单核苷酸检测方法及相关的探针与流程
遗传物质的下一代测序已经总体上对生物科学和特别是对药物产生了重大影响，因为测序的单位成本与越来越快的测序机器的上市相关。
在我们先前的申请wo2014/053853、wo2014/053854、wo2014/167323、wo2014/167324和wo2014/111723中，我们已经描述了一种新的测序方法，其涉及逐步消化多核苷酸分析物以产生有序的单核苷酸流，优选单核苷三磷酸流，其中每个都可以逐个地被捕获到微滴流中的相应液滴中。此后，可以对每个液滴进行化学和/或酶促操作以显示其最初包含的特定单核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶促操作包括涉及使用一种或多种双组分寡核苷酸探针类型的方法，每种探针类型适于能够选择性地捕获构成分析物的单核苷酸类型之一。通常，在每种这样的探针类型中，两种寡核苷酸组分中的一种包含特征荧光团，并且在探针的未使用状态下，这些荧光团发荧光的能力由于存在靠近的猝灭剂或通过自猝灭而保持消失。在使用中，当探针捕获其相应的单核苷酸时，使其易于随后的核酸外切，从而从猝灭剂和/或彼此释放荧光团使其能够自由发荧光。通过这种方式，每个液滴中存在的原始单核苷酸可以通过光谱手段间接推断。
该方法的变体已在我们的其他待审批申请中描述，包括wo201405385和wo2016012789；后者涉及使用三组分探针系统。特别地，wo2016012789描述了一种改进的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过逐步消化核酸产生单核苷三磷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下使至少一个单核苷三磷酸与相应探针系统反应，产生至少一个基本上双链的寡核苷酸占用探针，该探针系统包含(a)用例如特征荧光团标记的不可检测状态的第一单链寡核苷酸和(b)能够与第一寡核苷酸上的互补区杂交的第二和第三单链寡核苷酸；(3)用具有双链核酸外切活性的酶消化占用探针以产生可检测状态的荧光团和至少部分是第一寡核苷酸的互补序列的单链第四寡核苷酸；(4)使第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸反应，产生对应于占用探针的基本上双链的寡核苷酸产物；(5)在一个循环中重复步骤(3)和(4)；和(6)检测在步骤(3)的每次重复中释放的荧光团。该方法的优点在于，通过在一个循环中重复步骤(3)和(4)，可以使荧光信号强烈增强，从而提高整体灵敏度，因此提高核苷酸检测的可靠性。在一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸相连，这使得在核苷酸捕获后，它们形成闭环单链寡核苷酸组分，其有利地抵抗核酸外切。
关于其他现有技术，fan等人在naturereviewsgenetics7(8)632-644(2006)中提供了对能够进行用于基因分型、拷贝数测量、测序以及检测杂合性缺失、等位基因特异性表达和甲基化的高度平行基因组测定的方法和平台的进展的综述。该综述的图2a示意性地显示了具有3′和5′末端的可环化探针的使用，其使分析物上单核苷酸多态性(snp)位点的上游和下游退火，从而留下随后利用作为所述snp的互补序列的核苷酸填充的缺口，从而形成完整的环状探针，其可以在释放后进行扩增。然而，与我们的方法不同，在填充过程中捕获的核苷酸不是直接从分析物本身获得的。
wo03080861公开了一种方法，其中核酸分析物在核苷酸特异性反应性标记存在下经历逐步焦磷酸解，所述标记物在释放时直接附着于所诉核苷酸。这不仅与我们采用的方法完全不同，而且在实践中，当标记的核苷酸随后被检测时测量的荧光信号可能太弱而不能在相关的背景噪声之上进行可靠的识别。
最后，wo9418218教导了一种dna测序方法，其中分析物经历逐步核酸外切以产生单核苷酸二磷酸或单核苷酸单磷酸流，然后在检测前将其加入荧光增强基质中。这不仅是我们描述的方法完全不同的方法，而且我们再次发现，所产生的任何信号可能太弱而无法可靠地检测和识别。
我们现在发明了一种产生更强荧光信号的改进方法，该方法适用于使用我们先前描述的基于液滴的测序仪。因此，根据本发明，提供了一种对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过逐步酶消化核酸生成单核苷三磷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下，使至少一个单核苷三磷酸与相应的初级探针反应，产生至少一个基本上双链的初级寡核苷酸占用探针，所述初级探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包含限制性核酸内切酶切口位点、用于捕获所述单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点和并置于所述捕获位点任一侧的寡核苷酸侧翼区，和(b)能够与第一寡核苷酸侧翼区杂交的第二和第三单链寡核苷酸；(3)用切口限制性核酸内切酶在切口位点切割占用的初级探针的第一寡核苷酸链，以产生分离的第一寡核苷酸组分；(4)将步骤(3)中产生的第一寡核苷酸组分与占用探针的互补链分离；(5)通过在连接酶存在下使至少一个分离的第一寡核苷酸组分与相应的二级探针反应产生至少一个基本上双链的二级占用探针，所述二级探针包含(c)带有基本上不可检测状态的荧光团的互补第四寡核苷酸，和任选的(d)与第四寡核苷酸至少部分互补的单链第五寡核苷酸；(6)用具有双链核酸外切活性的酶消化占用的二级探针以产生可检测状态的荧光团和至少部分为第四寡核苷酸的互补序列的单链第六寡核苷酸；和(7)检测步骤(6)中释放的荧光团。
在一个优选的实施方案中，步骤(4)中释放的占用探针的互补链与第一个寡核苷酸的另一个分子反应，因此步骤(3)和(4)在第一循环中重复以显著增加在步骤(7)中释放的用于检测的荧光团的数量。在另一个实施方案中，步骤(6)中产生的第六寡核苷酸与第四寡核苷酸的另一分子反应，然后重复步骤(6)以产生第二循环。优选地，本发明的方法包括重复第一和第二循环。
本发明方法的步骤(1)包括通过逐步酶消化从核酸分析物产生单核苷三磷酸流。在一个实施方案中，这可以通过分析物的逐步核酸外切和随后激酶对获得的单核苷一磷酸的作用来实现(参见例如bao和ryu，biotechnologyandbioengineeringdoi10.1002/bit(2007年5月))。在另一个实施方案中，步骤(1)包括通过逐步焦磷酸解直接从分析物产生单核苷三磷酸流。在该步骤中合适地使用的分析物是双链多核苷酸，其长度原则上可以是无限制的；例如，包括在人类基因或染色体片段中发现的数百万个核苷酸对。然而，通常多核苷酸的长度至少为50，优选至少150个核苷酸对；合适地，其大于500，大于1000并且在许多情况下长数千个核苷酸对。分析物本身优选是天然来源的rna或dna(例如源自植物、动物、细菌或病毒)，尽管该方法也可用于对合成产生的、完全或部分地组成核苷酸的rna或dna或其他核酸进行测序，其中所述核苷酸的核碱基在自然界中通常不会遇到，即除腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)以外的核碱基。这种核碱基的实例包括4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、2-o-甲基胞苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2-o-甲基假尿苷、2-o-甲基鸟苷、肌苷、n6-异戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、n6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺苷、尿苷-5-羟基乙酸-甲酯、尿苷-5-羟基乙酸、wybutoxosine、怀丁苷(wybutosine)、假尿苷，q苷(queuosine)、2-硫胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、2-o-甲基-5-甲基尿苷和2-o-甲基尿苷。在dna的情况下，产生的单核苷三磷酸是脱氧核糖核苷三磷酸，而在rna的情况下它们是核糖核苷三磷酸。
在该方法的一个实施方案中，步骤(1)还包括将分析物附着到基质上的第一子步骤。通常，该基质包括微流体表面、微珠或可渗透膜，例如，由玻璃或不可降解的聚合物制成的基质。优选地，基质还包括特别适于接收分析物的表面。有许多方法可以将分析物附着到这样的表面上，其中原则上任何一种都可以用在这个子步骤中。例如，一种涉及用官能化硅烷(例如环氧硅烷、氨基烃基硅烷或巯基硅烷)清洁玻璃表面的方法。然后可以用分析物的衍生物处理如此产生的反应位点，所述分析物的衍生物被修饰以包括末端胺、琥珀酰基或硫醇基。
在步骤(1)的另一个实施方案中，将分析物焦磷酸解以产生单核苷三磷酸流，其顺序对应于分析物序列的顺序。这种焦磷酸解可以在20-90℃的温度下进行；例如，在包含合适聚合酶的反应介质存在下。优选地，它在连续流动的条件下进行，以便在单核苷三磷酸被释放时被连续地从反应区中除去。最优选地，通过使含有酶和其它典型添加剂的含水缓冲介质连续流过分析物所结合的表面来进行焦磷酸解。
在另一个实施方案中，所用的酶是能够引起分析物的逐步3′-5′焦磷酸解降解以产生具有高保真度和合理反应速率的核苷三磷酸流的酶。优选地，降解速率尽可能快，并且在一个实施方案中，其为每秒1-50个核苷三磷酸。
关于应用于多核苷酸消化的焦磷酸解反应的进一步信息可以在例如j.biol.chem.，244(1969)第3019-3028页中找到。合适地，焦磷酸解消化在介质存在下进行，该介质还包含焦磷酸根阴离子和镁阳离子；优选以毫摩尔浓度。
在本发明方法的步骤(2)中，在聚合酶和连接酶存在下使至少一个单核苷三磷酸(优选流中的每个单核苷三磷酸)与初级探针反应，以产生基本上双链的占用的初级探针。优选地，在进行该步骤之前，用焦磷酸酶处理步骤(1)的产物，以将任何残留的焦磷酸盐水解成磷酸根阴离子。
可以有利地使用的聚合酶的实例包括但不限于从细菌获得的原核poll酶或酶衍生物，如大肠杆菌(escherichiacoli)(如klenow片段聚合酶)、水生栖热菌(thermusaquaticus)(如taqpol)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)、热溶芽孢杆菌(bacilluscaldovelox)和热坚芽孢杆菌(bacilluscaldotenax)。原则上，可以在该步骤中使用任何合适的连接酶。
步骤(2)中使用的每个初级探针适当地包含(a)第一单链寡核苷酸，其包含限制性核酸内切酶切口位点、用于捕获核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点和靠近捕获位点任一侧的寡核苷酸侧翼区，和(b)能够与侧翼区杂交的第二和第三单链寡核苷酸。在一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸是分离的实体，而在另一个实施方案中，它们通过接头区彼此连接。在后一种情况和一个实施方案中，接头区连接第二和第三寡核苷酸的末端。接头区原则上可以是任何二价基团，但是便利地是另一个寡核苷酸区。在一个实施方案中，该寡核苷酸接头区基本上不能与第一寡核苷酸杂交。
选择第一、第二和第三寡核苷酸，使得在步骤(2)中，第二和第三寡核苷酸分别与靠近捕获位点任一侧的第一寡核苷酸上的3′侧和5′侧的侧翼区杂交。在一个实施方案中，第三寡核苷酸的3′末端与第一寡核苷酸的5′侧的相应核苷酸之间存在核苷酸错配。在另一个实施方案中，第三寡核苷酸的3′末端还包括核酸外切保护基团。捕获位点包含单核苷酸，其核碱基与待检测的核苷三磷酸所携带的核碱基互补。这使得三组分的初级探针对该特定核苷三磷酸具有高度选择性。例如，如果分析物源自dna并且第一、第二和第三寡核苷酸由脱氧核糖核苷酸组成，则如果其包含的核苷酸带有胸腺嘧啶核碱基，捕获位点对脱氧腺苷三磷酸具有高度选择性。因此，在本发明的一个有用的实施方案中，步骤(2)可以在包含多种初级探针类型的探针系统存在下进行；例如，一种、两种、三种或四种初级探针类型，每种类型包含具有不同侧翼区的第一寡核苷酸和所寻找的各种不同核碱基的不同捕获位点特征。
通常，第一寡核苷酸长达150个核苷酸，优选10-100个核苷酸。在一个实施方案中，第二寡核苷酸比第一寡核苷酸的互补3′侧侧翼区短至少一个核苷酸。在另一个实施方案中，第一寡核苷酸的3′末端与第二寡核苷酸上与其相对的核苷酸之间存在单核苷酸错配，以防止聚合酶在该位点捕获核苷三磷酸。类似地，在一个实施方案中，第三寡核苷酸比第一寡核苷酸的互补5′侧侧翼区长至少一个核苷酸，而在另一个实施方案中，第三寡核苷酸的3′末端与第一种寡核苷酸中与其相对的核苷酸之间存在单核苷酸错配，用于防止聚合酶在该位点捕获单核苷三磷酸。
在一个优选的实施方案中，切口限制性核酸内切酶识别位点包含第一寡核苷酸上的寡核苷酸区，其本身包括捕获位点。在另一个实施方案中，当使用多于一种初级探针类型时，仍然优选每个第一寡核苷酸包含共同的切口限制性核酸内切酶识别位点，从而仅需要使用一种切口限制性核酸内切酶。为了实现这一点，因此优选识别位点包括含有rna或dna的至少一个每种典型核苷酸的序列，视情况而定。
在另一个优选的实施方案中，如本文所定义的切口限制性核酸内切酶是常规的限制性核酸内切酶，否则能够切割所用的初级探针的两条链，并且在切口位点的区中，在使用初级探针期间产生的链对核酸内切降解具有抗性；例如，通过在第二和/或第三寡核苷酸中包含一个或多个核酸内切阻断位点。在一个实施方案中，这些保护基团可以选自硫代磷酸酯键合和本领域常用的其他骨架修饰，如c3间隔、磷酸基等。
步骤(2)适当地通过使流中的每个单核苷三磷酸与上述酶和一种或多种初级探针类型在20-80℃的温度范围内接触来进行。
如上所述，本发明方法的步骤(2)的产物是基本上双链的占用的初级探针，其组成链分别是第一寡核苷酸和包含第二寡核苷酸、源自单核苷三磷酸的核苷酸和最后的第三寡核苷酸的互补寡核苷酸。如果第二和第三寡核苷酸先前已通过接头区连接在一起，则很明显该互补寡核苷酸将包含闭环链。
在步骤(3)中，用切口限制性核酸内切酶在20-100℃的温度范围内处理占用的初级探针。在该步骤中，将来自第一寡核苷酸的占用的初级探针的链切割成两个单独的寡核苷酸组分，其可以在步骤(4)中从探针的互补链中去杂交，从而将它们彼此分离。步骤(4)可以通过将带切口的、占用探针加热到30-100℃的温度范围来实现，但最优选在与步骤(3)中所用温度相同的温度下实现。
在步骤(5)中，至少一种分离的寡核苷酸组分在连接酶和相应的二级探针存在下反应，以产生至少一种基本上双链的二级占用探针。在一个实施方案中，该二级探针包含带有不可检测状态的荧光团的部分双链的第四寡核苷酸，并且其至少部分地包括单链区，所述单链区是相关分离的寡核苷酸组分的互补序列。在另一个实施方案中，该第四寡核苷酸是如我们的申请wo2014167323中所述的j形，读者可以参考该文献以获得进一步的信息。在又一个实施方案中，二级探针包含两种组分；(c)带有不可检测状态的荧光团的单链第四寡核苷酸，其至少部分地包含作为分离的寡核苷酸成分的序列的单链区，和(d)至少部分地包括单链区的单链第五寡核苷酸，所述单链区是至少一部分第四寡核苷酸的互补序列。合适的相关寡核苷酸区和/或第五寡核苷酸包括抗核酸外切降解的成分。
第四寡核苷酸的特征在于，其具有用其自身独特类型的荧光团进行多重标记的区，并且当二级探针处于未使用状态时，这些荧光团被设置成基本上不可检测。优选地，这些荧光团被设置成在它们被设计为被检测的那些波长处基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可以在大部分电磁光谱中显示出一般的低水平背景荧光，但通常会有一个或少量荧光强度最大的特定波长或波长包络。在一个或多个这些最大值处，可以特征性地检测到基本上不应发荧光的荧光团。在该专利的上下文中，术语“基本上不发荧光”或等同措辞是指在相关特征波长或波长包络处，附着于第四寡核苷酸的荧光团总数的荧光强度小于相应数量的游离荧光团的相应荧光强度的25％，优选小于10％，更优选小于1％，最优选小于0.1％。
原则上，可以使用任何方法来确保在第四寡核苷酸的未使用状态中荧光团基本上不发荧光。在一个实施例中，这是通过将荧光团置于猝灭剂附近来实现。在另一个实施方案中，通过将多个荧光团设置在彼此紧密接近的位置使它们倾向于彼此充分淬灭使得不需要猝灭剂来实现。在该专利的上下文中，荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的“紧密接近”构成取决于所用的特定荧光团和猝灭剂以及可能的第四寡核苷酸的结构特征。因此，该术语旨在参考所要求的结果而不是这些各种成分的任何特定结构设置来解释。然而，仅出于提供示例的目的，指出当相邻的荧光团或相邻的荧光团和猝灭剂以对应于特征
关于荧光团本身，它们原则上可以选自本领域常规使用的任何一种，包括但不限于氧杂蒽部分(例如荧光素)、罗丹明及其衍生物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明b等；香豆素部分(例如羟基-、甲基-和氨基香豆素)和青色素部分，例如cy2、cy3、cy5和cy7。具体实例包括源自以下常用染料的荧光团：alexa染料、青色素染料、attotec染料和罗丹明染料。实例还包括：atto633(atto-tecgmbh)、texasredtm、atto740(atto-tecgmbh)、孟加拉玫瑰红(rosebengal)、alexafluortm750c5-马来酰亚胺(invitrogen)、alexafluortm532c2-马来酰亚胺(invitrogen)和罗丹明红c2-马来酰亚胺和罗丹明绿以及亚磷酰胺染料如quasar570。或者，可以使用量子点或近红外染料，例如由li-corbiosciences提供的那些。荧光团通常使用本领域已知的化学方法通过核碱基与第四寡核苷酸连接。
合适的猝灭剂包括通过
在一个实施方案中，第一寡核苷酸的侧翼区还进一步包含如上所述的荧光团，其被设置成使得第一寡核苷酸在其未使用状态下基本上不发荧光。在另一个实施方案中，至少一个侧翼区还包含猝灭剂。
本发明方法的步骤(5)的产物是基本上双链的占用的二级探针，其包含第四寡核苷酸、相关的第一寡核苷酸组分和任选的第五寡核苷酸。在一个实施方案中，第四寡核苷酸的3′末端的核苷酸与相关的第一寡核苷酸组分上的相应核苷酸之间适当地存在错配，以防止在该位点捕获核苷酸。在另一个实施方案中，第五寡核苷酸的3′末端的核苷酸与第四寡核苷酸上的相应核苷酸之间适当地存在错配，以防止在该位点捕获核苷酸。
此后，在步骤(6)中，使用具有核酸外切活性的酶在30-100℃的温度范围内消化所用的第二探针。在该步骤中，来自第四寡核苷酸的所用二级探针的部分在该过程中被消化成其组成核苷酸；将荧光团彼此分离，从而使荧光团不被猝灭，因此可检测到。因此，随着核酸外切的进行，观察者看到荧光信号的快速增长，因为产生了许多单核苷酸。然后，该荧光的特征间接反映了初级探针最初捕获的单核苷三磷酸的性质。
可以在步骤(6)中使用的酶包括q5、q5hotstart、phusion、phusionhs、phusionii、phusioniihs、dnasei(无核糖核酸酶)、核酸外切酶i或iii(例如e.coli)、核酸外切酶t、核酸外切酶v(recbcd)、λ核酸外切酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶bal-31、recjf、t5核酸外切酶和t7核酸外切酶。
应当理解，步骤(3)和(4)可以在第一循环中通过允许另外的第一寡核苷酸在步骤(4)之后与占用探针的互补链退火而重复，从而允许构建高浓度的相关分离的寡核苷酸组分，从而允许产生相应的高浓度的占用的二级探针。同样在另一个实施方案中，步骤(6)中产生的第六寡核苷酸可以与第四寡核苷酸的另一分子反应，然后重复步骤(6)以产生第二循环。因此，当同时重复第一和第二周期时，可以获得双倍乘数效应。通过这种方式，可以使荧光信号非常快速地增长至高强度，使得容易检测和识别。
此后，在步骤(7)中，检测步骤(6)中释放的荧光团，并通过推断确定附着于单核苷三磷酸的核碱基的性质。通过系统地对在步骤(1)中产生的有序流中的所有单核苷三磷酸进行本发明的方法，可以产生并分析原始核酸分析物序列的数据特征。这样做的方法在本领域中是众所周知的；例如，可以用来自激光的光检查反应介质，并且使用调节到各种荧光团的特征荧光波长或波长包络的光电探测器或等效装置检测产生的任何荧光。这又使光电探测器产生可以使用已知算法在计算机中处理和分析的特征电信号。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法全部或部分地在微滴流中进行，其中至少一些微滴包含单核苷三磷酸；适当地是有序流。例如，这种方法可以通过将步骤(1)中产生的核苷三磷酸逐个地插入相应的含水微滴中而保持在不混溶的载体溶剂(例如烃或硅油)中以帮助保持有序化。或者，这可以通过在消化(焦磷酸解)区下游直接产生微滴来实现；例如，通过使反应介质从适当尺寸的微滴头出现到溶剂的流动流中。或者，可以将来自步骤(1)的小等份反应介质定期并依次注入悬浮在溶剂中的预先存在的含水微滴流中。如果采用后一种方法，则每个微滴可能已经包含初级和二级探针的各种组分以及实现步骤(2)至(6)所需的酶和任何其他试剂(例如缓冲液)。在另一种方法中，可以使在前一实施方案中产生的微滴随后与这种预先存在的微滴流结合以实现类似的结果。在这些微滴方法中，步骤(7)优选包括将微滴输送到储存区并检查每个微滴以识别释放的荧光团。此后，将从每个微滴获得的结果组合成原始核酸分析物序列的数据特征流。
为了避免给定的微滴含有多于一个核苷三磷酸的风险，优选在步骤(1)中以一速率释放每个核苷三磷酸，使得每个填充的微滴平均分成1-20个，优选2-10个空的微滴。此后，使溶剂中填充和未填充的微滴流沿着流动路径(合适地是微流体流动路径)以一定的速率和方式流动，使得它们保持在分离状态并且没有机会彼此结合。合适地，所用微滴的有限直径小于100微米，优选小于50微米，更优选小于20微米，甚至更优选小于15微米。最优选地，它们的直径在2-20微米的范围内。在一个实施方案中，通过整个系统的微滴流速为每秒50-3000个微滴，优选100-2000个微滴。
在本发明的第二方面，提供了一种多组分生物探针系统，其特征在于包括(1)初级探针，其包含(a)包含限制性核酸内切酶切口位点、用于捕获单个核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点和靠近捕获位点两侧的寡核苷酸侧翼区的第一单链寡核苷酸和(b)能够与侧翼区杂交的第二和第三单链寡核苷酸，和(2)二级探针，其包含(c)至少部分单链的第四寡核苷酸，其带有基本上不可检测状态的荧光团，具有与第一寡核苷酸的至少一部分互补的单链区，和(d)任选地与第四寡核苷酸至少部分互补的单链第五寡核苷酸。
在一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸通过接头区连接；例如，寡核苷酸区。在另一个实施方案中，切口位点是包括捕获位点的寡核苷酸区。在另一个实施方案中，第四寡核苷酸是(1)部分双链，即j-形，或(2)单链，并与第五寡核苷酸结合使用。
合适地，初级探针包含一至四种不同的第一寡核苷酸类型，不同之处在于它们的侧翼区序列和捕获区的核苷酸特征。在另一个实施方案中，第二探针包含一至四种不同的第四寡核苷酸类型，不同之处在于它们所携带的荧光团和它们的序列。
优选地，探针系统还包含连接酶、聚合酶、具有双链核酸外切酶活性的核酸外切酶和一旦使用初级探针能够切割切口位点的切口限制性核酸内切酶中的至少一种。
可与本发明的方法、初级探针和探针系统一起使用的合适的切口限制性核酸内切酶的细节可在http：//rebase.neb.com上与之相关的数据库中找到。
据信，上述测序方法中使用的检测方法通常也适用于生物样品或由其衍生的分析物中的单核苷三磷酸的分析、表征或定量。因此，在本发明的第三方面，提供了一种分析单核苷三磷酸的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过在聚合酶和连接酶存在下而使单核苷三磷酸与相应的初级探针反应产生至少一个基本上双链的初级寡核苷酸占用探针，所述初级探针包含(a)包含限制性核酸内切酶切口位点、用于捕获的单核苷酸捕获位点单核苷三磷酸和寡核苷酸侧翼区并置于捕获位点的任一侧的第一单链寡核苷酸，和(b)能够与第一寡核苷酸侧翼区杂交的第二和第三单链寡核苷酸；(2)用切口限制性核酸内切酶在切口位点切割占用的初级探针的第一寡核苷酸链，以产生单独的第一寡核苷酸组分；(3)将步骤(2)中产生的第一寡核苷酸组分与占用探针的互补链分离；(4)通过在连接酶存在下使至少一个分离的第一寡核苷酸组分与相应的二级探针反应产生至少一个基本上双链的二级占用探针，所述二级探针包含(c)带有基本上不可检测状态的荧光团的互补第四寡核苷酸，和任选的(d)与第四寡核苷酸至少部分互补的单链第五寡核苷酸；(6)用具有双链核酸外切活性的酶消化占用的二级探针以产生可检测状态的荧光团和至少部分为第四寡核苷酸的互补序列的单链第六寡核苷酸；和(7)检测步骤(6)中释放的荧光团。
在这种方法中，各种步骤的性质和所用的生物探针适当地如上所述。在一个实施方案中，单核苷三磷酸将通过焦磷酸水解从前体双链dna分析物获得。在另一个实施方案中，它使用例如激酶从前体单核苷一磷酸或单核苷二磷酸产生(参见例如bao和ryu的biotechnologyandbioengineering(doi10.1002/bit.21498))。
现在参考以下实施例说明本发明。
实施例1-探针系统的制备和使用
制备单链第一寡核苷酸1，其具有以下核苷酸序列：
5′-tccgtgagtcccacaaaccaataacctcgtcatcattgcacatacgctttgaca/lnvdt/-3′
其中a、c、g和t代表带有dna相关特征核苷酸碱基的核苷酸。它还包含位于其5′末端第34位碱基的捕获区(c核苷酸)(可选择性捕获脱氧核苷三磷酸(dntp)混合物中的脱氧鸟苷三磷酸核苷酸(dgtp))，和切口核酸内切酶nb.bsrdi，“nncattgc”的识别序列。
还制备了另一种单链寡核苷酸2(包含具有与第一寡核苷酸的3′侧翼区互补的序列的寡核苷酸区)和单链寡核苷酸3(包含具有与所述第一寡核苷酸的5′侧翼区互补的序列的寡核苷酸区，具有两碱基错配、5′磷酸基团和3′反向脱氧胸苷核苷酸)。它们有以下核苷酸序列：
寡核苷酸2：5′-cgtatgtgcaat-3′
寡核苷酸3：5′-patgacgaggttaaa/1nvdt/-3′
其中p代表5′磷酸基团和/invdt/代表反向脱氧胸苷核苷酸。
还制备了单链第四寡核苷酸，其具有以下核苷酸序列：
5′-tcgtgcctcatcgaacatgacgaggxxqxxggtttgtggt-3′
其中x代表使用常规胺连接化学法用atto655染料标记的脱氧胸苷核苷酸(t)，q代表用bhq-2猝灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸。它还包含与第一寡核苷酸的5′侧翼区互补的3′区。
还制备了单链第五寡核苷酸，其具有以下核苷酸序列，其与第四寡核苷酸的5′区基本上互补：
5′-pgttcgatgaggcaccttagatgtacg/lnvdt/-3′
然后制备了包含探针系统的反应混合物。它的成分对应于由以下配方得到的成分：
20ul5×缓冲液ph7.6
4ul寡核苷酸1，1000nm
5ul寡核苷酸2，100nm
6ul寡核苷酸3，1000nm
2ul寡核苷酸4，1000nm
5ul寡核苷酸5，1000nm
10unb.bsrdi切口核酸内切酶(例如newenglandbiolabsinc.)
7.1utaq连接酶
7.1ue.coli连接酶
5.8ubst大片段聚合酶
1.4u耐热无机焦磷酸酶
0.21反应pfuultraiifusionhs聚合酶
1.25uldntp的混合物，1nm
加水至100ul
其中5×缓冲液包含以下混合物：
60ultris-hcl缓冲液，1m，ph7.6
25ul氯化镁水溶液，1m
100ul氯化钾水溶液，1m
5ul精胺溶液，1m
5ul亚精胺溶液，1m
7.5ul四乙基五胺溶液，10％
50ultritonx-100表面活性剂(10％)
2.5ul二硫苏糖醇溶液，1m
20ul烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，100μm
加水至1ml
然后通过将混合物在37℃温育10分钟，然后将温度升高至50℃再保持30分钟，以允许重复切割第一寡核苷酸并将所得第一寡核苷酸组分连接至与第四寡核苷酸相对的第五寡核苷酸以形成完整的二级探针，从而进行dgtp的捕获和寡核苷酸2与寡核苷酸3的连接以形成占用的初级探针。然后将温度升至70℃以活化pfuultraiifusionhs聚合酶，以允许在重复循环中消化完整的二级探针的第四寡核苷酸组分。使用633nm线的氦-氖激光照射反应混合物，并且随着核酸内切和核酸外切的循环，使用照相机检测所得的atto655染料的特征荧光。
监测在存在和不存在反应的dntp组分的情况下荧光强度随时间的增长，结果在图1中以图形显示。由此可以看出，探针系统有效地捕获dgtp和本发明方法的循环性质导致荧光信号的快速增长。相反，在反应混合物中不存在dntp的对比实验中，寡核苷酸4上的atto655染料未显示出任何显著的荧光。
实施例2-使用探针系统的液滴微流体方法
图2示意性地说明了微流体测序装置，其中使每个含有单核苷酸碱基的微滴与如上所述类型的探针系统反应。
使包含通过源自人dna的100个核苷酸碱基多核苷酸分析物的逐步焦磷酸解获得的单核苷酸三磷酸流的水性介质1流过由pdms聚合物制成的10微米直径的微流体管。焦磷酸解反应本身通过在72℃下使含水并缓冲(ph7.5)的反应介质流(该反应介质包含taqpol和浓度均为每生2毫摩尔的焦磷酸钠和氯化镁的溶液)通过玻璃微珠来进行，其中，分析物预先通过琥珀酰桥连接在玻璃微珠上。在微珠下游的1中的单个核苷酸的顺序对应于分析物的序列。1从液滴头2出现进入第一室3，在那里它与不混溶的轻质硅油4的一个或多个流接触。选择这些流的速度以避免湍流混合并产生悬浮在油中、每个直径约为8微米的水性球形液滴5。通常，调节速率以使得在相邻的填充液滴之间平均存在10个空液滴。然后沿着相同直径的第二微流体管将5的流向前传送到第二室6，5微米的水性球形液滴7的第二流也通过第二液滴头8进料到第二室6中。使液滴5和7以顺序方式结合以形成直径约9微米的增大的水性液滴9。每个7中含有无机焦磷酸酶，以破坏每个5中存在的任何残留的焦磷酸根阴离子。
然后通过微流体管以相同的速率将9流送入第三室10，在第三室10中，这些液滴与通过相应的液滴头12进料到其中的5微米的水性球形液滴11的第三流接触。每个9在室6和10之间移动的时间c.2分钟。
然后使液滴9和11在10中结合以产生液滴13(直径约10微米)。每个11中含有嗜温连接酶、嗜热聚合酶、切口限制性核酸内切酶nb.bsrdi(例如newenglandbiolabsinc.)、包含四组类似于实施例1中描述的单链寡核苷酸的初级探针、包含用不同荧光团标记的四种不同的第四单链寡核苷酸和四种互补的第五寡核苷酸的二级探针、以及核酸外切酶。或者，可以在一系列结合步骤(未示出)中添加这些组分，其中不同的液滴类型11(每个包含一种或多种这些组分)依次与9或由先前的结合产生的液滴结合以最终产生13。
然后将如此形成的结合微滴13的流在37℃下温育10分钟，然后在50℃下温育30分钟，接着在70℃下温育30分钟。在结束时，将13传送到检测系统14。
检测系统(未示出)通常包括检测窗口，其中每个液滴用来自激光器的入射光进行检查。然后，该光的作用使得每个液滴中释放的荧光团以单核苷酸碱基的特征方式发荧光，所述单核苷酸碱基最初结合到捕获的分子中(或者如果液滴最初是空的，则基本上完全没有)。然后在与上述四种寡核苷酸组相关的四个荧光团的四个特征波长处检测荧光的存在或不存在。因此，当依次检查液滴时，原始的多核苷酸分析物中的核苷酸碱基序列可以被有效地读出。
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