气饱和的容器中。
实施例11：来自fam-picogreen可视化的荧光显微照片
来自fam-picogreen可视化的荧光显微照片可用于确定引物负载密度。示例荧光显微照片示于图31a和图31b中，其示出了根据实施例9中概述的程序进行表面改性并具有用于在与15个碱基引物缀合之前进行偶联的0.5％w/v的聚合物的支撑物的fam-picogreen荧光显微照片。将picogreen嵌入剂应用于fam-anti-b杂交的引物，并用落射荧光显微镜和对应于绿色荧光的滤光体进行成像。成像后进行杂交-去杂交(hyb-dehyb)测定，以确定表面上的引物负载密度。图31a和图31b示出，引物缀合化学在碱性条件下相对稳定。用1.0mnaoh溶液冲洗引物缀合的支撑物未导致引物密度的显著变化，该密度在冲洗后从2.69e+05降低至2.05e+05个引物分子/μ2。
实施例12：n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)与五氟苯基丙烯酸酯(pfpa)的反应性共聚物的制备
n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)和五氟苯基丙烯酸酯(pfpa)的反应性共聚物可以以各种摩尔比制备，以下程序适用于制备各种摩尔比的反应性共聚物。反应性共聚物作为接头通过酰胺键的形成将生物分子(例如，dna引物)共价连接到支撑物的氨基甲硅烷基化表面。聚合容器包括三颈500ml圆底烧瓶、配有2"teflon搅拌叶片、24/40至14/20磨口玻璃转接器、14/20水冷却冷凝器、用于14/20和24/40接头的橡胶隔膜、一个用于氮气吹扫的12"18号ss注射器针头，以及一个用于排放到矿物油鼓泡器中的2"18号ss注射器针头。向聚合烧瓶装入30ml无水乙腈、4.34g(43.77mmol)n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)、10.41g(43.73mmol)五氟苯基丙烯酸酯(pfpa)和0.010g(0.040mmol)vazo-52的等分试样。反应混合物在环境温度下通过超纯氮气温和鼓泡以约60ml/min吹扫30分钟，以125rpm持续搅拌，然后将反应烧瓶浸入55℃的油浴中达19小时，伴随流速为～15-20ml/min的超纯氮气鼓泡和120rpm下的持续搅拌。在19小时结束时，反应混合物高度粘稠。溶剂用rota蒸发器在60℃的水浴温度下持续60分钟来去除，得到固体聚合物。将聚合物产物重新溶解在30ml无水四氢呋喃(thf)中。在持续搅拌下逐滴添加20ml正己烷，使溶液变为乳状。将thf/己烷混合物中的聚合物以细流添加到在氮气覆盖下的2l玻璃锥形瓶中的1000ml正己烷中，同时在teflon搅拌轴上用2”teflon搅拌叶片剧烈搅拌。沉淀后，在氮气覆盖下将聚合物再搅拌10分钟，弃去上清液。向沉淀的聚合物添加500ml新鲜的正己烷，并温和搅拌10分钟。将沉淀的聚合物再溶解于30mlthf中，然后从正己烷中第二次沉淀，并用过量的正己烷洗涤。然后将聚合物转移到大口径的500ml玻璃瓶中，并在60℃下真空干燥24小时，得到9.90g聚(dma-共-pfpa)，产率为82.5％。
实施例13：支撑物上扩增
扩增反应可通过首先用条状缓冲液，然后用洗涤缓冲液，然后用退火缓冲液洗涤支撑物而在支撑物上进行。在退火缓冲液中注入给定浓度的接种模板，参见图26c。在70℃下通过将支撑物温育10分钟，然后在环境空气中冷却至室温来使模板退火。退火后，用高盐缓冲液洗涤支撑物。洗涤后，将包含侵入性扩增蛋白质混合物、0.5μma15溶液引物、1.6μm侵入物ib和1mmdntp的扩增混合物注入支撑物室中，并在42℃下温育30分钟。扩增后，将支撑物进行广泛洗涤，剥离补体dna链，并测试支撑物的模板负载。条状缓冲液包含100mmnaoh、0.05％tritonx-100。洗涤缓冲液包含teph8.0、0.05％tritionx-100。退火缓冲液包含teph8、100mmnacl、0.05％tritionx-100。高盐缓冲液包含teph8、500mm氯化钠(nacl)、0.05％tritionx-100。
实施例14：测序引物与核酸模板的退火和聚合酶结合
测序前，测序引物可与核酸模板退火，然后进行聚合酶结合。为了使测序引物退火，首先用100mmnaoh处理支撑物，以便去除扩增后存在的任何互补结合链。这通过用5μl新鲜制备的100mmnaoh处理支撑物两次达2分钟，然后用0.3mmops溶液洗涤，然后用te缓冲液洗涤来完成。然后用100μl退火缓冲液将支撑物洗涤两次。测序引物溶液包含在退火缓冲液中的最终浓度为15μm的测序引物。对于每种支撑物，制备12μl的测序引物溶液。首先用4μl的测序引物溶液洗涤支撑物，然后用不留下粘合剂残留物的胶带覆盖支撑物表面以防止蒸发，并在50℃下温育。总温育时间为在50℃下20分钟，并在0分钟、7.5分钟和15分钟时引入4μl测序引物溶液，溶液的引入在室的入口和出口之间进行交替进行。在用于测序引物结合的替代方案中，使用200μl移液管端头将15微摩尔(μm)测序引物的20μl溶液引入芯片入口，而在出口处存在200μl移液管端头。芯片在70℃下温育10分钟，然后使用空气冷却至室温。在20分钟的测序引物退火后，用100μl的te缓冲液将支撑物洗涤3次，以去除任何未结合的引物。然后用20μl的1x等温扩增缓冲液(iso)将支撑物洗涤两次，从入口端口和出口端口各一次。聚合酶温育在1xiso溶液中进行，最终bst2浓度为36单元/μl，起始为120,000单元/ml的原始bst2溶液。每种支撑物使用12μl的聚合酶溶液，聚合酶溶液在0分钟、7.5分钟和15分钟在入口和出口之间交替引入，总温育时间为20分钟。
实施例15：测序和径流实验
测序可在支撑物上进行，以读取感兴趣的核酸序列或检测感兴趣的核酸模板的扩增。检测模板扩增的最简单方法是进行“径流”实验，其中制备单核苷酸瓶，使得其含有盐缓冲液b1(3mm氯化镁(mgcl2)、3mm三(羟甲基)氨基甲烷(tris)ph8、0.01％triton)中的每种dntp100μm，即总dntp400μm。在引入核苷酸之前和引入核苷酸之后进行电子阻抗测量。观察到的阻抗变化对应于核苷酸的掺入和测序引物的延伸。类似地，测序可由在不同的瓶中单独引入每种100μm的核苷酸并在引入核苷酸之前和之后测量阻抗来进行。在一些示例中，核苷酸的浓度小于或大于100μm。阻抗信号的足够大的变化对应于在特定传感器位置处掺入特定核苷酸。
实施例16：引物粘附的传感器电测量
除了hyb-dehyb和picogreen可视化之外，引物缀合可通过引物添加之前和之后的电测量来验证。聚合物添加、引物添加和生物反应改变了传感器周围介质的电特性，并产生可测量的信号。
实施例17：通过丙烯酰氧基甲硅烷基化对支撑物表面的表面活化
为了促进聚合物材料与支撑物的偶联，可用丙烯酰氧基甲硅烷基化来活化支撑物表面。通过用表面数字化的金电极在0.1％tritonx-100溶液中对玻璃支撑物超声处理15分钟进行活化。然后用去离子水冲洗支撑物并在110℃下干燥。将清洁的载玻片在rca1/rca2中超声处理15分钟，用过量的去离子水冲洗，并储存在去离子水下直至使用。使用前将支撑物在110℃下干燥5分钟。向50ml的95％乙醇(etoh)添加16.6μl的1.0m乙酸(acoh)。ph为4.5-5.0。向酸化的etoh添加1.25ml的3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，并在环境温度下通过旋转混合2分钟。将预处理的支撑物浸入甲硅烷基化试剂中10分钟，伴随偶尔搅拌。移取支撑物，用95％乙醇快速冲洗，并用氮气吹干。将支撑物在110℃下退火2分钟。在一些实施方案中，3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷可被3-丙烯酰氧基丙基二甲基乙氧基硅烷取代。该技术可适用于有或无数字化电极的硅和玻璃基底。
实施例18：用作释放物的玻璃盖玻片的氟甲硅烷基化
在聚合过程中可以使用氟甲硅烷基化的玻璃盖玻片，以防止聚合物产品粘附至盖玻片。如实施例18所述，氟甲硅烷基化通过预处理玻璃盖玻片来进行。预处理后，在聚丙烯50-mlfalcon管中制备1.25ml(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三甲氧基硅烷在50ml95％乙醇中的溶液。通过添加16.6μl的1.0macoh调节并通过旋转混合2分钟来调节溶液的ph。将预处理的玻璃盖玻片浸入甲硅烷基化溶液中10分钟，伴随偶尔搅拌。移取玻璃盖玻片，用95％乙醇快速冲洗，并用氮气干燥。氟甲硅烷基化玻璃盖玻片在110℃下固化10分钟。
实施例19：预聚物溶液和多孔聚合物整料(ppm)的聚合
使用预聚物溶液进行多孔聚合物整料(ppm)的聚合。预聚物溶液包含1995mg丙烯酸五氟苯酯、365mg二乙烯基苯、19.7mg二苯甲酮和19.3mg4-(二甲基氨基)苯甲酸乙酯。如实施例18所示，将该预聚物溶液与十五烷以1:1v/v的比例混合，然后分配到丙烯酰氧基硅烷活化的基底表面。将实施例18中制备的氟化盖玻片放置在预聚物上，氟化表面向下，形成薄层。将组件暴露于紫外(uv)光下进行聚合。聚合后，去除氟化盖玻片，用过量的十五烷洗涤ppm薄膜，并用氮气吹干。
实施例20：含有水凝胶的brapa的聚合和引物缀合
含有水凝胶的brapa的聚合首先用甲醇，然后用1nnaoh，最后用去离子水洗涤支撑物来进行。洗涤后，将支撑物用氮气干燥并置于室中。将3.3w/w％丙烯酰胺、0.33w/w％brapa、0.1w/w％过硫酸铵和0.23w/w％四甲基乙二胺的溶液注入室中，并在环境温度下温育90分钟。然后用水洗涤支撑物，并在环境温度下与新还原的硫代苯甲酸化引物的二甲基亚砜溶液一起温育。缀合后，支撑物用水洗涤并与猝灭溶液如乙酸钾溶液一起温育。
实施例21：用于hyb-dehyb测定的薄层细胞
hyb-dehyb测定在薄层细胞中进行。图32示出了用于hyb-dehyb测定的薄层细胞的构建，以测量杂交到ppm结合的dna引物的hp1的量。使用硅胶垫片(biorad框架密封温育室，体积为265μl，1.5mmx17mmx28mm)制作流动池。将三个矩形垫片彼此上下重叠置于在显微镜载玻片和柔性塑料盖玻片之间。使用注射器和27号不锈钢注射器针通过1.5mm厚的垫片添加试剂以进行hyb-dehyb测定，并提取去杂交产物。
实施例22：检测ppm上表面杂交的hp1寡核苷酸
表面缀合寡核苷酸的量可使用hyb-dehyb测定进行检测。图33示出了hyb-dehyb测定通过qubit对在ppm薄膜上杂交的hp1寡核苷酸的量的测量的结果。具有玻璃支撑物、ppm聚合物薄膜和表面杂交dna模板寡核苷酸的薄层细胞与“hp1”模板特异性荧光fam探针进行退火。将退火缓冲液中的100μl2umfam探针退火与寡核苷酸模板退火，使用的退火方案包括将温度提高至95℃，然后缓慢缓降至25℃。然后用te缓冲液将薄层细胞洗涤三次，以去除非特异性结合的探针，然后用水洗涤。最后，将结合的探针与100mmnaoh一起温育来提取，进行两次温育，每次～12.5μl进行2分钟。洗脱溶液用15μl的0.3mmops溶液中和，然后添加160μl的te缓冲液。荧光值使用qubit读取器测量。普通支撑物和仅聚合物支撑物显示与背景相当的荧光水平，而“hp1”寡核苷酸支撑物显示较高荧光，表明特异性模板杂交。
实施例23：氧化还原介导的测序
氧化还原介导的核酸测序的示例系统描述如下。该系统包括纳米间隙电极和在其γ磷酸上携带一个或多个氧化还原介体部分的四种核苷酸三磷酸(a、g、t或c)之一。一个或多个氧化还原介体部分通过10nm接头与γ磷酸连接。如本文所述，测序(例如，合成测序)通过借助聚合酶的作用将四种核苷酸三磷酸掺入模板核酸的循环而进行。在α-β磷酸键断裂(和核苷酸单磷酸掺入)之前，同源核苷酸三磷酸与起始复合物结合10-500毫秒(ms)。在此期间，氧化还原介体部分多次扩散到纳米间隙电极(例如，如果扩散时间为20纳秒(nsec)，则扩散约1000次)，产生1,000个氧化还原循环，并且每个介体转移1,000个电子(例如，通过氧化还原循环进行1,000次扩增)。模板核酸分子的每个集落含有10,000个模板链，转移的总电子数目约为1000万或约1.7皮库(pc)。电子转移发生在20ms的时间段内并且产生的电流脉冲幅度为83皮安(pa)。电流脉冲可随氧化还原介体部分的数目而缩放。例如，如果核苷酸三磷酸携带10个氧化还原介体部分，则生成的电流脉冲为830pa。三磷酸断裂后，焦磷酸(携带氧化还原介体部分)从表面扩散，从而终止信号生成。
本公开内容的装置、方法和系统可与其他装置、系统和/或方法组合，或通过它们进行改进，例如，pct专利申请号pct/us2011/054769、pct专利申请号pct/us2012/039880、pct专利申请号pct/us2012/067645、pct专利申请号pct/us2014/027544、pct专利申请号pct/us2015/020130、pct专利申请号pct/us2015/026135和美国专利号9,399,217描述的那些，所述申请中的每一个均通过引用整体并入本文。
尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将会显而易见的是，这样的实施方案仅以示例的方式提供。本发明并不旨在限于说明书中提供的具体示例。尽管已经参考上述说明书描述了本发明，但本文实施方案的描述和说明并不意味着以限制性意义解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，而是取决于多种条件和变量。应当理解，在实践本发明的过程中可采用对本文所述发明的实施方案的各种替代方式。因此设想，本发明还应当涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并从而涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
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