用溶剂化显色染料缀合物检测分枝杆菌的方法与流程
本发明是在国立卫生研究院授予的合同ai051622下借助政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月29日提交的美国临时专利申请第62/368928号的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
发明领域
本公开涉及碳水化合物-染料缀合物和使用其检测病原性生物体或其它生物体的方法。
发明背景
属于放线菌门(actinobacteriaphylum)的分枝杆菌属(mycobacteriumgenus)的分枝杆菌，是发病率和死亡率的重要原因，特别是在免疫受损或老年的个体中以及在医疗资源有限的国家中。95％的人感染是由七个种引起的：结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)(也称为鸟分枝杆菌复合菌组(mycobacteriumaviumcomplex)或鸟胞内分枝杆菌(m.avium-intracellulare))、麻疯分枝杆菌(m.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(m.kansasii)、偶然分枝杆菌(m.fortuitum)、龟分枝杆菌(m.chelonae)和脓肿分枝杆菌(m.absecessus)。所有分枝杆菌属物种的使它们区别于经典革兰阴性和革兰阳性细菌的一个特征是非常浓稠的、蜡状的并且富含分枝杆菌酸/分枝杆菌酸酯(mycolates)的细胞壁，也称为分枝杆菌膜，其显著引起了该属的耐性(hardiness)。事实上，分枝杆菌包膜的脂质含量可高达细菌干重的60％，这有助于包膜的低通透性和这些细菌对常见抗生素和化学治疗剂的抗性。
特别地，由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)引起的结核病(tb)是感染性细菌疾病导致死亡的主要原因，因此是严重的全球健康挑战，2015年估计有180万人死亡。此外，数量越来越多的对治疗过程具有抗性的mtb菌株加剧了全球流行病。尽管在过去十年中在tb诊断的发展方面做出了巨大努力，但在许多国家针对地方性tb的结核病控制计划仍然依赖于通过痰涂片或培养检测结核杆菌。更具体地说，目前用于高负荷区域中快速结核病诊断的标准方法是使用100多年前开发的基于颜色的ziehl-neelsen(zn)测试(f.ziehl，zurfarbungdestuberkelbacillus，dtsch.med.wschr.8、451(1882)；f.ziehl，ueberdiefarbungdestuberkelbacillus，dtsch.med.wschr.9,247-249(1883)；f.neelsen，eincasuistischerbeitragzurlehrevondertuberkulose，centralbl.med.wissensch.28,497-501(1883)；其公开内容通过引用并入本文)或1938年首次报道的基于荧光金胺的truant染色(p.k.h.hagemann.
技术实现要素：
实施方案涉及用于检测样品中目标代谢活性细菌的方法，该方法包括：
·使样品与碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物接触，所述缀合物包括：
○碳水化合物部分，其被配置成促进碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物仅至目标细菌的外细胞膜中的选择性地代谢摄取，和
○与碳水化合物部分连接的溶剂化显色染料，所述溶剂化显色染料被配置成报告碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物向样品的目标细菌的外细胞膜中掺入；和
·检测来自碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物的溶剂化显色染料部分的光谱信号，其中光谱信号表明样品中存在目标代谢活性细菌。
在其它实施方案中，目标细菌的特征在于疏水的外细胞膜。
在其它实施方案中，目标细菌的外细胞膜是富含疏水性分枝杆菌酸酯的分枝杆菌膜(mycomembrane)。在一些这样的实施方案中，分枝杆菌膜分枝杆菌酸酯包括海藻糖分枝杆菌酸酯。
在其它实施方案中，目标细菌能够代谢摄取海藻糖。
在其它实施方案中，目标细菌以高特异性代谢摄取海藻糖。
在另外的其它实施方案中，目标细菌具有能够进行海藻糖分枝杆菌酸酯化(mycolylation)，从而促进目标细菌对海藻糖的摄取的酰基转移酶抗原85(ag85)蛋白质复合物。
在另外的其它实施方案中，目标细菌于放线菌门。在一些这样的实施方案中，目标细菌是分枝杆菌或棒杆菌(corynebacteria)。
在其它实施方案中，缀合物的碳水化合物部分是海藻糖。
在另外的其它实施方案中，缀合物的碳水化合物部分是海藻糖类似物。
在另外的其它实施方案中，碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物具有下式：
其中z1-z7中的一个且仅一个是连接的溶剂化显色染料，而z1-z7中的其余部分为oh。
在另外的其它实施方案中，碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物具有下式：
其中z1-z4中的一个且仅一个是连接的溶剂化显色染料，而z1-z4中的其余部分为oh。
在另外的其它实施方案中，z1是连接的溶剂化显色染料。
在另外的其它实施方案中，连接的溶剂化显色染料选自4-dmap、4-dmn、6-dmn、尼罗红、3-hc、3-mc、prodan、anthradan、nbd及其衍生物。
在其它实施方案中，样品是生物样品。在一些这样的实施方案中，生物样品选自：痰、血液、血清、血浆、尿液、支气管肺泡灌洗液、口腔拭子(例如，颊拭子)或组织样品。
在另外的其它实施方案中，样品是环境样品。在一些这样的实施方案中，样品取自选自空气、水或无生命表面的环境。在其它这样的实施方案中，生物样品是来自怀疑感染了目标细菌或有感染目标细菌风险的受试者的样品。在其它这样的实施方案中，生物样品是来自怀疑感染了目标结核分枝杆菌或有感染目标结核分枝杆菌风险的受试者的样品。在其它这样的实施方案中，环境样品是已知与或怀疑有与怀疑感染了目标细菌或有感染目标细菌风险的一个或多个受试者接触的样品。在其它这样的实施方案中，环境样品是已知与或怀疑有与怀疑感染了结核分枝杆菌或有感染结核分枝杆菌风险的一个或多个受试者有接触的样品。
在另外的其它实施方案中，目标细菌是选自以下的一种或多种：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌(或鸟-胞内结核分枝杆菌)、麻疯分枝杆菌(特别是导致结核样型麻疯的麻疯分枝杆菌感染)、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌(m.marinum)、诺卡分枝杆菌(m.nocardia)、蟾蜍分枝杆菌(m.xenopi)、猿分枝杆菌(m.simiae)、斯氏分支杆菌(m.szulgai)、療病分枝杆菌(m.scrofulaceum)、玛尔摩尔分枝杆菌(m.malmoense)、土-无色分枝杆菌(m.terrae-nonchromogenicum)复合群、嗜血分枝杆菌(m.haemophilum)、日内瓦分枝杆菌(m.genavense)、隐藏分枝杆菌(m.celatum)、中庸分枝杆菌(m.interjectum)、汇合分枝杆菌(m.confluentis)、三重分枝杆菌(m.triplex)、慢生黄分枝杆菌(m.lentiflavum)、布氏分枝杆菌(m.branderi)、出众分枝杆菌(m.conspicuum)、库氏分枝杆菌(m.cookii)、亚洲分枝杆菌(m.asiaticum)、海分枝杆菌(m.marinum)、戈登分枝杆菌(m.gordonae)、偶然分枝杆菌(m.fortuitum)、龟-脓肿分枝杆菌(m.chelonae-abscessu)和m.mucogenicum。
在另外的其它实施方案中，目标代谢活性细菌选自：结核分枝杆菌、麻疯分枝杆菌或白喉棒杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)。
在另外的其它实施方案中，目标细菌存在于细胞外。
在另外的其它实施方案中，目标细菌存在于真核细胞内。
其它实施方案涉及下式的碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物：
其中z1-z7中的一个且仅一个是连接的溶剂化显色染料，而z1-z7的其余部分为oh。
在其它实施方案中，碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物具有下式：
其中z1-z4中的一个且仅一个是连接的溶剂化显色染料，而z1-z4中的其余部分为oh。
在又一些其它实施方案中，连接的溶剂化显色染料是选自以下的化学式之一：
其中：
b是任选的稠合5或6元芳基或杂芳基环，任选地进一步被一个或多个z取代基取代，所述z取代基独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素、羟基、氨基、取代的氨基、氰基、硝基；
y是一个或多个独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素、羟基、氨基、取代的氨基、氰基、硝基、烷氧基和取代的烷氧基的取代基，其中至少一个y或z是-nr2；
a是包含一个、两个或三个5元或6元环的芳基或杂芳基系，任选地进一步被一个或多个z取代基取代，所述z取代基独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素、羟基、氨基、取代的氨基、氰基和硝基；
n为0或1；
x为o、s或nr1；
每个r、r1、r11、r15、r16和r21独立地选自h、烷基和取代的烷基；以及
r12-r14、r17-r19和r28-r31各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素、羟基、氨基、取代的氨基、氰基、硝基、烷氧基和取代的烷氧基；
其中z、y和r1-r31中的至少一个通过任选的接头与缀合物的糖连接。
在又一些其它实施方案中，连接的溶剂化显色染料是选自以下的式之一：
其中：
r1、r5、r6、r11、r15、r16、r21、r25、r26、r33-r35、r36、r51、r60和r61独立地选自h、烷基和取代的烷基；以及
r2-r4、r7-r9、r12-r14、r17-r19、r22-r24、r27-r32、r37-r40和r52-r59各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、卤素、羟基、氨基、取代氨基、氰基和硝基；
其中r1-r39中的至少一个通过任选的接头与缀合物的糖连接。
在另外的其它实施方案中，溶剂化显色染料选自：
或其类似物，其中溶剂化显色染料在任何可用位置与糖连接。
其它另外的实施方案涉及代谢标记的细菌细胞，其中包含：包含分枝杆菌酸酯的外细胞壁；以及
与外细胞膜的分枝酸脂质共价连接的至少一种碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物。
其它实施例涉及试剂盒，其包括：
权利要求28-32中任一项的碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物；和选自酶、化学裂解剂、缓冲剂、细胞、代谢标记细胞、显微镜、阳性对照、阴性对照和代谢标记靶细胞的说明书中的一种或多种组分。
在其它这样的实施方案中，溶剂化显色染料是发荧光的。
其它实施方案涉及用于监测受试者中细菌感染的治疗的方法，该方法包括：
·以预定间隔或治疗计划步骤从患有细菌感染的受试者获得一系列样品；
·使每个所述样品与碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物接触，所述缀合物包括：
○碳水化合物部分，其被配置成促进碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物被选择性地代谢摄取到仅目标细菌的外细胞膜中，和
○与碳水化合物部分连接的溶剂化显色染料部分，所述溶剂化显色染料部分被配置成报告碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物向样品的目标细菌的外细胞膜中的掺入；和
○对于每个样品，检测来自碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物的溶剂化显色染料部分的光谱信号，其中光谱信号表明样品中存在目标代谢活性细菌；以及
·根据光谱测量的目标代谢活性细菌在所述系列样品中的存在或不存在来调整治疗计划。
在其它实施方案中，溶剂化显色染料是发荧光的并且检测是荧光测量。
在其它实施方案中，用碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物孵育样品和对目标代谢活性细菌进行光谱检测后，进行流式细胞术分析，以定量样品中的目标细菌。
在一些其它实施方案中，目标细菌属于放线菌门。
在另外的其它实施方案中，目标细菌是分枝杆菌或棒杆菌。
在另外的其它实施方案中，目标细菌是选自以下的细菌中的一种或多种：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌(或鸟-胞内分枝杆菌)、麻疯分枝杆菌(特别是导致结核样麻疯的麻疯分枝杆菌感染)、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、诺卡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿分枝杆菌、斯氏分支杆菌、療病分枝杆菌、玛尔摩尔分枝杆菌、土-无色分枝杆菌复合群、嗜血分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、中庸分枝杆菌、汇合分枝杆菌、三重分枝杆菌、慢生黄分枝杆菌、布氏分枝杆菌、出众分枝杆菌、库氏分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、海分枝杆菌戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌和m.mucogenicum。
在另外一些其它实施方案中，目标细菌选自结核分枝杆菌、麻疯分枝杆菌或白喉棒杆菌。
在另外一些其它实施方案中，碳水化合物-染料缀合物具有下式：
其中z1-z7中的一个且仅一个是连接的溶剂化显色染料，而z1-z7中的其余部分为oh。
在另外一些其它实施方案中，样品选自痰、血液、血清、血浆、尿液、支气管肺泡灌洗液和颊拭子。
在另外一些其它实施方案中，在治疗前和治疗期间的一个或多个时间点或治疗后获取样品。
在另外一些其它实施方案中，该方法还包括根据样品中目标代谢活性细菌的量随时间推移的变化来调节抗感染治疗剂量或方案。
在另外一些其它实施方案中，抗感染治疗剂量或方案包含抗真菌剂。
在另外的一些其它实施方案中，在治疗开始后的第一时间点和第二时间点获取样品，其中第二时间点是第一时间点后约1周至约1年。
另外一些其它实施方案涉及用于测定细菌药物或治疗计划灵敏度的方法，包括：
·获得目标细菌样品；
·根据可用药物混合物或治疗计划的数量，将目标细菌样品分成多个样品；
·利用指定的适当药物混合物或治疗计划处理每个样品；
·使每个样品与碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物接触，所述缀合物包括：
○碳水化合物部分，其被配置成促进碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物被选择性地代谢摄取到仅至目标细菌的外细胞膜中，和
○与碳水化合物部分连接的溶剂化显色染料部分，所述溶剂化显色染料部分被配置成报告碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物向样品的目标细菌的外细胞膜中的掺入；和
·对于每个处理的样品，检测来自碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物的溶剂化显色染料部分的光谱信号，其中光谱信号表明样品中目标代谢活性细菌的持久性及其对用于该样品的药物混合物或治疗计划的抗性。
在其它实施方案中，目标细菌属于放线菌门。
在其它实施方案中，目标细菌是分枝杆菌或棒杆菌。
在其它实施方案中，目标细菌是选自以下的一种或多种：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌(或鸟-胞内分枝杆菌)、麻疯分枝杆菌(特别是导致结核样麻疯的麻疯分枝杆菌感染)、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、诺卡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿分枝杆菌、斯氏分支杆菌、療病分枝杆菌、玛尔摩尔分枝杆菌、土-无色分枝杆菌复合群、嗜血分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、中庸分枝杆菌、汇合分枝杆菌、三重分枝杆菌、慢生黄分枝杆菌、布氏分枝杆菌、出众分枝杆菌、库氏分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌和m.mucogenicum。
在另外的其它实施方案中，目标细菌选自：结核分枝杆菌，麻疯分枝杆菌或白喉棒杆菌。
在另外的其它实施方案中，碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物具有下式：
其中z1-z7中的一个且仅一个是连接的溶剂化显色染料，而z1-z7中的其余部分为oh。
在另外的其它实施方案中，样品选自：痰、血液、血清、血浆、尿液、支气管肺泡灌洗液和颊拭子。
另外的实施方案和特征部分地在以下描述中阐述，并且部分地对于本领域技术人员在阅读说明书后将变得显而易见，或者可以通过实践所公开的主题来学习。通过参考说明书的剩余部分和附图可以实现对本公开的性质和有利方面的进一步理解，附图形成本公开的一部分。
附图简述
当结合所附数据和附图考虑时，通过参考以下详细描述，将更好地理解本发明的这些和其它特征和有利方面，其中：
图1提供了根据现有技术的分枝杆菌细胞壁(包括分枝杆菌膜)的结构和组分的示意图。
图2显示了根据现有技术的海藻糖单分枝杆菌酸酯(tmm)和海藻糖二分枝杆菌酸酯(tdm)的化学组成和结构。
图3a和图3b鉴定了根据本申请的实施方案的放线菌门中具有将海藻糖类似物代谢地掺入分枝杆菌膜所必需的ag85蛋白同源物(以绿色标示)的细菌种类。
图4提供了根据现有技术的ag85酶驱动的海藻糖-染料缀合物向分枝杆菌膜中的掺入的示意图。
图5提供了根据本申请的实施方案的基于ag85酶驱动的碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物向分枝杆菌膜中的代谢性掺入的分枝杆菌检测方案，其中，用作实例，碳水化合物是海藻糖并且溶剂化显色染料是4-n,n-二甲基氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(dmn)。
图6和图7提供了根据本申请实施方案的海藻糖-荧光溶剂化显色染料缀合物的实例。
图8显示了根据本申请的实施方案的缀合有4-n,n-二甲基氨基-1,8-萘二甲酰亚胺的海藻糖(dmn-tre)的化学组成和结构，以及对照化合物dmn-葡萄糖(dmn-glc)和6-荧光素-海藻糖(6-fitre)的化学组成和结构。
图9a提供了根据本申请的实施方案的用dmn-tre或其非荧光类似物6-fitre处理的各种分枝杆菌的无洗涤成像的结果。
图9b示出了根据本申请的实施例的通过荧光滤光器定制的dmn-tre检测的优化。
图10显示了根据本申请的实施方案中dmn-tre对各种分枝杆菌的荧光标记的结果作为时间的函数。
图11a和图11b显示了根据本申请的实施方案中dmn-tre标记对于分枝杆菌优于革兰阳性和革兰阴性细菌的选择性。
图12a-f提供了支持根据本申请的实施方案中分枝杆菌对dmn-tre缀合物摄取的代谢性质的数据。
图13a-d提供了支持根据本申请的实施方案中dmn-tre标记对活分枝杆菌具有选择性的概念的数据。
图14a-c显示了根据本申请的实施方案，dmn-tre标记被tb药物抑制，因此可用于测试抗药性。
图15a提供了用dmn-tre处理的结核分枝杆菌(mtb)的无洗涤成像的结果，而图15b和c显示了根据本申请的实施方案，结核分枝杆菌(mtb)的dmn-tre标记被tb药物混合物抑制。
图15d显示了根据现有技术的金胺(auramine)染色不被tb药物混合物抑制
图16说明了根据本申请的实施方案用dmn-tre标记痰样品的方案。
图17a-d显示了根据本申请的实施方案，来自tb阳性患者的痰样品中mtb的dmn-tre检测。
发明详述
本文描述的本发明的实施方案不旨在是穷举的或将本发明限制于所公开的精确形式。相反，选择用于描述的实施方案被选择来使本领域技术人员能够实践本发明。
现在转向附图和方案，描述了一系列碳水化合物-染料缀合物，以及使用其来检测病原性生物体或其它生物体(例如细菌)的方法。在许多实施方案中，选择碳水化合物-染料缀合物，使得其可被酶促掺入活的和活性(有活力的)目标细菌中，以便于检测所述细菌。在许多实施方案中，通过利用一种或多种对目标细菌是内源的酶来实现缀合物掺入，所述酶可以通过缀合物的碳水化合物掺入缀合物。在许多实施方案中，由于掺入时染料局部环境的变化，仅在掺入至目标细菌中时才由缀合物的染料产生可检测的信号。在许多实施方案中，缀合物代谢性地掺入至细菌细胞壁的脂肪外膜中，所述脂肪外膜为缀合物的染料提供明显疏水的环境，使其产生可检测的信号。为此，在许多实施方案中，选择缀合物的碳水化合物以促进缀合物至目标活细菌的细胞壁中的代谢摄取和掺入，同时选择缀合物的染料以高效且可靠地报告这种成功的掺入事件。在许多实施方案中，目标细菌是放线菌，更具体地，是分枝杆菌，其特征在于异常疏水的外细胞膜-分枝杆菌膜(mycomembrane)。
已知特征为长脂肪分枝杆菌酸的糖脂是细菌分枝杆菌膜的丰富且必需的组分(图1)。这些分子的独特特征是长链(c30至c90)环丙烷化脂质的存在，所述长链环丙烷化脂质主要负责分枝杆菌膜的极端疏水性，并因此导致分枝杆菌在宿主体内的毒力和持久性。具体而言，已知基于海藻糖的分枝杆菌酸酯(图2)，最显著是海藻糖单分枝杆菌酸酯(tmm)和二分枝杆菌酸酯(tdm),对于mtb细胞活力是必需的(h.bloch、studiesonthevirulenceoftuberclebacilli、j.exp.med.97、1-16(1953)；k.j.welsh、r.l.hunter、j.k.actor、trehalose6,6'-dimycolate-acoattoregulatetuberculosisimmunopathogenesis.tuberculosis.93、s3-s9(2013)；其公开内容并入本文)。这些分子通过细胞外酶诸如酰基转移酶ag85蛋白复合物(由抗原85a、85b和85c蛋白同源物组成)(其催化海藻糖与分枝杆菌酸的酯化(图1))的作用掺入至分枝杆菌细胞壁中。
此外，海藻糖分枝杆菌酸酯被认为是放线菌门所独有的，所述放线菌门包括病原性分枝杆菌和棒杆菌，但不是包括经典革兰阳性或革兰阴性生物，也不包括人宿主。为了支持这一观点，已经表明ag85a-c蛋白同源物(已知负责海藻糖的分枝杆菌酸酯化(mycolylation)的酶)主要限于放线菌目的细菌。为此，图3a、图3b以及下面的表1列出了经发现具有海藻糖分枝杆菌酸酯化所必需的ag85同源物，因此能够高效且可靠地摄取海藻糖缀合物的细菌生物体和细菌菌株。相比之下，肺微生物组最丰富的成分，诸如变性菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)门以及假单胞菌属(pseudomonas)、链球菌属(streptococcus)、普氏菌属(prevotella)、梭菌属(fusobacteria)和韦荣球菌属(veillonella)的成员(j.m.beck、b.young、g.b.huffnagle、themicrobiomeofthelung、transl.res.160、258-266(2012)；b.y.hong、n.p.maulen、a.j.adami、h.granados、m.e.balcells、j.cervantes、microbiomechangesduringtuberculosisandantituberculoustherapy、clin.microbiol.rev.29、915-926(2016)；其公开内容通过引用并入本文)，不具有可鉴定的ag85同源物，因此预期不会将海藻糖摄取到其细胞壁中。因此，在本发明的许多实施方案中，mtb和其它放线菌检测的特异性利用海藻糖分枝杆菌酸酯作为检测剂。
表1
此外，已经表明，用各种官能团诸如氟、叠氮化物和炔烃以及较大的荧光团官能化衍生物修饰海藻糖不会阻止其作为海藻糖分枝杆菌酸酯代谢地掺入至分枝杆菌外膜中(图4)。(k.backus、h.i.boshoff、c.s.barry、o.boutureira、m.k.patel、s.s.lee、k.tahlan、c.e.barry3rd、b.g.davis、uptakeofunnaturaltrehaloseanalogsasareporterformycobacteriumtuberculosis、nat.chem.biol.7、228-235(2011).s.r.rundell、z.l.wagar、lm.meints、c.d.olson、m.k.o'neill、b.f.piligian、a.w.poston、r.j.hood、p.j.woodruff、b.m.swarts、deoxyfluoro-d-trehalose(fdtre)analoguesaspotentialpetprobesforimagingmycobacterialinfection、org.biomol.chem.14、8598-8609(2016).b.m.swarts、c.m.holsclaw、j.c.jewett、m.alber、d.m.fox、s.m.siegrist、j.a.leary、r.kalscheuer、c.r.bertozzi、probingthemycobacterialtrehalomewithbioorthogonalchemistry、j.am.chem.soc.134、16123-16126(2012).h.n.foley、j.a.stewart、h.w.kavunja、s.r.rundell、b.m.swarts、bioorthogonalchemicalreportersforselectiveinsituprobingof分枝杆菌膜componentsinmycobacteria、angew.chem.int.ed.55、2053-2057(2016).f.p.rodriguez-rivera、x.zhou、j.a.theriot、c.r.bertozzi、visualizationofmycobacterialmembranedynamicsinlivecells、j.am.chem.soc.139、3488-3495(2017)；其公开内容通过引用并入本文)。因此，负责海藻糖mycolylation的抗原85(ag85)复合物的此类底物混杂性允许在海藻糖的两个葡萄糖部分之一的特定位点进行化学修饰(包括添加其质量超过基础二糖的质量的荧光团)，而无酶转化效率的灾难性损失。因此，在本发明的许多实施方案中，将多种海藻糖和发荧光的“报告子”染料缀合物用于检测有活力的放线菌，包括mtb，其中所述缀合物被代谢地掺入至分枝杆菌膜中，从而使得能够检测。重要的是，因为海藻糖摄取至分枝杆菌膜的总体过程取决于活性代谢，在许多实施方案中，利用海藻糖类似物的放线菌(包括mtb)标记独特地区分活细菌与死细菌。
此外，尽管理论上可以使用任何荧光标记的海藻糖类似物来检测活的放线菌，但是必须去除未代谢的并因此未掺入至细菌细胞壁中的探针以消除背景荧光是实践中的主要障碍。因此，在许多实施方案中，使用其荧光信号通过代谢地掺入至分枝杆菌膜中而被特异性激活的海藻糖探针来检测活的放线菌。更具体地，根据本发明的许多实施方案，将用于检测放线菌的海藻糖探针与环境敏感性溶剂化显色染料(诸如4-n,n-二甲基氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(dmn)，当从含水溶剂转换至疏水溶剂时，其显示出显著的荧光开启)缀合。(g.loving、b.imperiali、aversatileaminoacidanalogueofthesolvatochromicfluorophore4-n,n-dimethylamino-l,8-naphthalimide:apowerfultoolforthestudyofdynamicproteininteractions、j.am.chemsoc.130、13630-13638(2008).g.loving、b.imperiali、thiol-reactivederivativesofthesolvatochromic4-n,n-dimethylamino-l,8-naphthalimidefluorophore:ahighlysensitivetoolsetforthedetectionofbiomolecularinteractions、bioconjug.chem.20、2133-2141(2009).b.n.goguen、g.s.loving、b.imperiali、developmentofafluorogenicsensorforactivatedcdc42、bioorg.med.chem.lett.21、5058-5061(2011).其公开内容通过引用并入本文)。因此，根据许多实施方案，通过ag85或具有类似的mycolylation能力的另一种酶进行的碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物的代谢性mycolylation，随后所得的分枝杆菌酸酯整合至疏水性分枝杆菌膜中，激活了染料的荧光并使得能够检测活的放线菌(包括mtb)细胞而无需洗掉未代谢的探针。使用海藻糖-dmn缀合物(dmn-tre)的总体检测过程的一个具体实例示于图5中。
溶剂化显色染料缀合物
本公开的方面包括溶剂化显色染料-碳水化合物缀合物。具体地，在许多实施方案中，目标缀合物是单个分子，其中碳水化合物部分与溶剂化显色染料共价连接。因此，在许多实施方案中，碳水化合物部分赋予对主题缀合物的代谢摄取的能力。因此，在许多实施方案中，碳水化合物部分衍生自或结构上类似于靶细菌的天然存在的碳水化合物。在一些实施方案中，碳水化合物部分可以充当目标脂质转移酶的底物，由此碳水化合物的羟基通过酶与脂肪酸脂质酯化。在一些实施方案中，脂质转移酶对靶细菌(包括放线菌，诸如，例如分枝杆菌)是内源的。此外，应当理解，取决于参与靶标对缀合物的代谢摄取的一种或多种内源酶的忠实性和功能性/结构/大小耐受性，可根据需要用另外的化学或结构特征进一步修饰碳水化合物部分或以其它方式改变碳水化合物部分，以提高缀合物作为探针的总体效率和可靠性。
碳水化合物部分
在一些实施方案中，目标碳水化合物部分包括1至6个任选地糖苷键连接的单糖单元。在其它实施方案中，碳水化合物部分具有1至4个单糖单元。在许多实施方案中，碳水化合物部分选自单糖和二糖。在一些实施方案中，单糖单元中的至少一个，在一些情况下，碳水化合物的末端单糖单元，包含六元环。在一些情况下，碳水化合物部分是其中两个单糖单元都具有6元环的二糖。
在一些实施方案中，碳水化合物部分是海藻糖，或其衍生物或类似物。如本文中所用，“海藻糖部分”是结构上类似于海藻糖的碳水化合物，因此可以与靶酶活性部位相互作用，并为摄取入分枝杆菌提供选择性。海藻糖以及糖脂海藻糖单分枝杆菌酸酯(tmm)和海藻糖二分枝杆菌酸酯(tdm)存在于分枝杆菌膜的最外部分中，如图2所描绘的。α,α-1,1-海藻糖是α-连接的二糖，包括通过α,α-1,1-葡糖苷键连接的两个α-葡萄糖单元。包含1-1α-葡糖苷键的结构使α,α-1,1-海藻糖对水解具有抗性并且在溶液中稳定，例如在高温和酸性条件下。除非另有说明，否则如本文中所用，术语“d-海藻糖”、“α,α-1,1-海藻糖”和“α,α-海藻糖”可互换使用,以指α,α-1,1-形式的海藻糖。
在某些情况下，碳水化合物部分是海藻糖的异构形式，诸如α,β-海藻糖(也称为新海藻糖)或β,β-海藻糖(也称为异海藻糖)，或其水合物。在某些情况下，碳水化合物部分是海藻糖寡糖。如本文中所用，术语“海藻糖寡糖”是指包含海藻糖作为基础组分的寡糖(例如，三糖或四糖)，其中一个、两个或更多个任选的另外的糖连接于其。在某些情况下，海藻糖寡糖是二糖海藻糖。在主题海藻糖寡糖中可以使用任何方便的糖(例如，单糖或二糖)，包括但不限于glc、galf、gal、lgal、man、all、laii、gul、lido、tal、ribf、rib、araf、ara、laraf、lara、xyl、lyx等。在一些情况下，海藻糖寡糖选自glcα1-4海藻糖、glcβ1-6海藻糖、glcβ1-6glcβ1-6海藻糖、galα1-6galα1-6海藻糖，以及在其葡萄糖残基之一上具有α1-6gal并且在另一个葡萄糖残基上具有α1-4glc的海藻糖。除非另有说明，否则本文所述的所有单糖代码均具有其标准含义。例如，glc指d-葡萄糖，gal指d-半乳糖。在一些情况下，海藻糖寡糖部分包括包含5个或更多个单元，诸如10个或更多个，20个或更多个，30个或更多个，40个或更多个，50个或更多个，100个或更多个，200个或更多个，或甚至更多个糖单元的含有海藻糖的寡糖。
在一些实施方案中，碳水化合物部分是任何方便的碳水化合物的衍生化形式。在本文中，碳水化合物的衍生物是基于天然存在的碳水化合物的分子，其中一个或多个羟基或氢原子被其它化学部分(本文中的衍生基团)取代，该衍生基团基本上不影响探针分子与靶酶(例如，ag85a、b或c)的活性部位接合的能力，因此不阻止碳水化合物-染料缀合物掺入至分枝杆菌中。在某些情况下，此类衍生基团不抑制与缀合物掺入至放线菌或分枝杆菌中相关的反应。另外，在一些实施方案中，选择此类衍生基团以便不在探针分子中引入不稳定性，例如通过在同一碳原子上提供两个阴离子和/或亲核基团，例如在同一碳原子上提供两个氢氧基团、氢氧化物和醚基，或氢氧化物和卤化物基团。在一些实施方案中，碳水化合物或其衍生物在碳水化合物底物分子的每个碳原子上具有不超过一个这样的衍生基团。衍生基团的实例包括：卤素、氨基、取代的氨基、任选取代的直链或支链烷基、链烯基或炔基和任选地取代的芳基或杂芳基。
在一些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物具有式(i)：
其中：
z是具有1至5个单糖单元(例如，1个或2个单糖单元)的碳水化合物或碳水化合物衍生物，其通过桥连基团或杂原子(x)以a或β构型与c1连接；
r1为h、烷基或取代的烷基；
r2至r9各自独立地为h、oh、烷氧基、取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、卤素(例如氟)、硫醇、烷硫基、取代的烷硫基或连接的溶剂化显色染料。在式(i)的某些实例中，x为-o-。在式(i)的某些情况下，x为-nh-。在式(i)的某些情况下，z为单糖或单糖衍生物。
在一些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物具有式(ii)的结构
其中r1为h、烷基或取代的烷基；z1-z7中的一个为连接的溶剂化显色染料,并且z1-z7中的其余部分独立地选自h、oh、烷氧基、取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、卤素(例如氟)、硫醇、烷硫基、取代的烷硫基。在式(ii)的某些情况下，z1-z7中的一个且仅一个是连接的溶剂化显色染料，并且z1-z7中的其余部分为oh。在式(ii)的某些实施方案中，z1为连接的溶剂化显色染料。在式(ii)的某些实施方案中，z2为连接的溶剂化显色染料。在式(ii)的某些实施方案中，z3为连接的溶剂化显色染料。在式(ii)的某些实施方案中，z4为连接的溶剂化显色染料。在式(ii)的某些实施方案中，z5为连接的溶剂化显色染料。在式(ii)的某些实施方案中，z6为连接的溶剂化显色染料。在式(ii)的某些实施方案中，z7为连接的溶剂化显色染料。在式(ii)的一些实例中，z1-z7中的一个且仅一个为连接的溶剂化显色染料，并且z1-z7中的其余部分为oh。在式(ii)的某些实施方案中，r1为h。在式(ii)的某些实施方案中，r1为烷基(例如，低级烷基)。在式(ii)的某些实施方案中，r1为取代的烷基。
在式(ii)的一些实例中，碳水化合物-染料缀合物具有式(iii)：
其中r1为h、烷基或取代的烷基；z1-z4中的一个且仅一个为连接的溶剂化显色染料，并且z1-z4中的其余部分独立地选自h、oh、烷氧基、取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、卤素(例如氟)、硫醇、烷硫基、取代的烷硫基。在式(iii)的一些实例中，z1-z4中的一个且仅一个为连接的溶剂化显色染料，并且z1-z4的其余部分为oh。在式(iii)的某些实施方案中，z1为连接的溶剂化显色染料。在式(iii)的某些实施方案中，z2为连接的溶剂化显色染料。在式(iii)的某些实施方案中，z3为连接的溶剂化显色染料。在式(iii)的某些实施方案中，z4为连接的溶剂化显色染料。在式(iii)的某些实施方案中，r1为h。在式(iii)的某些实施方案中，r1为烷基(例如，低级烷基)。在式(iii)的某些实施方案中，r1为取代的烷基。
式(ii)和(iii)的某些实施方案，碳水化合物-染料缀合物具有式(iv)：
其中l为任选的接头，dye为溶剂化显色染料，r1为h、烷基或取代的烷基。
在式(ii)和(iii)的某些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物具有式(v)：
其中l为任选的接头，dye为溶剂化显色染料，r1为h、烷基或取代的烷基。
式(ii)和(iii)的某些实施方案，碳水化合物-染料缀合物具有式(vi)：
其中l为任选的接头，dye为溶剂化显色染料，r1为h、烷基或取代的烷基。
在式(ii)和(iii)的某些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物具有式(vii)：
其中l为任选的接头，dye为溶剂化显色染料，r1为h、烷基或取代的烷基。
在式(ii)的某些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物具有式(viii)：
其中l为任选的接头，dye为溶剂化显色染料，r1为h、烷基或取代的烷基。
在式(ii)的某些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物具有式(ix)：
其中l为任选的接头，dye为溶剂化显色染料，r1为h、烷基或取代的烷基。
在式(ii)的某些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物具有式(x)：
其中l为任选的接头，dye为溶剂化显色染料，r1为h、烷基或取代的烷基
在式(iv)至(x)的某些实施方案中，r1为h。在式(iv)至(x)的某些实施方案中，r1为烷基(例如，低级烷基，诸如甲基)。在式(iv)至(x)的某些实施方案中，r1为取代的烷基。在式(iv)至(x)的某些实施方案中，l为-nh-l1-，其中l1为接头，诸如烷基或取代的烷基。在式(iv)至(x)的某些实施方案中，l包含-nh-co-。在式(iv)至(x)的某些实施方案中，l包含-nhc(＝x)nh-，其中x为o或s。在式(iv)至(x)的某些实施方案中，l包含-nhc(＝o)o-。在式(iv)至(x)的某些实施方案中，l为烷基或取代的烷基接头。
溶剂化显色染料部分
如上所概述的，溶剂化显色染料的颜色和/或透明度取决于染料的直接环境。溶剂极性以及氢键和其它环境因素在决定基态和激发态能级方面起着重要作用，这反过来又决定了染料的颜色和/或透明度。如本文中所用，术语“溶剂化显色染料”是指可检测的染料分子，其由于溶剂极性的变化而表现出光谱性质的可检测的变化。光谱性质变化可以包括随着溶剂极性的增加而伴随的颜色的变化(即，最大吸收或发射波长的波长偏移)。在一些情况下，光谱性质变化可包括随着溶剂极性增加而伴随的摩尔吸光系数或量子产率的变化。
任何方便的溶剂化显色染料可以适用于主题碳水化合物-染料缀合物。溶剂化显色染料可以在染料和碳水化合物部分的任何方便位置处与碳水化合物部分(例如，如上所述的)连接，以产生能够被靶细菌细胞摄取的碳水化合物-染料缀合物。目标溶剂化显色染料包括但不限于部花青染料，reichardt染料，1-二十二烷基-4-(4-羟基苯乙烯基)-溴化吡啶
在式(i)-(x)的一些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物的连接的溶剂化显色染料具有式(xi)：
其中：
b为任选的稠合5或6元芳基或杂芳基环，任选地进一步被一个或多个z取代基取代，所述z取代基独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素(例如氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基、硝基、羧基、烷氧基、取代的烷氧基；
y为一个或多个独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素(例如，氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基、硝基、烷氧基和取代的烷氧基的取代基，其中至少一个y或z为-nr2；
r1选自h、烷基和取代的烷基；以及
其中至少一个z、y或r1通过任选的接头与缀合物的碳水化合物部分连接。在式(xi)的某些实施方案中，r1与缀合物的碳水化合物部分连接。
在式(xi)的某些实例中，碳水化合物-染料缀合物具有以下结构：
其中l为任选的接头，r1是如上所定义的。
在式(i)-(x)的一些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物的连接的溶剂化显色染料具有式(xii)：
其中：
a为芳基或杂芳基系，其包含至多三个5或6元环，任选地进一步被一个或多个z取代基取代，所述z取代基独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素(例如，氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基和硝基；
n为0或1；
每个r和r21独立地选自h、烷基和取代的烷基；并且r28-r31各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、卤素(例如氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基和硝基；
其中z、r21和r28-r31中的至少一个通过任选的接头与缀合物的碳水化合物部分连接。
在式(xii)的某些情况下，碳水化合物-染料缀合物具有以下结构：
其中l为任选的接头，r1是如上所定义的。
在式(i)-(x)的一些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物的连接的溶剂化显色染料具有式(xiii)
其中：
r11、r15和r16独立地选自h、烷基和取代的烷基；并且r12-r14和r17-r19各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、卤素(例如氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基和硝基；
其中r11、r12-r14、r17-r19中的至少一个通过任选的接头与缀合物的碳水化合物部分连接。
在式(xiii)的某些实例中，碳水化合物-染料缀合物具有以下结构：
其中l为任选的接头，r1是如上所定义的。
在式(i)-(x)的一些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物的连接的溶剂化显色染料具有式(xiv)：
其中：
b为任选的稠合的5或6元芳基或杂芳基环，任选地进一步被一个或多个z取代基取代，所述z取代基独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素(例如氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基、硝基、羧基、烷氧基、取代的烷氧基；
y为一个或多个独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素(例如氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基、硝基、烷氧基和取代的烷氧基的取代基，
r1选自h、烷基和取代的烷基；以及
其中r1、y和z中的至少一个通过任选的接头与缀合物的碳水化合物部分连接。在一些情况下，至少一个y或z为-nr2。
在式(i)-(x)的一些实施方案中，碳水化合物-染料缀合物的连接的溶剂化显色染料具有式(xv)：
其中：
x为o、s或nr1；
y为一个或多个独立地选自h、烷基、取代的烷基、卤素(例如氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基、硝基、烷氧基和取代的烷氧基的取代基；
每个r1独立地选自h、烷基和取代的烷基；以及
其中r1和y中的至少一个通过任选的接头与缀合物的碳水化合物部分连接。
在式(i)-(xv)的一些实施方案中，连接的溶剂化显色染料具有式(xvi)-(xxv)之一：
其中，
r1、r5、r6、r11、r15、r16、r21、r25、r26、r33-r35、r36、r51、r60和r61独立地选自h、烷基和取代的烷基；以及
r2-r4、r7-r9、r12-r14、r17-r19、r22-r24、r27-r32、r37-r40和r52-r59各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、卤素(例如、氯或氟)、羟基、氨基、取代的氨基、氰基和硝基；
其中r1-r61中的至少一个通过任选的接头与缀合物的碳水化合物连接。
式(i)-(xxv)的某些实施方案、溶剂化显色染料选自以下结构之一：
其中每个r独立地为h、烷基或取代的烷基，并且溶剂化显色染料通过任何方便的位置与碳水化合物部分连接。在某些情况下，每个r独立地为h或低级烷基诸如甲基或乙基。
在式(i)-(xxv)的某些实施方案中，溶剂化显色染料选自以下结构之一：
其中每个r独立地为h、烷基或取代的烷基，并且溶剂化显色染料通过任何方便的位置与碳水化合物部分连接。在某些情况下，每个r独立地为h或低级烷基诸如甲基或乙基。
在式(i)-(xxv)的某些实施方案中，溶剂化显色染料选自以下结构之一：
其中每个r独立地为h、烷基或取代的烷基，并且溶剂化显色染料通过任何方便的位置与碳水化合物部分连接。在某些情况下，每个r独立地为h或低级烷基诸如甲基或乙基。
在式(i)-(xxv)的某些实施方案中，溶剂化显色染料选自以下结构之一：
其中每个r独立地为h、烷基或取代的烷基，并且溶剂化显色染料通过任何方便的位置与碳水化合物部分连接。在某些情况下，每个r独立地为h或低级烷基诸如甲基或乙基。
在式(i)-(xxv)的某些实施方案中，溶剂化显色染料具有以下结构：
其中每个r独立地为h、烷基或取代的烷基，并且溶剂化显色染料通过任何方便的位置与碳水化合物部分连接。在某些情况下，一个r与碳水化合物部分连接。
在式(i)-(x)的某些实例中，连接的溶剂化显色染料选自4-dmap、4-dmn、6-dmn、尼罗红、3-hc、3-mc、prodan、anthradan、nbd及其衍生物。在式(i)-(x)的某些情况下，连接的溶剂化显色染料为4-dmap。在式(i)-(x)的某些情况下，连接的溶剂化显色染料为4-dmn或6-dmn。在式(i)-(x)的某些情况下，连接的溶剂化显色染料为尼罗红。在式(i)-(x)的某些情况下，连接的溶剂化显色染料为3-hc。在式(1)-(x)的某些情况下，连接的溶剂化显色染料为prodan。在式(i)-(x)的某些情况下，连接的溶剂化显色染料为anthradan。在式(i)-(x)的某些情况下，连接的溶剂化显色染料为nbd。
在式(i)-(x)的某些实例中，连接的溶剂化显色染料选自以下结构之一：
或其类似物，其中溶剂化显色染料在任何可用位置(例如，r位置)与碳水化合物连接。
另外，图6和图7提供了根据实施方案的几种特定海藻糖-荧光溶剂化显色染料缀合物的实例，根据本公开的实施方案，所述海藻糖-荧光溶剂化显色染料缀合物已证明了它们在几种活放线菌菌株的检测中的实用性，或者预期在所述检测中表现良好。具体而言，图6显示了溶剂化显色海藻糖探针/缀合物，其基于邻苯二甲酰亚胺和萘二甲酰亚胺染料，包括dmn-tre(1-3)；尼罗红染料，其中染料的不同位置用于通过不同长度的接头连接海藻糖(4-5)；和3-羟基色酮染料的变化形式，其中染料的芳基被改变以修饰染料的荧光信号，通过不同长度的接头连接至海藻糖(6-8)。
检测细菌的方法
本公开内容提供了检测生物样品中的活细菌的方法。在许多实施方案中，所述方法通常包括：a)使待测试的生物样品(例如，含有或怀疑含有目标活细菌细胞的生物样品)与碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物(例如，如本文中所述的)接触；和b)检测由于与测试样品相互作用时染料局部环境的改变而产生的来自染料的光谱信号。在许多实施方案中，检测方法中使用的溶剂化显色染料是发荧光的，并且待测光谱信号是荧光。在许多实施方案中，染料的荧光被打开(增强)以通过与靶标的相互作用产生可检测的信号，同时在未遇到靶标的情况下保持不可检测。在许多实施方案中，用于检测的目标细菌是放线菌，诸如分枝杆菌。
来自缀合物的溶剂化显色染料的光谱信号(诸如，例如荧光)的检测表明样品中存在靶代谢活性细菌细胞，因为靶细胞将代谢地标记缀合物，导致标记的缀合物被摄取至细菌细胞壁中，其中溶剂化显色染料显示光谱性质的变化。在一些情况下，靶细菌细胞包括含有分枝杆菌酸的细胞壁。在某些情况下，发荧光的碳水化合物-溶剂化显色染料缀合物是海藻糖-溶剂化显色染料缀合物(例如，如本文中所述的)，其被靶细菌细胞的分枝杆菌酸代谢地标记。在某些实施方案中，活的细菌细胞是靶分枝杆菌属。
本公开的方法提供样品中少至104个靶活细菌细胞(例如，分枝杆菌)，诸如样品中少于5x103个，少于103个，少于5x102个，少于102个，少于50个，或少于10个靶细菌细胞(例如，分枝杆菌)的检测。在一些情况下，主题方法提供对生物样品中5x103/ml的靶活细菌细胞或更少，诸如103/ml或更少，5x102/ml或更少，102/ml或更少，50/ml或更少，或10/ml或更少的分枝杆菌的检测。
在一些情况下，主题方法提供靶分枝杆菌的500个菌落形成单位(cfu)/ml或更少，诸如200cfu/ml或更少，100cfu/ml或更少，90cfu/ml或更少，80cfu/ml或更少，70cfu/ml或更少，60cfu/ml或更少，50cfu/ml或更少，40cfu/ml或更少，30cfu/ml或更少，20cfu/ml或更少，10cfu/ml或更少，8cfu/ml或更少，6cfu/ml或更少，5cfu/ml或更少，4cfu/ml或更少，3cfu/ml或更少，2cfu/ml或更少或甚至更少的检测。可以使用任何方便的方法(例如显微镜方法、比色细菌细胞测定等)来检测样品中的细菌细胞和目标细菌细胞菌落形成单位。
主题方法可用于鉴定和区分生物样品中代谢活性分枝杆菌与非代谢活性分枝杆菌及其它微生物。主题方法可用于鉴定和区分靶分枝杆菌与非靶分枝杆菌。非靶分枝杆菌可包括非放线菌或分枝杆菌的微生物，其可具有代谢活性或不具有代谢活性。
可以使用本公开的方法检测的分枝杆菌包括任何方便的分枝杆菌物种。目标分枝杆菌包括但不限于表1中提供的那些分枝杆菌，包括结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌(或鸟-胞内分枝杆菌)、麻疯分枝杆菌(特别是导致结核样麻疯的麻疯分枝杆菌)、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、诺卡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿分枝杆菌、斯氏分支杆菌、療病分枝杆菌、玛尔摩尔分枝杆菌，土-无色分枝杆菌复合群、嗜血分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、中庸分枝杆菌、汇合分枝杆菌、三重分枝杆菌、慢生黄分枝杆菌、布氏分枝杆菌、出众分枝杆菌、库氏分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、海分枝杆菌戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌和m.mucogenicum。虽然来自人的生物样品中的分枝杆菌的检测是感兴趣的，来自非人受试者的分枝杆菌生物样品的检测也是有意义的。例如，鸟分枝杆菌导致屠宰猪的淋巴结炎；副结核分枝杆菌(m.paratuberculosis)感染导致副结核病，这是一种类似结核病的疾病，其可导致牛、绵羊和山羊的巨大生产损失；并且牛分枝杆菌(m.bovis)由牛携带，其可引起人的结核菌样感染。因此，在一些情况下，生物样品来自猪；并且本公开的方法检测生物样品中的鸟分枝杆菌。在一些情况下，生物样品获自牛、绵羊或山羊；并且本公开的方法检测生物样品中的副结核分枝杆菌。目标分枝杆菌包括携带分枝杆菌酸膜的动物和植物病原体。在一些情况下，可以靶向作为棒杆菌亚目的一部分的细菌。在某些情况下，主题方法可适用于检测棒杆菌科的细菌，诸如谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)或白喉棒杆菌。
在一些实施方案中，生物样品获自人；本公开的方法检测生物样品中的结核分枝杆菌。在一些情况下，个体患有人免疫缺陷病毒(hiv)感染，此外还患有或怀疑患有tb或有感染tb的风险。在一些情况下，个体生活在tb流行的地区。在一些情况下，个体是军事人员。在一些情况下，个体被监禁(例如，住在监狱中)。在一些情况下，个体是免疫受损的。
“生物样品”包括从个体或一组个体直接(例如，从身体抽取或擦拭)或间接(例如从个体或组的环境，诸如空气、水或无生命的表面)获得的各种样品类型，并且可用于诊断或监测分析。该定义包括血液和生物来源的其它液体样品、固体组织样品诸如活检样本或组织培养物或源自其的细胞及其后代。应当理解的是，可能含有目标生物样品(通过，例如，直接接触)的空气或水样或固体无生命表面或物体，诸如空气或水过滤器、房间墙壁或窗户或实验室设备，也包括在内。该定义还包括在其获得后以任何方式(诸如通过试剂处理、增溶或富集某些组分诸如多核苷酸)操作的样品。术语“生物样品”包括临床样品，并且包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血液、血清、血浆、生物液体、口腔拭子(例如，颊拭子)和组织样品。生物流体包括痰、口腔拭子唾液、脑脊髓液、尿液、支气管肺泡灌洗液等。在一些实施方案中，样品是痰样品。在其它实施方案中，样品是口腔拭子(例如，颊拭子)。在其它实施方案中，样品是空气过滤器。
通常，在体外进行主题方法。可以使用任何方便的方法使样品与缀合物接触。在一些情况下，在其中缀合物被摄取至细菌细胞的细胞壁(如果存在的话)的条件下使样品与缀合物接触。在一些情况下，对于缀合物的代谢标记和其至靶细菌细胞中的摄取，可以使用适当的溶液来维持细胞的活力。所述溶液可以是平衡盐溶液，例如生理盐水、pbs、hank's平衡盐溶液等，其方便地补充有与低浓度(例如从5mm至25mm)的可接受的缓冲液结合的胎牛血清、人血小板裂解物或其它因子。在一些其它实施方案中，通过使所述样品通过在其样品接触表面上具有缀合物的空气或水过滤器，使分散在空气或水中的目标样品与检测缀合物接触。
进行样品与溶剂化显色染料-糖缀合物接触的温度可以变化，并且在一些情况下可以在5℃至50℃，诸如10℃至40℃，15℃至40℃，20℃至40℃的范围内，例如，20℃、25℃、30℃、35℃或37℃。在一些情况下，选择接触发生时的温度以与靶细菌(例如靶分枝杆菌)和/或样品的其它组分的生物活性或活力相容。在某些情况下，温度为25℃、30℃、35℃或37℃。在某些情况下，接触发生时的温度为室温(例如，25℃、30℃、35℃或37℃)。可以选择用于孵育接触的样品的任何方便的孵育时间以允许将所需量的缀合物掺入至靶细菌细胞中，并且在一些情况下，所述孵育时间可以是1分钟(min)或更长，诸如2min或更长，10min或更长，30min或更长，1小时或更长，2小时或更长，6小时或更长，12小时或更长，或甚至24小时或更长。
主题方法提供了不需要洗涤步骤的方法，例如，在检测之前将样品中的细胞固定和/或洗涤以除去可能引起背景信号的过量染料试剂。在主题方法中，可以直接对接触样品进行检测。
在一些情况下，可以在检测之前稀释样品。稀释可以在任何方便的缓冲液中进行至已知体积，以帮助定性或定量检测样品中的靶细菌细胞。
检测荧光可以包括用一种或多种激光激发荧光染料(例如，缀合物的发荧光的溶剂化显色染料)，随后使用一种或多种光学检测器检测来自染料的荧光发射。在一些实施方案中，该方法还包括对标记的微生物进行计数、分选或者计数和分选。可以根据需要通过将溶剂化显色染料暴露于激发光并测量在一个或多个检测通道中产生的荧光来检测和独特地鉴定溶剂化显色染料。
激发光可来自一个或多个光源，并且可以是窄的或宽带的。激发光源的实例包括激光器、发光二极管和灯，包括汞灯或氙灯、弧光灯、闪光灯、白炽灯泡或适于激发荧光的任何其它光源。在用于鉴定溶剂化显色染料和与其相关的组分的检测通道中发射的荧光可以在用单个光源激发后测量，或者可以在用不同光源激发后分开测量。可以选择溶剂化显色染料，使得染料可以被所使用的目标激发光源激发。任何方便的显微镜检查方法都可用于主题方法的检测步骤。
在一些实施方案中，检测涉及定性测定样品中靶细菌细胞的存在。在某些情况下，靶细菌细胞是已感染宿主细胞的细菌细胞。定性测定可包括观察来自感染细胞的组分(例如来自靶细菌细胞的细胞壁)的特征荧光。在一些情况下，检测可涉及定量测定样品中靶细菌细胞的数量。定量测定可包括计数阳性荧光细胞对比阴性对照细胞的细胞数量(例如，每个样品，每单位体积，ml)。在某些情况下，阴性对照细胞可显示出一些微小的背景荧光，其可以容易地与标记的靶细胞的荧光区分开。
在感染的治疗期间监测细菌细胞
如本文中所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得所需的药理学和/或生理学效应。就完全或部分预防疾病(例如，分枝杆菌感染)或其症状而言，该效应可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病(例如，分枝杆菌感染)和/或可归因于疾病(例如，分枝杆菌感染)的不利效应而言，可以是治疗性的。如本文中所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“治疗性(therapeutic)”或“疗法(therapy)”不一定意味着完全治愈或消除疾病或病况。在任何程度上对疾病或病况的任何不希望的体征或症状的任何减轻都可被认为是治疗和/或疗法。此外，治疗可能包括可使患者的总体健康感或外观感恶化的行为。如本文中所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人中疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病(例如，分枝杆菌感染)在可能易患该疾病(例如，分枝杆菌感染)但尚未被诊断为患有其的受试者中发生；(b)抑制疾病(例如，分枝杆菌感染)，即阻止其发展；和(c)缓解疾病(例如，tb感染)，即引起疾病(例如，分枝杆菌感染)消退。
本公开的方面包括检测和监测在治疗或预防受试者的感染期间从受试者间隔采集的多个样品中的靶细菌细胞的方法。在一些实施方案中，受试者感染了分枝杆菌(例如，如本文所述，诸如结核分枝杆菌)。可以在一个或多个时间点(包括但不限于，在诊断时、抗感染治疗之前、期间和/或之后)测试此类个体；并在不同时间点监测疾病进展。因此，该方法的方面包括在治疗(例如，向受试者施用抗感染剂)之前、期间和/或之后从患有细菌感染的受试者收集一个或多个样品。在一些情况下，根据主题方法在治疗前对受试者取样以检测靶细菌还包括诊断受试者中的感染。例如，在一些情况下，在第一时间点从个体获得生物样品，并且在生物样品中检测靶细胞；在第二时间点从个体获得生物样品，并在生物样品中检测靶细胞；以及将来自第二时间点的生物样品中检测到的靶细胞的数量与来自第一时间点的生物样品中检测到的靶细胞的数量进行比较，其中第二时间点在第一时间点之后(例如，在第1时间点之后1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至24小时，1天至1周，1周至1个月，1个月至6个月，6个月至1年，或一年以上)。
主题方法的方面包括定量样品中的靶代谢活性细菌细胞，使得可以监测细胞随时间推移的水平以评估治疗方法的效力。因此，样品的收集可以在治疗之前和治疗期间的一个或多个时间点或治疗之后进行。根据监测结果，可以调节抗感染治疗方法以提供理想的治疗结果，例如，治疗剂量或方案可以根据随时间推移在样品中定量的靶代谢活性细菌细胞的量的变化而改变。
在一些实施方案中，该方法包括向此有需要的受试者施用治疗有效量的抗感染剂，例如抗真菌剂，如根据本申请的实施方案的治疗监测方法的发现所指导的。在某些情况下，受试者除靶细菌感染外还患有hiv感染，并且在样品中表现出相对低数量的靶细菌细胞。主题方法用于检测此类样品中的靶细胞。
测定细菌的药物敏感性/抗性
主题方法的方面包括快速检测耐药细菌。因此，在一些实施方案中，主题缀合物可用于区分对治疗有抗性的细菌与被治疗成功靶向的细菌。在许多此类实施方案中，根据可用治疗计划的数量将目标样品分成多个样品。然后，根据其指定的治疗计划处理每个新样品，同时以预定间隔对其用缀合探针进行处理。在许多实施方案中，对治疗具有抗性并因此保持其细菌活力的样品将继续摄取缀合物并产生可检测的信号。相反，对指定治疗敏感的样品将不能产生可测量的信号，因为其代谢摄取缀合物的能力在没有活细菌的情况下受到损害。本文所述的测试耐药性的方法是显著的改进，包括在速度方面，超过目前用于测定例如临床mtb分离株的药物敏感性的实践，所述实践通常依赖于基于pcr的方法(测试已知的抗性基因)或在药物存在的情况下样品的长时间(长达6周)培养。形成鲜明对比的是，在一些根据本申请的实施方案研究分枝杆菌对tb药物混合物的抗性的实例中，发现dmn-tre标记在数小时内受到药物作用的影响，因此这种显微镜检验的结果可在样品采集当天获得。
在一些情况下，主题方法包括检测和/或鉴定例如来自正在接受治疗的受试者的样品中的耐药细菌细胞。可以根据检测或鉴定的耐药细菌的类型和数量来调整抗感染剂的治疗方案或类型。因此，可将主题方法与治疗感染病况的方法结合进行。
治疗实用性
主题组合物和方法可用于各种诊断、研究和治疗应用。主题方法组合物和方法可用于其中靶细菌细胞(诸如能够代谢标记和摄取主题碳水化合物-染料缀合物的靶细菌细胞)的鉴定具有意义的任何应用。
目标诊断应用包括但不限于实施主题检测方法以提供感染的诊断。目标治疗应用包括但不限于在抗感染治疗之前、期间和/或之后监测抗感染治疗的进展，以及基于耐药细菌细胞的检测选择和/或调整所需的治疗方案或抗感染药剂的类型。在一些实施方案中，主题方法可用于直接检测患者样品中的病原性细菌，诸如mtb，或监测正在治疗感染的患者样品中的病原性细菌水平。在其它实施方案中，主题方法可用于测定靶细菌或生物体对一组可能的治疗剂的敏感性。
示例性实施方案
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人视为其发明的范围，它们也不打算表示以下实验是全部或仅进行的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，以及压力均为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基对；pi，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内(地)；i.p.，腹膜内(地)；s.c，皮下(地)；等等。
以下实施例证明了根据本发明的实施方案的分枝杆菌检测方法的各种特征和有利方面，其主要依赖于与溶剂化显色染料4-n,n-二甲氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(dmn)缀合的海藻糖(本文中称为“dmn-tre”的试剂)。在许多实施方案中，dmn-tre被代谢地掺入到分枝杆菌膜中，其中其经历荧光的显著增强，使得能够在一小时内检测tb患者痰样品中的分枝杆菌(根据图5中示意性描绘的过程)。与经典的zn和金胺染色不同，dmn-tre选择性地标记活的mtb细胞，并且这种标记受到对一线tb药物的暴露抑制。这种操作简单的方法需要单个孵育步骤，没有洗涤，因此可以在护理点有力地补充当前用于tb诊断的方法。
实施例1.用dmn-tre缀合物检测分枝杆菌
首先，合成dmn-tre缀合物，以及两种对照化合物dmn-葡萄糖(dmn-glc)和非荧光类似物6-荧光素-海藻糖(6-fitre)，如图8所示，其中这些结构相应地标记为(1)、(2)和(3)。在确认dmn-tre的荧光性质与针对游离染料报道的那些性质(包括在溶解于有机溶剂对比水中时的荧光强度有约700倍增强)相似后，测试来自放线菌门的几种菌株以评估dmn-tre标记具有分枝杆菌膜的细菌的能力。具体地，将每个处于指数生长期的耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)(msmeg)、谷氨酸棒杆菌(cg)和海分枝杆菌(mm)与100μmdmn-tre或其非荧光类似物6-fitre一起分别孵育1、2和6小时，然后成像，不洗涤。用dmn-tre观察所有三种物种的明亮荧光标记，在周围溶液中没有源自游离dmn-tre的可辨别的背景荧光(图9a)。相反，用6-fitre标记的细胞被周围溶液中探针的荧光遮蔽。需要大量洗涤以从细胞及其碎片中除去非特异性结合的6-fitre，与用dmn-tre标记的那些相比，使得特异性标记的细胞难以辨别。这些图像是通过使用标准fitc/gfp滤光器组获得的，但通过在405nm处(更接近dmn的激发最大值)激发能获得甚至更亮的图像。为此，图9b显示使用fitc/gfp滤光器组(488nm激发，530nm发射)或aquaamine滤光器组(405nm激发，512nm发射)，利用100μmdmn-tre处理1小时的msmeg细胞的流式细胞术分析。从该图中可以看出，当在接近400nm的波长下激发时，标记的msmeg细胞(蓝色)显示出比对照样品(红色)更高的荧光信号。
还进行了测定标记动力学的时间进程。如上所述将在指数生长期收获的msmeg和cg进行孵育并在不同时间点成像。如图10所示，在第一时间点-5分钟(对于msmeg)和3分钟(对于cg)时已经可见标记。虽然cg在分析的最早时间点显示出均匀的细胞表面标记，而msmeg仅在极区显示荧光，这与分枝杆菌物种中已知的极性生长一致。该信号在细胞长度上扩散，使得1小时后，msmeg细胞被均匀标记。这些实验证明了根据本申请的实施方案进行的分枝杆菌检测方法的前所未有的速度。
实施例2.dmn-tre缀合物对分枝杆菌的选择性
dmn-tre作为诊断工具(包括用于诊断tb)的潜力取决于其在其它细菌物种中对分枝杆菌的选择性。因此，为了测试其选择性，将经典革兰阴性和革兰阳性生物体(枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)(bs)，大肠杆菌(escherichiacoli)(ec)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)(lm)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(sa))与dmn-tre一起孵育。图11a提供了该测试的结果，其中，在没有洗涤的情况下，没有非分枝杆菌菌株显示通过缀合物(“dmn”行)的任何可检测的荧光标记，而通过光学显微镜在所有测试样品中确认了细菌存在(“dic”行)，并且通过所使用的两种检测方法的叠加(“合并”行)进一步确认整体标记结果。在同一实验中，分枝杆菌cg被dmn-tre明亮标记。鉴于游离海藻糖在这些其它细菌物种中作为渗透保护剂和热保护剂起重要作用，这种特异性是惊人的。此外，将表达mcherry的分枝杆菌msmeg与革兰阴性和阳性细菌以1:10的分枝杆菌/其它细菌比例组合，并将该混合物与hoechst染料(一种dna染色)(以检测所有存在的物种)和dmn-tre(仅检测分枝杆菌)一起孵育1小时。仅观察到msmeg细胞的明亮的特异性dmn-tre标记(图11b)，证明了dmn-tre缀合物对分枝杆菌的检测具有高特异性。
实施例3.分枝杆菌对dmn-tre缀合物摄取的代谢性质
进行一系列实验以证实dmn-tre标记是由于在分枝杆菌膜内代谢转化或海藻糖霉菌酸酸而非非特异性插入至分枝杆菌膜中引起的。首先，使用流式细胞术确认msmeg在20分钟内显示高于背景的显著的荧光(图12a)，并且>70％的细胞在30分钟内被标记(图12b)。具有相同染料但安装在葡萄糖上的dmn-glc不标记msmeg，表明海藻糖支架是观察到的来自dmn-tre处理的荧光信号的关键(图12c)。同样，在过量海藻糖存在下dmn-tre标记减少，表明在相同的生物合成途径中的竞争(图12d)。还评估了一小组msmeg海藻糖转运蛋白突变体的dmn-tre标记，并且发现dmn-tre掺入与野生型相当，表明标记主要通过ag85途径发生，与先前的研究一致。因此，ag85抑制剂依布硒啉以剂量依赖性方式减少msmeg细胞的dmn-tre标记(图12e)，并且与野生型相比，缺乏ag85a(ag85复合物的组分)的msmeg表现出减少的标记(图12f)。最后，通过tlc和质谱法分析来自dmn-tre-标记的cg的纯化糖脂，仅dmn-tre单分枝杆菌酸酯被检测为标记的物种。同样，通过串联质谱法观察到来自dmn-tre衍生的单分枝杆菌酸酯的脂质尾部的损失。
目前用于tb诊断的基于显微镜的方法不能区分活的分枝杆菌与死的分枝杆菌。鉴于dmn-tre标记似乎具有代谢性质并且依赖于分枝杆菌膜生物合成，假设本公开的方法对于活细菌是特异性的。实际上，通过加热杀死msmeg可以消除标记(图13a和13b)。相比之下，静止期的培养msmeg继续由dmn-tre标记，尽管强度水平低于对数期的msmeg(图13c)。一个有趣的问题是活细胞释放的活性ag85蛋白是否会在dmn-tre存在下引起附近死细胞的分枝杆菌膜标记。为了回答这个问题，将来自活的msmeg的培养物滤液在生长期在dmn-tre存在的情况下与热灭活的msmeg细胞一起孵育，并通过流式细胞术分析死细胞的荧光。如图13d所示，未观察到高于自发荧光水平的引类反式标记，表明dmn-tre标记是细胞自动的。
实施例4.dmn-tre缀合物在耐药性测试中的用途
评估了tb药物治疗对标记的影响。为此，用乙胺丁醇、利福平、异烟肼和sq109(每种剂量等于或高于诱导细胞杀伤的报告最低抑制浓度(mic))的混合物处理3小时的msmeg细胞丧失所有利用dmn-tre的可检测标记(图14a和图14b)。由于异烟肼是抑制被酶katg激活后分枝杆菌酸生物合成的前药，因此假设δkatg突变体对异烟肼对dmn-tre标记的作用具有抗性。如图14c所示，msmeg的δkatg突变体的dmn-tre标记不受异烟肼处理影响，而野生型msmeg受到影响。
实施例5.用dmn-tre缀合物检测病原性mtb
在已确定利用msmeg的dmn-tre标记的参数和机制基础后，注意力集中在用病原性mtb进行的研究上。mtb(h37rv)的液体培养物用dmn-tre可见地标记(图15a)，在30分钟内>65％的细胞被标记，并且标记继续加强过夜(约16小时；图15b)。该测定中的检测限似乎与金胺染色(约104cfu/ml)相当。然而，鉴于痰中的mtb的dmn-tre检测不需要热固定步骤，因此可能富集分枝杆菌，从而使通过显微镜的检测最大化。例如，根据用户的能力和设备容量，可能将样本浓缩成小体积，然后可以通过使其通过注射器而将其收集到过滤膜上。随后，可以将dmn-tre直接添加到膜上，然后进行成像。按照这种方法，已经确定检测限可以低至<50cfu/ml，这将是对金胺染色的显著改善。此外，与msmeg类似，在与dmn-tre孵育之前用药物混合物处理mtb细胞3小时导致细胞活力的显著降低，这反映在dmn-tre标记中(图15c)。相反，用商业的基于金胺的分枝杆菌染色染料(用于分枝杆菌的荧光染色试剂盒，sigma-aldrich，05151)进行标记不受先前药物混合物处理影响(图15d)。
此外，为了深入了解dmn-tre的潜在临床效用，尝试检测tb阳性患者痰样品中的mtb细胞。通过涂片镜检或genexpert获得来自16名未接受过治疗的tb阳性患者的痰标品。使用标准n-乙酰基-l-半胱氨酸-氢氧化钠(nalc/naoh)处理对样品进行去污染，然后将样品与dmn-tre一起孵育(图16)。最初，在用dmn-tre孵育2小时后对痰样品成像，在所有样品中都容易看到荧光mtb细胞(图17a和图17d)。随后，在dmn-tre与auramineo染色之间进行小规模涂片测试比较(图17b-d)。对于收集的16个痰样品，将每个样品分成两半，并将样品与dmn-tre一起孵育30分钟或用auramineo染色涂片(遵循标准试剂盒方案)。用这两种试剂在这些样品中检测到mtb细胞，尽管无洗涤dmn-tre方法比多步金胺方法简单得多。对于每种试剂，对于所有16个痰样品，在每个样品的8个视野中定量可见地染色的细胞的数量(图17c)。就药物处理前这些患者的痰中检测到的mtb细胞而言，dmn-tre与auramineo的表现相似。
总之，dmn-tre标记在其属性组合中似乎是独特的。与通过显微镜检测mtb细胞的经典方法不同，dmn-tre标记特异性地靶向分枝杆菌膜生物合成中的途径，因此报告了细菌身份和活力二者。dmn-tre的独特的溶剂化显色特性使得能够实现快速mtb成像而无需繁琐的洗涤步骤。当结合使用时，这些特性可使得能够在如同患者的痰一样复杂的样品中检测活mtb。
dmn-tre的独特的荧光激活模式允许操作简单的程序-单个孵育步骤。值得注意的是，发现dmn-tre在室温下在工作台上或运输容器中非常稳定，持续数周，甚至在37℃的水溶液中也是如此。因此，dmn-tre标记程序可以在资源匮乏环境中很好地转化为研究和临床应用。
实验材料和方法
用dmn-tre、dmn-glc或6-fitre代谢标记细菌
通过在5ml培养管(fishersci，14-959-11b)中将来自琼脂平板的单个菌落接种到补充有10％(v/v)油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶富集物(bblmiddlebrookoadc，目录号212351)、0.5％(v/v)甘油和0.05％(w/v)tween80(sigma，p1754)的具有或不具有抗生素(如果需要的话)的1毫升(ml)7h9液体培养基中来制备耻垢分枝杆菌(msmeg)或突变体的培养物。通过在5-ml培养管中将来自琼脂平板的单个菌落接种到1mlluria肉汤(invitrogen，12795-084)液体培养基中产生谷氨酸棒杆菌(cg)、枯草芽孢杆菌(bs)、大肠杆菌(ec)、单核细胞增生李斯特菌(lm)和金黄色葡萄球菌(sa)的培养物。通过在滚瓶或组织培养瓶中将1-ml冷冻原种接种到50ml补充有10％(v/v)油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶富集物(bblmiddlebrookoadc，212351)以及0.5％(v/v)甘油和0.05％(w/v)tween80(sigma，p1754)的middlebrook7h9液体培养基中来制备结核分枝杆菌(mtb)的培养物。使培养物生长至od600＝0.5以开始实验。将细菌培养物与终浓度为100μm(在7h9培养基中)的dmn-tre(图1b，1)或dmn-glc(2)或6-fitre(3)混合，并在37℃振荡或滚动孵育，再持续一个倍增时间(除非另有说明)。从在荧光探针不存在的情况下以相同方式处理的细胞获得媒介物对照。对于mtb，通过离心(10分钟，3,000×g)收获标记的细胞，然后在等体积的2.5％戊二醛中固定。将细胞在室温下孵育1小时，偶尔旋转管以确保在荧光分析之前对所有内表面进行灭菌。
流式细胞术
在代谢标记后(和在mtb细胞固定后)，通过离心(3分钟，3,300xg)收获细胞，洗涤(2x500微升(μl)pbs)并重悬于300μlpbs中。在适于流式细胞术的5-ml培养管(fishersci，14-959a)中进行荧光测量。在stanforduniversity的共享facs设施中的bdlsrii.uv仪器(nihs10共享仪器授权(s10rr027431-01))上进行数据收集。该仪器配备有405nm紫色激光和488nm蓝色激光(分别用于aquaamine和fitc通道)，两者均用于检测dmn-tre荧光。获得每个样品100,000个细胞的荧光数据，并使用flowjo(treestar)软件处理。实验以一式三份生物学重复中进行。
荧光显微镜术
在代谢标记(和mtb的固定)之后，将6μl细胞悬浮液点在载玻片上，用盖玻片覆盖并用粘合剂密封。在配备有planfluor60xoilimmersionna1.30物镜的nikonair共聚焦显微镜上进行显微镜检查。该仪器配备405nm紫色激光、488nm蓝色激光和561nm绿光激光(分别用于aquaamine、fitc/gfp和rfp通道)。nis-elementsar软件(nikon，inc。)用于处理图像。对于对照和测试样品，所有图像采集和处理都在相同的条件下进行。
dmn-tre的吸光度和荧光测量
将1μl在h2o中的10mmdmn-tre加入到1ml不同比例的二噁烷和水的混合物中。在variancary50uv-可见分光光度计上记录吸光度光谱。在配备有lps-220b75-w氙灯和电源(内置有集成式点火器、可切换的814光子计数/模拟光电倍增管检测单元和md5020电机驱动器的a-1010b灯)的photontechnologyinternationalquantamaster4l型扫描荧光分光光度计上记录荧光光谱。在1cmx0.4cm石英比色皿中进行测量，总样品体积为1ml。
通过dmn-tre和6-fitre进行的对msmeg、cg和海分枝杆菌的无洗涤成像
将msmeg或cg从单个菌落生长至od600为0.5(对于msmeg为37℃；对于cg为30℃)。向500μl培养物中加入5μl10mmdmn-tre或10mm6-fitre的水溶液。将细菌再孵育1小时(msmeg)或2小时(cg)，然后置于盖玻片下并直接成像。将海分枝杆菌(mm)作为od0.5原种储存在50％甘油/50％7h9+oadc中。将1ml该冷冻培养物解冻，将细菌沉淀(3分钟，3,300xg)并重悬于2ml补充有10％(v/v)油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶富集物(bblmiddlebrookoadc,212351)以及0.5％(v/v)甘油和0.05％(w/v)tween80(sigma，p1754的7h9液体培养基中。将细菌在33℃孵育过夜(约16小时)。向500μl的mm培养物中加入5μl的10mmdmn-tre或10mm6-fitre的水溶液。将细菌在33℃孵育6小时，然后置于盖玻片下并在不洗涤的情况下成像。
msmeg和cg随时间推移的无洗涤标记
如上所述，将msmeg或cg细胞从单个菌落生长至od600为0.5。向200μl培养物中加入2μl的10mmdmn-tre水溶液。在指定的时间点从该培养物中取出等分试样，立即置于盖玻片下，并成像。
具有非分枝杆菌膜的细菌的标记
将lm、bs、ec和sa在37℃下从单菌落生长过夜。将细菌稀释至od600为0.4。向1ml这些细菌的等分试样中加入10μl的10mmdmn-tre以达到100μm的终浓度。然后将细胞在37℃下孵育2小时。取等分试样并在盖玻片下对细胞进行成像。作为对照，还对来自同一od600＝0.4的培养物的细胞进行成像，而不添加dmn-tre。
在其它细菌物种存在的情况下选择性标记msmeg
如上所述，在培养基中振荡培养细菌(lm、bs、ec和sa)过夜。将细菌稀释至od600＝0.5，然后将500μl的每种培养物混合在一起以产生2ml混合细菌。将1ml表达mcherry的msmeg从单个菌落培养过夜至od600为0.5。通过离心(3分钟，3,300xg)沉淀两种培养物，并重悬于相同体积的lb培养基中。向540μl混合物中加入60μlmsmeg。最后，将含有msmeg和另外四种不具有分枝杆菌膜的细菌物种的该最终细菌混合物分成两个300μl的等分试样。向每组中加入0.3μl的2mg/mlhoechstdna染色剂(thermofisherscientific，62249)以对所有细菌进行染色。向两个等分试样中的一个中加入3μl的10mmdmn-tre，而不向另一部分加入dmn-tre。将两个等分试样在37℃下振荡孵育1小时，然后取出样品并在不洗涤的情况下成像。
耻垢分枝杆菌中dmn-tre标记的海藻糖竞争
如上所述，将msmeg从单个菌落生长至od600＝0.4。然后，将细菌分成100μl的等分试样。向这些等分试样中加入1μl10mmdmn-tre和1μl0mm、10mm或100mm海藻糖的水溶液。将细菌再生长1小时，用pbs洗涤两次，重悬于pbs中，并通过流式细胞术和显微镜检查。
依布硒啉抑制研究
如上所述，将msmeg从单个菌落生长至od600＝0.4。然后，将500μl等份的细菌培养物与25μg/ml、50μg/ml或100μg/ml依布硒啉(sigma-aldrich，60940-34-3)一起孵育3小时。向这些预处理的样品中加入5μl10mmdmn-tre。使培养物再生长1小时，用pbs洗涤两次，重悬于pbs中，并通过流式细胞术和显微镜检查。
生长期研究
将msmeg从单个菌落生长至od600＝0.5或od600>2。然后，将500μl等份的细菌培养物与5μl10mmdmn-tre孵育30分钟，用pbs洗涤两次，重悬于pbs中，并通过流式细胞术和显微镜检查。
药物处理的msmeg和mtb的dmn-tre标记
如上所述，将msmeg从单个菌落生长至od600＝0.4。然后，在37℃的大气培养箱中将500μl等份的细菌培养物与对照或药物混合物(混合物内容物：1μg/ml乙胺丁醇，0.2μg/ml利福平，10μg/mlsq109和10μg/ml异烟肼，于7h9培养基中)孵育3小时。向这些预处理的样品中加入5μl10mmdmn-tre。使培养物再生长30分钟，用pbs洗涤两次，重悬于pbs中，并通过流式细胞术和显微镜检查。
对于mtb，通过在滚瓶中将1-ml冷冻原种接种到50ml补充有10％(v/v)油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶富集物(bblmiddlebrookoadc，212351)、0.5％(v/v)甘油和0.05％(w/v)tween80(sigma，p1754)的middlebrook7h9液体培养基中来制备培养物。使细胞生长至od600＝0.5以开始实验。在37℃大气压培养箱中将500μl等分试样的细菌培养物与对照或药物混合物(混合物内容物：1μg/ml乙胺丁醇，0.2μg/ml利福平，10μg/mlsq109和10μg/ml异烟肼，于7h9培养基中)孵育3小时，然后与100μmndn-tre孵育过夜(约16小时)。通过离心(10分钟，3,000xg)收获标记的细胞，然后在等体积的2.5％戊二醛中固定。将细胞在室温下孵育1小时，偶尔旋转管以确保在荧光和流式细胞术分析之前对所有内表面进行灭菌。
患者招募和痰样品收集
该研究的伦理批准由威特沃特斯兰德大学人类研究伦理委员会提供(许可号：m110833)。该研究的参与者在初级保健诊所接洽；那些愿意参加的人被要求访问进行知情同意的研究诊所。此后，收集斑点或隔夜痰样品并运送到实验室进行处理。通过加入等体积的2.9％柠檬酸钠和4％氢氧化钠(nalc/naoh)对痰进行去污染，然后在室温下孵育20分钟。此后，以3900xg收获细菌细胞10分钟，并用4.5ml0.01m磷酸盐缓冲盐水(pbs)，ph7.4洗涤，然后重悬于2ml的补充有0.5％tween和oadc(油酸、白蛋白、右旋糖、过氧化氢酶；bectondickinson，southafrica)的middlebrook7h9培养基中。为了分散团块，在2mm玻璃珠存在的情况下将细胞短暂涡旋。
痰样品中的mtb的显微镜分析
如上所述分离来自tb患者的痰样品。向0.1ml的这些样品的等分试样中加入10μl10mmdmn-tre以达到1mm的终浓度。然后将样品在37℃下孵育指定的时间。将样品在终浓度为2.5％的戊二醛进行固定，并在室温下孵育1小时，偶尔旋转管以确保所有内表面的灭菌。在成像之前，将样品重悬于30μl的1xpbs中。
金胺对比dmn-tre涂片检查
根据试剂盒的标准条件进行金胺涂片。简言之，将nalc-naoh-去污染的痰样品涂在载玻片上并加热固定(加热块，95℃，5-10分钟)。然后用auramineo处理涂片5分钟，脱色，然后复染，然后在zeissobserverz1倒置荧光显微镜的fitc/gfp通道中观察。
对于dmn-tre标记，如下对相同样品进行染色：将100μl样品与1mmdmn-海藻糖在37℃下孵育30分钟，然后在2.5％戊二醛中固定1.5小时。然后将样品重悬于30μl1xpbs中，将其中的20μl安装在2％琼脂糖垫上，用于在zeissobserverz1倒置荧光显微镜的fitc和dic通道中观察。
菌落形成单位(cfu)铺板
为了测定cfu，根据需要处理细胞，并在完全7h9培养基中产生10倍系列稀释液，并在含有10％oadc和0.05％甘油(v/v)而没有抗生素的middlebrook7h10琼脂平板(difco，262710)上铺板。在37℃下于潮湿的培养箱中孵育3天(对于msmeg)和14-17天(对于mtb)后计数cfu。
谷氨酸棒杆菌海藻糖糖脂的纯化
将谷氨酸棒杆菌培养物(200ml)与0.1mmdmn-tre一起孵育或不处理直至静止期。用pbs洗涤细菌细胞沉淀两次，然后进行有机提取。通过依次用2:1、1:1、1:2的meoh:ch3cl混合物提取，然后浓缩有机提取物来分离细胞壁糖脂。通过用65:25：4的chcl3：meoh：h2o展开的制备型tlc(analtech，20x20cm，1mm的厚度)实现部分纯化。通过hptlc(uniplatehptlc-ghl，5x5cm，150μm的厚度)监测糖脂级分的纯度，用台风扫描仪(amershambiosciences，typhoon9410)进行成像以检测荧光标记的糖脂，并用5％h2so4的meoh溶液染色，焦化以用于标准糖脂可视化。
通过质谱法验证dmn-tre标记的糖脂
如上所述分离谷氨酸棒杆菌海藻糖糖脂。将糖脂样品溶解在200μl2:1chcl3:meoh(hplc级)中，并通过0.45μmpvdf膜过滤。质谱在位于universityofcalifornia,berkeley的qb3/化学质谱设施中的watersq-tofpremier四极飞行时间质谱仪上获得，该质谱仪配备有纳米电喷雾电离(nanoesi)源。从拉出的硼硅酸盐玻璃nanoesi尖端以正离子模式形成离子。记录在质荷比(m/z)＝100至4000的范围内的质谱。使用masslynx软件(4.1版，waters)控制数据采集。使用碰撞诱导解离(cid)片段化对三种前体离子进行串联质谱分析以显示来自dmn-tre标记的分枝杆菌酸酯的脂质尾部的损失。
axenicmtb培养时间过程实验
将结核分枝杆菌的实验室菌株h37rv无菌生长至约0.5的光密度(600nm)(即指数生长期)。在37℃下用1mmdmn-海藻糖对分配给30分钟、1小时、2小时、3小时和过夜的时间过程点的5个等体积的200μl进行染色。对于每个时间点以一式三份制备3个独立的生物学重复。结核分枝杆菌的未标记样品用作对照。孵育后，使用cytoflex(beckmancoulter)通过流式细胞术分析样品。将样品等分至96孔平底培养板的不同孔中。使用“dailyfluorophoreqc珠粒(beckmancoulter)”校准流式细胞仪。使用利用紫色激光(k0525a通道)检测的信号构建两个门。一个对应于未标记的结核分枝杆菌，而另一个对应于dmn-海藻糖阳性的所有细胞。流式细胞仪数据是针对50000个事件或2分钟的，无论哪个变量首先是真实的(根据下面概述的采集设置)。为了防止遗留，将含有水的孔分开，每个样品运行2分钟。将dmn-海藻糖染色以总事件的百分比绘图。
合成程序
使用从商业供应商获得的所有化学试剂而无需进一步纯化。在利用varianuv-vis检测器型号345(210,254nm)的varianprostar系统上在dynamaxmicrosorbc-18制备柱(21.4x250mm)上以20ml/min的流速进行反相hplc。在斯坦福大学化学核磁共振设施部的varianinova-600光谱仪上在环境温度下获得nmr光谱。
dmn-海藻糖(3)
将6-氨基海藻糖(1)(31mg，0.091mmol)和4-n,n-二甲基氨基萘酐(2)(22mg，0.091mmol，1当量)与2ml无水乙醇一起加入烧瓶中。向混合物中加入20mg碳酸氢钠。将黄色悬浮液在氮气氛下加热至85℃并搅拌6小时。然后通过旋转蒸发浓缩现在的红橙色溶液，将悬浮液溶解在10mlh2o中，通过棉塞过滤，并再浓缩。将剩余的橙色残余物通过反相hplc(5-80％mecn水溶液)纯化并冻干，得到为亮橙色固体的dmn-tre(3)(22.1mg，0.039mmol，43％)。
1hnmr(600mhz，d2o)δ8.21(d，j＝8.5hz，1h)，8.13(d，j＝7.3hz，1h)，7.95(d，j＝8.4hz，1h)，7.46(t，j＝7.9hz，1h)，6.90(d，j＝8.6hz，1h)，4.97(d，j＝3.8hz，1h)，4.53(d，j＝3.7hz，1h)，4.23(d，j＝6.2hz，2h)，4.03(dt，j＝12.3,6.4hz，1h)，3.79(t，j＝9.4hz，1h)，3.73-3.61(m，4h)，3.56(dd，j＝12.1,5.4hz，1h)，3.44(t，j＝9.5hz，1h)，3.18(t，j＝9.5hz，1h)，3.07(m，1h)，3.07(s，6h)。
13cnmr(151mhz，d2o中的5％cd3od)δ166.16,165.34,157.94,134.16,133.31,132.29,130.33,125.19,124.05,121.44,113.21,111.71,94.03,93.86,93.82,73.84，73.62,73.47,73.03,72.08,71.94,70.61,70.19,61.53,44.93,41.80。hrms(esi-tof，m/z)：c26h32n2o12的[m+na]+计算值为587.1847，实测值为587.1849。
dmn-葡萄糖(5)
将6-氨基-6-脱氧甲基葡糖苷(4)(38mg，0.20mmol)和4-n,n-二甲基氨基萘二甲酸酐(2)(48mg，0.20mmol，1当量)与4ml无水乙醇一起加入到烧瓶中。向悬浮液中加入40mg碳酸氢钠。然后将橙色悬浮液在氮气氛下加热至85℃并搅拌6小时。然后将澄清的红橙色溶液浓缩，溶于3mlh2o中，并通过棉塞过滤。然后通过反相hplc(5-80％mecn水溶液)纯化橙色溶液并冻干，得到为亮橙色固体的dmn-glc(5)(46.5mg，0.12mmol，56％)。
1hnmr(600mhz，d2o)δ8.37-8.24(m，1h)，8.21(t，j＝5.9hz，1h)，8.03(t，j＝6.2hz，1h)，7.53(d，j＝4.0hz，1h)，7.03-6.90(m，1h)，4.58(d，j＝3.5hz，1h)，4.32(t，j＝11.4hz，1h)，4.23(d，jj＝13.7hz，1h)，3.88(t，j＝10.0hz，1h)，3.63(t，j＝9.3hz，1h)，3.57(dd，j＝9.7,3.8hz，1h)，3.43(t，j＝9.4hz，1h)，3.10(d，j＝2.7hz，6h)，2.90(s，3h)。
13cnmr(151mhz，d2o中的5％cd3od)δ166.07,165.18,157.79,134.05,133.28,132.14,130.24,124.99,123.76,121.21,112.94,111.29,99.90,74.10,73.84,72.24,69.07,55.20,44.86,41.99。hrms(esi-tof，m/z)：c21h24n2o7[m+na]+计算值为439.1476，实测值为439.1472。
等同原则
已经出于说明和描述的目的呈现了本发明的描述。其并非旨在穷举或将本发明限制于所描述的精确形式，并且考虑到上述教导，许多修改和变化是可能的。选择并描述实施方案以最好地解释本发明的原理及其实际应用。该描述将使得本领域的其它技术人员能够在各种实施方案中以及最适合于特定需要的各种修改来最好地利用和实践本发明。本发明的范围由以下权利要求限定。
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