本发明涉及通过使用经遗传修饰的原核宿主细胞来产生岩藻糖基化寡糖的方法，以及涉及该方法中使用的宿主细胞及其用于产生高效价的岩藻糖基化寡糖的用途。
背景技术：
：：人乳是碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。迄今为止最占优势的级分是碳水合物，其可进一步分成乳糖和更复杂的寡糖(人乳寡糖，hmo)。然而乳糖被用作能源，复杂寡糖却不被婴儿代谢。复杂寡糖的级分占总碳水化合物级分的最高达20％，并且由200多种不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有的，因此无法在其他哺乳动物的乳中大量发现。迄今为止已鉴定了约200种结构各异的hmo，并且报道了许多有益特性。hmo不被母乳喂养的婴儿消化，但却是肠中双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属(lactobacillus)和拟杆菌属(bacteroides)的有益细菌的有价值的碳源和能源，使它们在肠道中占据优势并在竞争中战胜病原体，因此预防肠道上皮感染。然而，hmo还直接结合至致病性细菌、原生动物和病毒，通过模拟聚糖细胞表面受体来阻断病原体-宿主相互作用，从而保护母乳喂养儿童免于传染病。最重要的寡糖是2’-岩藻糖基乳糖。存在于人乳中的其他重要hmo是3-岩藻糖基乳糖、乳-n-四糖、乳-n-新四糖和乳-n-岩藻戊糖。除这些中性寡糖以外，还可在人乳中发现酸性hmo，例如3’-唾液酰乳糖、6’-唾液酰乳糖以及唾液酰乳-n-四糖a、b和c，或唾液酰乳-n-岩藻戊糖ii等。这些结构与上皮细胞表面糖缀合物的表位(lewis组织血型抗原)是近缘的，hmo与上皮表位的结构同源性说明了针对细菌病原体的保护特性。由于它们的有益特性，将hmo作为组分包含于婴儿配方物和其他食品中是有利的，这使得大量(最高达数吨级别)生产hmo成为必需的。由于受限的供应和难以获得各个人乳寡糖的纯级分，开发了获得这些复杂分子中的一些的化学途径。然而，被证实在商业上不可持续的化学和生物催化方法，且另外，尤其是人乳寡糖的化学合成途径包括若干有毒的化学品，这带来污染最终产物的风险。由于人乳寡糖的化学合成中涉及的挑战，开发了若干酶促方法和发酵方法。今天，对于若干hmo如2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-n-四糖、乳-n-新四糖、乳-n-岩藻戊糖i、乳-n-二岩藻己糖ii、3’-唾液酰乳糖和6’-唾液酰乳糖而言，已开发了发酵方法，这些方法主要使用经遗传工程化的细菌菌株如重组大肠杆菌(escherichiacoli)。然而，即使是目前可获得的基于细菌发酵的最有效方法，也无法或几乎无法实现在发酵液中大于20g/l的hmo效价。工业级方法必须通常超过50g/l的效价，尽管100g/l更为理想。因此，本发明的目的是提供改进的发酵方法，通过这种方法使得可以实现效价超过100g/l以上的岩藻糖基化寡糖(特别是2’-岩藻糖基乳糖)的生物合成。技术实现要素：该目的和其他目的是通过使用经遗传修饰的原核宿主细胞来产生岩藻糖基化寡糖的方法得以解决，所述方法包括以下步骤：-提供宿主细胞，其已经遗传修饰，使得至少(i)果糖-6-磷酸转化酶的活性——其在未经修饰的宿主细胞中具有正常水平——被降低或消除；(ii)在所述宿主细胞中过表达编码从头合成gdp-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因；(iii)在所述宿主细胞中表达(优选地过表达)编码岩藻糖基转移酶(优选α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶)的外源基因；-在包含碳源和能源的培养基中培养所述经遗传修饰的宿主细胞，所述碳源和能源选自以下的至少一种：葡萄糖、蔗糖、丙三醇、琥珀酸盐、柠檬酸盐、丙酮酸盐、苹果酸盐、乳酸盐或乙醇；和-向所述培养基提供乳糖。在随后的步骤中，可从其中培养所述宿主细胞的培养基中回收或获得如此产生的岩藻糖基化寡糖。使经遗传修饰的宿主细胞生长并培养的步骤和添加乳糖至培养基的步骤可这样进行，即使得首先将所述经遗传修饰的宿主细胞培养一段时间，在该第一培养时间之后的步骤中，通过添加乳糖至其中培养所述宿主细胞的培养基来提供乳糖；或者可从所述经遗传修饰的宿主细胞的培养时间开始时提供一定量的乳糖，并且可以一定量持续添加。或者可在内部产生乳糖。所述目的进一步通过经遗传修饰的原核宿主细胞以及通过将其用于产生岩藻糖基化寡糖而得以解决，所述宿主细胞已经遗传修饰，使得至少(i)果糖-6-磷酸转化酶的活性——其在未经修饰的宿主细胞中具有正常水平——被降低或消除，和/或通过提高宿主细胞中果糖-6-磷酸生成酶的活性；(ii)过表达编码从头合成gdp-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因；(iii)在宿主细胞中表达(优选地过表达)编码岩藻糖基转移酶(优选α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶)的外源基因。任选地，所述宿主细胞已经进一步遗传修饰(iv)以表达编码蛋白的基因，所述蛋白使得能够或促使所需岩藻糖基化寡糖转运到其中培养所述宿主细胞的培养基中；和/或(v)以表达编码双功能的l-岩藻糖激酶/l-岩藻糖1-磷酸鸟苷酰转移酶的外源基因；和/或(vi)以具有失活或缺失的编码l-岩藻糖-异构酶和l-墨角藻糖-激酶(l-fuculose-kinase)的基因；和/或(vii)以具有失活或断裂的编码荚膜异多糖酸(colanicacid)合成的酶的基因；和/或(viii)以表达乳糖通透酶；和/或(ix)以具有失活或缺失的内源β-半乳糖苷酶基因；和/或(x)以表达外源的可调控β-半乳糖苷酶基因；和/或(xi)以过表达代谢半乳糖的外源基因；和/或(xii)以表达编码显示果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性的酶的外源基因。此外，本文提供了使用经遗传修饰的原核宿主细胞来产生岩藻糖基化寡糖的方法，包括以下步骤：-提供原核宿主细胞，其已经遗传修饰，使得至少(i)通过使果糖-6-磷酸转化酶的活性——该酶活性在未经修饰的宿主细胞中具有正常水平——被降低或消除，或通过提高果糖-6-磷酸生成酶的活性，增加所述经遗传修饰的宿主细胞中的果糖-6-磷酸池(pool)；(ii)在所述宿主细胞中过表达编码从头合成gdp-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因；(iii)在所述宿主细胞中表达编码α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶的外源基因；-在包含碳源和能源的培养基中培养所述经遗传修饰的宿主细胞，所述碳源和能源选自以下的至少一种：葡萄糖、蔗糖、丙三醇、琥珀酸盐、柠檬酸盐、丙酮酸盐、苹果酸盐、乳酸盐或乙醇；和-向所述培养基提供乳糖。本发明的目的通过这种方式得以完全解决。使用本发明的方法，以及所述方法中使用的经遗传修饰的宿主细胞，可以以超过50g/l(甚至100g/l，甚至150g/l)的效价产生岩藻糖基化寡糖，因此提供用于大规模并且因此工业规模发酵产生岩藻糖基化寡糖的成功工具。在本发明中，如本领域中通常理解的，“岩藻糖基化寡糖”是存在于人乳中的岩藻糖基化寡糖，即携带岩藻糖残基的寡糖。优选地，岩藻糖基化寡糖是选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖或二岩藻糖基乳糖。此外，“经遗传修饰的原核宿主细胞”在本发明中意指已使用基因工程技术改变其遗传物质的原核细胞。例如，宿主细胞已经遗传修饰，使得天然存在于所述宿主细胞中的内源核酸序列被缺失、断裂或以其他方式受到影响，使它们的表达被改变，即消除、降低、抑制、增强或类似，和/或将外源核酸(即对所述宿主细胞而言是外来的核酸)引入到宿主细胞中以进行表达，例如在宿主细胞中处于可操控的启动子的控制下。在这种关系中，这类经遗传修饰的宿主细胞还被称为“重组宿主细胞”。例如，通过将异源核酸(例如对原核宿主细胞而言是外来的外源核酸)或原核宿主细胞中通常不存在的重组核酸引入到适当的原核宿主细胞中，所述原核宿主细胞是经遗传修饰的原核宿主细胞。因此，关于细菌宿主细胞，本文使用的术语“重组”表示所述细菌细胞复制异源核酸，或表达异源核酸(即“对所述细胞而言是外来的”序列)编码的肽或蛋白。重组细胞可包含在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因。重组细胞还可包含在天然形式的细胞中存在的基因，其中所述基因经修饰并通过人工方式被重新引入到细胞中。该术语还涵盖了包含对细胞而言为内源的核酸的细胞，所述内源核酸在不从细胞移出核酸的情况下被修饰；这类修饰包括通过基因置换、位点特异性突变以及相关技术获得的那些。因此，“重组多肽”是通过重组细胞产生的多肽。本文使用的“异源序列”或“异源核酸”是源自特定宿主细胞以外的来源(例如来自不同的物种)的核酸，或者，如果来自相同来源，则由其天然形式被修饰。因此，与启动子可操作地连接的异源核酸来自与启动子的来源不同的来源，或者，如果来自相同的来源，则由其天然形式被修饰。异源序列可被稳定地引入(例如通过转染、转化、缀合或转导)到宿主微生物细胞的基因组中，其中可应用的技术取决于宿主细胞和待引入的序列。各种技术是本领域技术人员已知的，并且例如公开于sambrooketal.，molecularcloning:alaboratorymanual,第二版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989)。因此，“经遗传修饰的原核宿主细胞”在本发明中理解为已被转化或被转染的原核细胞，或能够被外源多核苷酸序列转化或转染的原核细胞。本发明中使用的核酸序列可例如被包含于载体中，所述载体将被稳定转化/转染或以其他方式被引入到宿主微生物细胞中。多种表达系统可用于表达本发明的基因。这类载体包括染色体衍生载体、附加型载体和病毒衍生载体，例如衍生自细菌质粒、衍生自噬菌体、衍生自转座子、衍生自酵母附加体、衍生自插入元件、衍生自酵母染色体元件、衍生自病毒的载体，以及衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件(例如粘粒和噬菌粒)的那些。表达系统构建体可包含调控区，其调节以及引起表达。通常，任何在宿主中适于维持、增殖或表达多核苷酸和适于合成多肽的系统或载体在这方面可用于表达。通过多种公知和常规技术(例如前述sambrooketal中所述的那些)中的任何技术，可将适合的dna序列插入到表达系统中。本领域中涉及“重组dna”方法的专利和文献出版物有很多，这些方法用于分离、合成、纯化和扩增遗传物质以用于转化所选择的宿主生物体。因此，使用包含所选择的外源(即外来的或“异源的”)dna序列的“杂合”病毒或环形质粒dna来转化宿主生物体是公知常识。本领域技术人员将知晓多种方法以获得用于转化所选择的宿主生物体的“杂合”载体。术语“编码……的核酸序列”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的rna或dna或者经修饰的rna或dna，并且通常代表编码某一多肽或蛋白的基因。该术语包括但不限于单链和双链dna，为单链区和双链区混合物或单链区、双链区和三链区混合物的dna，单链和双链rna，为单链区和双链区混合物的rna，包含dna和rna的杂合分子(所述dna和rna可以是单链或更通常是双链或三链区，或单链区和双链区混合物)。该术语还涵盖了多核苷酸，其包含编码多肽的单个连续区或不连续区(例如，被整合的噬菌体或插入序列或编辑所中断)以及也可包含编码序列和/或非编码序列的其他区域。本文使用的术语“培养”意指在培养基中并且在允许和适于产生所需寡糖的条件下使细菌细胞生长和/或孵育细菌细胞。本领域技术人员在阅读本发明的公开内容之后，结合其技术和专业背景，易于获得几个适合的细菌宿主细胞以及培养它们的培养基和条件。应理解，通过本文公开的本发明可以产生如本文定义的一种或多种寡糖，只要使编码本文公开的相关蛋白/酶的各核酸被包含在细胞中。本文使用的术语“回收”意指从宿主微生物培养物中分离、收获、纯化、收集或以其他方式分离出根据本发明由宿主微生物产生的寡糖。根据本发明的方法和用途的一个实施方案，待产生的岩藻糖基化寡糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖或二岩藻糖基乳糖中的至少一种。根据本发明的方法的一个实施方案，原核宿主细胞选自细菌宿主细胞，优选地选自大肠杆菌菌株、乳杆菌属种或谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)菌株。优选地，宿主细胞是选自以下的细菌宿主细胞：大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)细胞。本领域技术人员在阅读本公开内容时将了解其他细菌菌株。在本发明中，以及如通常理解，表述“岩藻糖基转移酶”应理解为将l-岩藻糖从gdp-岩藻糖(鸟苷二磷酸-岩藻糖)供体底物转移到受体底物以形成岩藻糖基化寡糖的酶。在本发明中，受体底物是寡糖。此外，岩藻糖基转移酶不仅在存在聚糖受体的情况下催化岩藻糖基化，还可在无法获得受体底物时水解gdp-l-岩藻糖。因此，术语“α-1,2-岩藻糖基转移酶”或“岩藻糖基转移酶”或编码“α-1,2-岩藻糖基转移酶”或“岩藻糖基转移酶”的核酸/多核苷酸指催化岩藻糖部分从供体底物(例如gdp-岩藻糖)以α-1,2-键转移至受体分子的糖基转移酶。术语“α-1,3-岩藻糖基转移酶”或“岩藻糖基转移酶”或编码“α-1,3-岩藻糖基转移酶”或“岩藻糖基转移酶”的核酸/多核苷酸指催化岩藻糖部分从供体底物(例如gdp-岩藻糖)以α-1,3-键转移至受体分子的糖基转移酶。受体分子可以是，例如乳糖、2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酰乳糖、6’-唾液酰乳糖、乳-n-四糖、乳-n-新四糖或其衍生物。根据本发明，编码岩藻糖基转移酶的外源基因选自表达显示出α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的基因、表达显示出α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的基因、或表达α-1,2-岩藻糖基转移酶以及α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因。根据优选的实施方案，为了合成2-岩藻糖基乳糖，表达适合的α-1,2-岩藻糖基转移酶，为了合成3-岩藻糖基乳糖，表达适合的α-1,3-岩藻糖基转移酶，为了合成2’,3-二岩藻糖基乳糖，表达适合的α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶二者或至少一种编码显示出α-1,2-以及α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的基因。可根据本发明使用并且应当为本发明的一部分的岩藻糖基转移酶的非限制性实例为例如细菌岩藻糖基转移酶，优选α-1,2-岩藻糖基转移酶，更优选大肠杆菌o:126的wbgl基因编码的α-1,2-岩藻糖基转移酶，或幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)的fuct基因编码的α-1,2-岩藻糖基转移酶；或者α-1,3-岩藻糖基转移酶，更优选来自嗜粘蛋白阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、幽门螺旋杆菌或肝螺杆菌(h.hepaticus)的α-1,3-岩藻糖基转移酶。优选地，使用糖基转移酶或其变体，其公开于ep2479263a1或ep2439264或wo2010/142305中，所述专利文献的内容在此被明确引用或作为本发明的主题。本文使用的术语“变体”是这样的多核苷酸或多肽，即其分别不同于参照多核苷酸或多肽(特别是本文提及和使用的酶)，但是保留了参照多核苷酸或多肽的必需(酶)特性。典型的多核苷酸变体的核苷酸序列与另一参照多核苷酸不同。变体核苷酸序列的变化可改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可导致由参照序列编码的多肽中的氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短，如下文讨论的。典型的多肽变体的氨基酸序列与另一参照多肽不同。通常，差异是有限的，使得参照多肽和变体的序列在整体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参照多肽的氨基酸序列差异可以为任意组合的一个或多个置换、添加、缺失。被置换或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或可以是已知非天然存在的变体。非天然存在的多核苷酸和多肽变体可通过诱变技术、通过直接合成和通过本领域技术人员已知的其他重组方法来制备。在本发明的范围内，那些术语还包括核酸/多核苷酸和多肽多态变体、等位基因、突变体和物种间同源物，其氨基酸序列/核酸序列与本文提及的多肽具有大于约60％氨基酸序列同一性，65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域上，所述本文提及的多肽例如果糖-6-磷酸转化酶，特别是磷酸果糖激酶a、葡萄糖-6-磷酸异构酶、果糖-6-磷酸醛缩酶、转酮醇酶(例如tkta、tktb)、或转醛醇酶(例如tala、talb)、本文使用的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶；磷酸甘露糖变位酶(优选manb)，甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(mannose-1-phosphateguanosyltransferase)(优选manc)，gdp-甘露糖-4,6-脱水酶(优选gmd)，gdp-l-岩藻糖合酶(优选wcag)，本文使用的岩藻糖基转移酶，果糖-1,6-二磷酸磷酸酶(优选来自豌豆(pisumsativum)的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶(fbpase)的功能活性变体)，糖外排转运蛋白(例如yberc0001_9420或seta)，乳糖通透酶(例如本文使用的lacy)。因此，本文公开的任何基因/蛋白的“功能片段”意欲指仍然保留与衍生出各片段的基因或蛋白相同或略低活性的基因/蛋白的序列变体。如本文的定义，本文和本领域内通常的术语“内源的”意指编码目的酶的核酸源自细菌宿主细胞并且尚未被引入到所述宿主细胞，而“外源的”或“重组的”核酸已被引入到所述宿主细胞并且不源自所述宿主细胞。根据另一个实施方案，核酸/基因是同源的或异源的。在本发明中，以及如相关领域通常理解，表述“同源的”指这样的核酸序列/基因，即其编码特定的一种或多种产物并且来自插入所述核酸序列的同一物种。相应地，术语“异源的”指这样的核酸序列/基因，即其编码特定的一种或多种产物并且来自插入所述核酸序列/基因的物种以外的物种。根据另一个实施方案，本发明的宿主细胞还包括使内源或外源/重组核酸序列/基因能够受控的过表达的调控序列。如上文定义，术语“调控序列”在本文中可与表述“核酸/基因表达调控序列”同义使用，包括启动子序列、信号序列或一系列转录因子结合位点，其序列影响与所述调控序列可操作地连接的核酸序列或基因的转录和/或翻译。在本发明中，本文使用的术语“可操作地连接的”应当意指核酸/基因表达调控序列(例如启动子、信号序列或一系列转录因子结合位点)和第二核酸序列或基因之间的功能连接，其中表达调控序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。相应地，术语“启动子”指通常在dna聚合物中的基因之前并且提供向mrna的转录的起始位点的dna序列。“调节因子”dna序列也通常在给定dna聚合物中的基因的“上游”(即之前)，结合决定转录起始频率(或速率)的蛋白。这些位于功能性dna聚合物中的选择基因(或一系列基因)之前的序列共同被称为“启动子/调节因子”或“调控”dna序列，它们合作以确定基因的转录(和最终表达)是否发生。在dna聚合物中的基因“之后”并且提供向mrna的转录的终止信号的dna序列被称为转录“终止子”序列。如上文已进一步描述，根据本发明使用的核酸序列/基因可例如被包含于载体中，所述载体将被稳定转化/转染到细菌宿主细胞中。上文描述的重组生产的定义和具体描述应当适用于本段。在一些实施方案中，将核酸序列/基因置于可诱导的启动子的控制下，所述启动子是指导基因表达的启动子，其中表达水平可通过环境因子或发育因子(例如温度、ph、厌氧或有氧条件、光、转录因子和化学品)来改变。这类启动子在本文中被称为“诱导型”启动子，其允许控制本发明中使用的蛋白的表达时机。对于大肠杆菌和其他细菌宿主细胞，诱导型启动子是本领域技术人员已知的。在本发明通篇中，表述“基因”意欲代表沿dna区段的线性核苷酸序列(或核酸序列；参见上文)，其提供rna合成的编码指示，所述rna被翻译成蛋白时导致蛋白/肽的表达。所述蛋白/肽可——如在本发明中——具有某些酶功能。“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非以其他方式被限定，涵盖了天然核苷酸的已知类似物，其与核酸杂交的方式类似于天然存在的核苷酸。除非另外说明，具体的核酸序列包括其互补序列。术语“编码……的核酸序列”或“编码……的基因”通常指可以是未经修饰的rna或dna或者经修饰的rna或dna的任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，并且通常代表编码某一多肽或蛋白的基因。该术语包括而不限于单链和双链dna，为单链区和双链区混合物或单链区、双链区和三链区混合物的dna，单链和双链rna，和为单链区和双链区混合物的rna，包含dna和rna的杂合分子，所述dna和rna可以是单链或更通常是双链或三链区或单链区和双链区的混合物。该术语还涵盖了多核苷酸，其包含编码多肽的单个连续区或不连续区(例如，被整合的噬菌体或插入序列或编辑所中断)以及也可包含编码序列和/或非编码序列的其他区域。因此，在本发明中，术语“基因”和“核酸序列”可互换使用。此外，本文使用的术语“活性”当用于酶时，意欲包括任何这样的分子，特别是蛋白质：其表现出酶活性，并且作为催化剂发挥作用以引起特定的生物化学反应，同时在反应中保持不变。特别地，该术语意欲包括具有酶活性的蛋白，其能够将底物转化为产物。在酶促反应中，过程开始时的分子(称为底物)被转化为不同的分子(称为产物)。生物细胞中的几乎所有化学反应均需要酶，以便以足以维持生命的速率发生。因为酶对其底物具有选择性并且仅加速许多可能性中的少数反应，细胞中形成的酶的集合决定了哪些代谢途径发生在该细胞中。因此，根据本发明，当酶活性被“消除”或“降低”时，该酶不具有如果该酶或其表达未经修饰时其所具有的活性，即在这种情况下，与未经修饰的酶/酶表达相比所述活性被消除或降低。本发明的发明人能够提供方法和经遗传修饰的宿主细胞，通过该方法和宿主细胞可产生岩藻糖基化寡糖，其产物效价超过100g/l。根据本发明的方法或本发明的宿主细胞的一个实施方案，果糖-6-磷酸转化酶的活性——其在未经修饰的宿主细胞中(在适用的情况下)处于正常水平——被降低或消除。当使用大肠杆菌作为宿主细胞时在本发明的方法和宿主细胞中，优选地果糖-6-磷酸转化酶选自磷酸果糖激酶，优选磷酸果糖激酶a(pfka)，葡萄糖-6-磷酸异构酶，果糖-6-磷酸醛缩酶，转酮醇酶(优选tkta、tktb)，或转醛醇酶(优选tala、talb)，所述果糖-6-磷酸转化酶——其在未经修饰的大肠杆菌宿主细胞中以另外的方式存在并具有活性——已被修饰使得其活性被降低或消除。pfka有效地磷酸化果糖-6-磷酸为果糖-1,6-二磷酸。果糖-6-磷酸是糖酵解和糖异生途径，以及gdp-l-岩藻糖的合成(其开始于mana催化的果糖-6-磷酸异构化为甘露糖-6-磷酸)中的分支点。当以葡萄糖异生底物如丙三醇培养大肠杆菌时，pfka对果糖-6-磷酸的磷酸化是高度消耗atp的平板反应(treadmillreaction)，此外，它与mana竞争底物。根据本发明的方法和宿主细胞的一个实施方案，果糖-6-磷酸生成酶是果糖-1,6-二磷酸磷酸酶，其活性可被提高以增加果糖-6-磷酸池。根据本发明的另一个实施方案，编码从头合成gdp-岩藻糖必需的酶的至少一种基因在宿主细胞中过表达。如上文提及，gdp-岩藻糖作为岩藻糖基转移酶反应的l-岩藻糖供体发挥作用，该反应将l-岩藻糖转移到受体底物以形成岩藻糖基化寡糖。使用经遗传修饰以从内部产生gdp-岩藻糖的原核宿主细胞，则不需要外部添加l-岩藻糖(其可经由补救途径被转化为gdp-岩藻糖)，因为宿主细胞有效地产生所需寡糖的岩藻糖基化过程所必需的gdp-岩藻糖。所述编码从头合成gdp-岩藻糖必需的酶并且在宿主细胞中过表达的至少一种基因可以是内源基因或外源基因，其可被整合到宿主细胞的基因组中。在本发明的一个实施方案中，编码从头合成gdp-岩藻糖必需的酶的外源基因为编码磷酸甘露糖变位酶的基因，优选manb；编码甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶的基因，优选manc；编码gdp-甘露糖-4,6-脱水酶的基因，优选gmd；和编码gdp-l-岩藻糖合酶的基因，优选wcag。根据本发明的一个实施方案，以及如上文进一步提及，编码岩藻糖基转移酶的至少一种外源基因选自表达显示出α-1,2-岩藻糖基转移酶活性和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的基因。在这种情况下，特别优选地α-1,2-岩藻糖基转移酶选自大肠杆菌:o126的wbgl或幽门螺旋杆菌的fuct2基因编码的α-1,2-岩藻糖基转移酶，特别优选地编码α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因选自物种嗜粘蛋白阿克曼氏菌和脆弱拟杆菌、幽门螺旋杆菌或肝螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶。根据本发明的另一个实施方案，特别优选地宿主细胞进一步被遗传修饰：(i)以表达编码使得能够或促使将所需岩藻糖基化寡糖输出到培养基中的蛋白的基因，优选外源基因；和/或(ii)以表达编码双功能的l-岩藻糖激酶/l-岩藻糖1-磷酸鸟苷酰转移酶的外源基因；和/或(iii)以显示出突变或缺失的基因fucl和fuck，导致活性降低或消除的l-岩藻糖异构酶(fucl)和l-墨角藻糖-激酶(l-fuculose-kinase)(fuck)；和/或(iv)以具有失活或断裂的编码荚膜异多糖酸合成的酶的基因；和/或(v)以表达(优选地过表达)用于输入乳糖的内源和/或外源通透酶；和/或(vi)以具有失活或缺失的内源β-半乳糖苷酶基因；和/或(vii)以表达编码β-半乳糖苷酶的基因，优选外源的可调节β-半乳糖苷酶；和/或(viii)以过表达编码果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的内源和/或外源基因。使用如上文所述的其他遗传修饰，甚至可进一步改进用于产生岩藻糖基化寡糖的方法。通过使编码l-岩藻糖异构酶(例如fucl)和l-墨角藻糖-激酶(l-fuculose-kinase)(例如fuck)的基因缺失或失活，可避免细胞内岩藻糖的分解代谢。通过使编码荚膜异多糖酸生物合成的酶的基因断裂、缺失或失活(例如在大肠杆菌宿主细胞中，催化荚膜异多糖酸生物合成第一步的wcaj基因)，阻止胞内产生荚膜异多糖酸，否则其可能与岩藻糖基转移酶反应竞争底物gdp-l-岩藻糖。根据优选实施方案，使得能够或促使将所需岩藻糖基化寡糖输出到培养基中的蛋白是糖外排转运蛋白，其优选地选自yberc0001_9420和大肠杆菌seta。根据优选实施方案，编码双功能的l-岩藻糖激酶/l-岩藻糖1-磷酸鸟苷酰转移酶是来自脆弱拟杆菌的fkp。根据优选实施方案，果糖-1,6-二磷酸磷酸酶是由以下基因编码：来自豌豆的果糖-1,6-二磷酸磷酸酶(fbpase)的功能活性变体。根据优选实施方案，乳糖通透酶是大肠杆菌lacy。通过编码催化gdp-l-岩藻糖合成的双功能的l-岩藻糖激酶/l-岩藻糖1-磷酸鸟苷酰转移酶的基因(例如脆弱拟杆菌fkp基因)的表达，阻止形成游离的l-岩藻糖(其可在gdp-l-岩藻糖的水解之后作为副产物累积)，从而拯救了(rescue)游离的l-岩藻糖，用于合成所需岩藻糖基化寡糖。根据优选实施方案，代谢半乳糖的外源基因是包含来自大肠杆菌的galetkm操纵子和/或galp的基因。根据本发明的实施方案，宿主细胞中被修饰的基因或用于修饰宿主细胞的基因是内源基因或外源基因。在本发明通篇中，以及适用于外源引入到宿主细胞中的每种基因/核酸，根据本发明的方法和宿主细胞的一个实施方案，优选地至少一种外源基因(优选地整合到宿主细胞基因组中)被过表达，优选地在内源或外源诱导时或以组成型方式。因此，优选的至少一种以下基因被过表达：(i)编码从头合成gdp-岩藻糖必需的酶的外源基因；(ii)编码岩藻糖基转移酶的外源基因；(iii)编码糖外排转运蛋白的基因；(iv)编码双功能的l-岩藻糖激酶/l-岩藻糖1-磷酸鸟苷酰转移酶的外源基因；(v)乳糖通透酶；(vi)编码β-半乳糖苷酶的外源可调节基因；和/或(vii)代谢半乳糖的外源基因；(viii)编码果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的外源基因；例如在培养期间的某一时间点或某一时期或在整个培养时间，可通过起始基因转录的可调控启动子影响所述过表达。此外，根据优选实施方案，本发明的方法中使用的宿主细胞中引入的外源基因被整合到宿主细胞的基因组中。此外，根据本发明的一方面，除非另外定义，本发明的所述宿主细胞中被修饰的基因/用于修饰所述宿主细胞的基因还可以是内源基因，并且它们的表达可被增加或提高或过表达，或以其他方式被消除或降低。通过内源β-半乳糖苷酶基因的失活或缺失，阻止了外部添加的乳糖的降解；然而，由于需要降解未被代谢并且以其他方式阻碍所需岩藻糖基化寡糖的纯化的乳糖，优选在宿主细胞中表达编码β-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶的突变型的外源可调控基因，例如，可表达lacz基因的laczω片段，其表达例如可通过阻遏因子(例如通过温度灵敏型转录阻遏因子，例如cl857)来调控。在这种情况下，可通过将温度升至42℃来开始β-半乳糖苷酶ω片段的合成。本发明中和本领域中通常理解的阻遏因子是dna或rna结合蛋白，其通过结合至操纵子或相关沉默因子来抑制一种或多种基因的表达。dna结合阻遏因子阻断dna聚合酶结合至启动子，从而阻止基因转录为信使rna。作为外源β-半乳糖苷酶α片段的启动子，例如可使用大肠杆菌bl21(de3)pgba启动子。β-半乳糖苷酶α和ω片段被结合起来以在细胞中产生有活性的β-半乳糖苷酶。在优选实施方案中，通过从培养开始时添加乳糖来提供乳糖，添加乳糖的浓度为至少5mm，更优选浓度大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mm，或甚至浓度为300mm或高于300，或400mm。根据另一个实施方案，通过以这样的浓度向培养基中添加乳糖来提供乳糖，即所述浓度使得在整个培养产生期获得至少5mm，更优选至少10、20或30mm的乳糖浓度。或者，通过在宿主细胞在胞内产生乳糖，如专利ep1927316a1所述，该专利的内容被本文明确引用并且以引用的方式纳入本文。在本发明的方法中，优选地培养宿主细胞至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养宿主细胞。因此，根据本发明的一方面，即在连续方法中，在宿主细胞的培养步骤过程中将碳源持续添加到培养基中。通过在培养步骤过程中连续添加碳源，实现寡糖的持续和有效产生。根据另一方面，本发明的方法是或包括分批发酵方法，具有恒定体积分批发酵培养物(其中加入底物而不稀释培养物)，或可变体积分批发酵培养物(其中由于加入底物发酵体积随发酵时间而变化)。如上文提及，本发明还涉及经遗传修饰的原核宿主细胞，所述宿主细胞已经遗传修饰，使得(i)果糖-6-磷酸转化酶的活性——其在未经修饰的宿主细胞中处于正常水平——被降低或消除；(ii)编码从头合成gdp-岩藻糖必需的酶的至少一种基因被过表达；(iii)在细胞中表达编码岩藻糖基转移酶的外源基因(优选编码α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因)。如上文中的方法所提及的，宿主细胞优选地选自大肠杆菌菌株、乳杆菌属菌株或棒状杆菌属(corynebacterium)菌株。根据本发明的宿主细胞的一个实施方案，果糖-6-磷酸的胞内池通过以下方法来提高：(i)降低或消除果糖-6-磷酸转化酶的活性，所述果糖-6-磷酸转化酶选自磷酸果糖激酶、果糖-6-磷酸异构酶、果糖-6-磷酸醛缩酶、转酮醇酶(例如tkta、tktb)或转醛醇酶(例如tala、talb)；或(ii)提高果糖-1,6-二磷酸磷酸酶活性。在一个优选实施方案中，编码从头合成gdp-岩藻糖必需的酶的基因被过表达。在另一个优选实施方案中，编码至少一种岩藻糖基转移酶的外源基因是编码α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因，并且选自来自大肠杆菌o126的wbgl或来自幽门螺旋杆菌的fuct2(称为α-1,2-岩藻糖基转移酶)，以及物种嗜粘蛋白阿克曼氏菌、脆弱拟杆菌、幽门螺旋杆菌或肝螺杆菌的基因(称为α-1,3-岩藻糖基转移酶)。根据一个实施方案，如上文所述的宿主细胞任选地被进一步遗传修饰(iv)以表达编码糖外排转运蛋白的外源基因；和/或(v)以表达编码双功能的l-岩藻糖激酶/l-岩藻糖1-磷酸鸟苷酰转移酶的外源基因；和/或(vi)以具有失活或缺失的编码l-岩藻糖-异构酶和l-岩藻糖-激酶的基因；和/或(vii)以具有失活或断裂的编码udp-葡萄糖:十一烷异戊二烯基磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶的基因；和/或(viii)以表达外源乳糖通透酶；和/或(ix)以具有失活或缺失的内源β-半乳糖苷酶基因；和/或(x)以表达编码β-半乳糖苷酶的外源可调控基因；和/或(xi)以表达代谢半乳糖的外源基因；和/或(xii)以表达编码果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的外源基因。本发明还涉及本发明的经遗传修饰的原核宿主细胞用于产生岩藻糖基化寡糖的用途。其他优势遵循实施方案和附图的描述。毫无疑问，上文提及的特征和下文仍要揭示的特征不仅可以分别指定的组合来使用，还可以其他组合使用或各自单独使用，而不偏离本发明的范围。附图说明本发明的若干实施方案以附图来举例说明并且在以下说明书中更具体解释。在附图中：图1用于本发明方法的经遗传修饰的宿主细胞的示意性示例图。图2通过hplc对产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌菌株的丙三醇生长培养物的上清液的hplc分析；和图3seq-idnos.1至7具体实施方式图1表示用于本发明方法的本发明的示例说明性宿主细胞，并绘出了示例性岩藻糖基寡糖2’-岩藻糖基乳糖的示例性发酵途径。在图1中，示出了就产生2’-岩藻糖基乳糖而言，已根据本发明进行遗传修饰的示例性细菌宿主细胞。从图1中可见，将丙三醇用作示例性碳源，而从外部添加乳糖。乳糖是经由通透酶(例如lacy)转运到宿主细胞中。丙三醇是经由通过gipf进行的易化扩散(facilitateddiffusion)被吸收到宿主细胞中。在原核宿主细胞中，丙三醇被转化为甘油醛-3-磷酸(其被转化为果糖-6-磷酸)，(i)编码fbpase的外源基因的过表达有利于该反应，以及(ii)逆反应受到磷酸果糖激酶a(pfka)的失活的抑制。通过从头合成gdp-岩藻糖必需的外源酶(即磷酸甘露糖变位酶manb、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶manc、gdp-甘露糖-4,6-脱水酶gmd和gdp-l-岩藻糖合酶wcag)的过表达，产生gdp-l-岩藻糖。在接下来的步骤中，通过α-1,2-岩藻糖基转移酶(例如wbgl)的作用，gdp-l-岩藻糖与内部的乳糖发生反应以产生2-岩藻糖基乳糖，其经由外排转运蛋白(例如tpyb)被输出到其中培养宿主细胞的培养基中。在图2中，示出了通过hplc对来自产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌菌株的丙三醇生长培养物的上清液进行hplc分析的结果。图2中所示为来自携带编码异源转运蛋白yberc0001_9420的基因的产2’-岩藻糖基乳糖的菌株的发酵液的hplc图谱(profile)(黑色)和编码异源转运蛋白yberc0001_9420的基因缺失后的相同菌株的发酵液的hplc图谱(灰色)。使用丙三醇作为碳源和能源，两种菌株的发酵在28℃下进行111h。实施例1用于产生2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌bl21(de3)菌株的改造使用大肠杆菌bl21(de3)作为亲本宿主，构建了用于在全细胞生物合成法中产生2’-岩藻糖基乳糖的菌株。所述菌株的基因组改造包括基因断裂和缺失事件以及异源基因的整合。由于2’-岩藻糖基乳糖是从乳糖合成(适用于细菌培养物)，以及从产生自活细胞的gdp-l-岩藻糖合成，首先通过使用错配寡核苷酸的诱变使编码内源β-半乳糖苷酶的lacz基因的野生型拷贝失活(参见ellisetal.,“highefficiencymutagenesis,repair,andengineeringofchromosomaldnausingsingle-strandedoligonucleotides”,proc.natl.acad.sci.usa98:6742-6746(2001))。使用相同的方法，使阿拉伯糖异构酶基因araa断裂。将laczω基因片段引入到温度灵敏性转录阻遏因子cl857的控制下。laczα片段基因是在所述菌株(表示为lacz+菌株)中在大肠杆菌bl21(de3)pgba启动子的控制下表达。根据datsenko和warner的方法(参见“one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpgrproducts”,proc.natl.acad.sci.usa97:6640-6645(2000))通过λred介导的重组来进行基因组缺失。分别使编码l-岩藻糖异构酶和l-墨角藻糖-激酶(l-fuculose-kinase)的基因fucl和fuck缺失以阻止l-岩藻糖的降解。还使基因wzxc-wcaj缺失。wcaj可能编码udp-葡萄糖:十一烷异戊二烯基磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶，该酶催化荚膜异多糖酸合成中的第一步(参见stevensonetal.,“organizationoftheescherichiacolik-12geneclusterresponsibleforproductionoftheextracellularpolysaccharidecolonicacid”,j.bacteriol.178:4885-4893；(1996))；荚膜异多糖酸的产生与岩藻糖基转移酶反应竞争gdp-岩藻糖。通过转位(transposition)来进行异源基因的基因组整合。通过水手转座酶himar1的活性过高的c9突变体的介导，将大基因簇整合到基因组中(参见lampeetal.,“hyperactivetransposasemutantsofthehimarlmarinertransposon”,proc.natl.acad.sci.usa96:11428-11433(1999))，所述突变体被插入到质粒pecomar中，处于para启动子的转录控制下。为了增强gdp-岩藻糖的从头合成，来自大肠杆菌k12dh5α的编码磷酸甘露糖变位酶(manb)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(manc)、gdp-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)和gdp-l-岩藻糖合酶(wcag)的基因在大肠杆菌bl21(de3)菌株中过表达；将操纵子mancb设置在组成型启动子ptet的控制下，操纵子gmd,wcag转录自组成型pt5启动子。将转座子盒<ptet-mancb-pt5-gmd,wcag-frt-dhfr-frt>(seqidno.1)从pecomarc9-mancb-gmd,wcag-dhfr插入到大肠杆菌基因组中，所述转座子盒包含甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)抗性的二氢叶酸还原酶基因，其侧翼为被类mariner元件himar1转座酶特异性识别的反向末端重复。对于单个基因的染色体整合，使用ez-tn5tm转座酶(epicentre,usa)。为了产生ez-tn5转座体，使用引物来扩增目的基因以及侧翼为frt位点的抗生素抗性盒，所述引物在两个位置上携带ez-tn5转座酶的19-bp嵌合端识别位点(5'-ctgtctcttatacacatct(seqidno.8))。通过使用ez-tn5tm转座酶，使用各自的整合盒：<ptet-lacy-frt-aada-frt>(seqidno.2)、<ptet-wbglco-frt-neo-frt>(seqidno.3)和<ptet-yberc0001_9420co-frt-cat-frt>(seqidno.4)，来整合来自大肠杆菌k12tg1的乳糖输入蛋白lacy的基因(登录号abn72583)、来自大肠杆菌:o126的2-岩藻糖基转移酶基因wbgl(登录号adn43847)和来自伯氏耶尔森氏菌(yersiniabercovieri)atcc43970的编码主要易化因子超家族的糖外排转运蛋白的基因yberc0001_9420(登录号eeq08298)，产生菌株。由genscriptcooperation(usa)通过合成方法来合成基因wbgl和yberc0001_9420，并进行密码子优化(co)。成功整合lacy基因之后，通过质粒pcp20上编码的flp重组酶，从链霉素抗性克隆中除去抗性基因(datsenkoandwarner,"one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpgrproducts",proc.natl.acad.sci.usa97:6640-6645(2000))。由于大肠杆菌bl21(de3)缺少功能性gal操纵子，使用整合盒<pgal-gale-galt-galk-galm>(seqidno.5)通过ez转位将来自大肠杆菌k的galetkm操纵子的天然调节拷贝整合到b菌株中。从包含1％半乳糖的macconkey琼脂选择整合菌株(integrand)，其为红色克隆。所得菌株能够代谢源自乳糖水解的单糖——葡萄糖和半乳糖。实施例2确认伯氏耶尔森氏菌atcc43970糖外排转运蛋白的增加的2’-岩藻糖基乳糖输出yberc0001_9420的敲除为了证明来自伯氏耶尔森氏菌atcc43970的异源糖转运蛋白的功能性，使用来自质粒pbbr-mcs5的庆大霉素抗性盒aacc1(kovach,elzeretal.1995,"fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpbbrimcs,carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes",gene166,175-176)——其被插入到基因yberc0001_9420中，从菌株大肠杆菌bl21(de3)lacz-、araa-、fucl-、fuck-、wcaj-(其通过datsenkoandwanner(2000；参见上文)的同源重组而包含manb、manc、gmd、wcag、lacy、wbgl和yberc0001_9420染色体整合)中缺失基因yberc0001_9420，产生菌株δyberc0001_9420。2’-岩藻糖基乳糖产生的培养条件将携带异源输出蛋白yberc0001_9420的大肠杆菌bl21(de3)菌株和δyberc0001_9420菌株在28℃下培养于3l发酵罐中(newbrunswick,edison,usa)，开始于800ml矿物盐培养基，其包含7g/lnh4h2po4、7g/lk2hpo4、2g/lkoh、0.3g/l柠檬酸、2g/lmgso4×7h2o和0.015g/lcacl2×6h2o，补充1ml/l微量元素溶液(54.4g/l柠檬酸铁铵、9.8g/lmncl2×4h2o、1.6g/lcocl2×6h2o、1g/lcucl2×2h2o、1.9g/lh3bo3、9g/lznso4×7h2o、1.1g/lna2moo4×2h2o、1.5g/lna2seo3、1.5g/lniso4×6h2o)，包含1.5％丙三醇作为碳源以及抗生素甲氧苄氨嘧啶10μg/ml和卡那霉素15μg/ml。使用来自在相同的含丙三醇的培养基中生成的预培养物的2.5％(v/v)接种物，开始培养。在7小时内添加在岩藻糖基转移酶反应中作为受体的乳糖以在培养物中获得30mm的浓度，开始时od660nm约为10。然后手动调节乳糖以保持过量的受体分子；连续添加丙三醇。通过hplc分析培养物上清液并检测2’-岩藻糖基乳糖使用连接至hplc系统(shimadzu,germany)的折射率检测仪(rid-10a)(shimadzu,germany)和reprosilcarbohydrate,5μm(250mm×4,6mm)(dr.maischgmbh,germany)，进行高效液相色谱(hplc)分析。使用乙腈:h2o(68/32(v/v))作为洗脱液，在35℃和流速1.4ml/min下进行等梯度洗脱。将20μl样品加到柱上。从标准曲线计算2’-岩藻糖基乳糖浓度。因此，将10％(v/v)100mm蔗糖添加到hplc样品中作为内参，然后对样品进行过滤(0.22μm孔径)并通过离子交换基质(strataabw,phenomenex)上的固相萃取来使其澄清。检测大肠杆菌bl21(de3)培养物的上清液中的2’-岩藻糖基乳糖在28℃下，在以丙三醇作为碳源的矿物盐培养基中发酵111h之后，通过hplc检测菌株的培养物上清液中的73mm(35,6g/l)和25mm(12,2g/l)2’-岩藻糖基乳糖，所述菌株为包含和缺少yberc0001_9420转运蛋白基因的菌株，参见图2：图2中所示为来自携带编码异源转运蛋白yberc0001_9420的基因的产2’-岩藻糖基乳糖的菌株的发酵液的hplc图谱(黑色)和编码异源转运蛋白yberc0001_9420的基因缺失后的相同菌株的发酵液的hplc图谱(灰色)。菌株中异源的糖输出蛋白yberc0001_9420的缺失降低了上清液中检测到的2’-岩藻糖基乳糖的量。这证明了转运蛋白确实通过更快将三糖转运到细胞外来提高2’-岩藻糖基乳糖的产生，因为两种菌株中yberc0001_9420基因以外的遗传背景是相同的。此外，在缺少2’-岩藻糖基乳糖输出蛋白的细胞中获得了更低的细胞密度，可能是由于细胞内糖大量累积引起的渗透应力。如图2中所示，在δyberc0001_9420培养物中检测到的2’,3-二岩藻糖基乳糖的量约为原始菌株的培养液中量的二倍。2’,3-二岩藻糖基乳糖的产生增加(其中l-岩藻糖是通过岩藻糖基转化酶催化的反应而被转移至2’-岩藻糖基乳糖)也表明，与yberc0001_9420过表达菌株相比，yberc0001_9420敲除菌株中受体分子2’-岩藻糖基乳糖的细胞内浓度更高。在图2中，更浅的线(即灰色线)显示δyberc0001_9420大肠杆菌bl21(de3)菌株δyberc0001_9420的上清液，黑线显示包含包含yberc0001_9420的大肠杆菌bl21(de3)的培养物的上清液。28℃下，在以丙三醇作为碳源的矿物盐培养基中发酵111h之后取样。实施例3发酵过程中2’-岩藻糖基乳糖的产生在30℃和ph7.0下，在3l发酵罐中进行发酵；通过用25％氨进行的滴定来调节ph。使用丙三醇作为碳源和能源，在实施例2中所述的矿物盐培养基中培养实施例2中所述菌株。初始体积为1l的发酵罐被接种在相同培养基中培养的预培养物。在消耗掉该批次内包含的2％丙三醇之后，连续加入丙三醇(60％v/v)。当od600nm达到6时，分三部分(每部分10ml)(间隔1小时)添加浓度为0.66m的乳糖。之后，以连续流给予乳糖以保持发酵罐中的乳糖浓度为至少10mm。培养86h之后，达到91.3mm(44.6g/l)2’-岩藻糖基乳糖的最终效价。通过将温度改变为42℃，表达β-半乳糖苷酶基因，乳糖及其降解产物(葡萄糖和半乳糖)被2’-岩藻糖基乳糖生成菌株代谢。实施例4培养物上清液的hplc分析使用连接至hplc系统(shimadzu,germany)的折射率检测仪(rid-10a)(shimadzu,germany)和watersxbridge酰胺柱3.5μm(250x4.6mm)(eschborn,germany)，进行hplc分析。在35℃和1.4ml/min流速下，使用ddh2o中的30％a:50％(v/v)acn、0.1％(v/v)nh4oh以及ddh2o中的70％b:80％(v/v)acn、0.1％(v/v)nh4oh(v/v)作为洗脱液，进行等梯度洗脱。将10μl样品加到柱上，并从标准曲线计算2’-岩藻糖基乳糖浓度。因此，将10％(v/v)100mm蔗糖溶液添加到hplc样品中，作为内参，然后进行过滤(0.22μm孔径)并通过离子交换基质(strataabw,phenomenex)上的固相萃取来使其澄清。还使用相同的分析条件来检测副产物如l-岩藻糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖和岩藻糖基半乳糖。实施例5通过代谢工程改进2’-岩藻糖基乳糖产生菌株通过缺失编码磷酸果糖激酶a的pfka基因，对以大肠杆菌菌株进行的2’-岩藻糖基乳糖合成进行进一步改进。当在葡萄糖异生底物如丙三醇上培养大肠杆菌时，pfka对果糖-6-磷酸的磷酸化是高度消耗atp的平板反应，此外，它与mana竞争底物。使用侧翼为lox71/66位点的庆大霉素抗性盒(aacc1)(参见lambert,bongersetal.2007"cre-lox-basedsystemformultiplegenedeletionsandselectable-markerremovalinlactobacillusplantarum",appl.environ.microbial.73,1126-113)，通过datsenko和wanner(2000，参见上文)的同源重组使pfka基因缺失。成功缺失pfka基因之后，使用cre重组酶(参见abremski,hoessetal.1983,"studiesonthepropertiesofp1site-specificrecombination:evidencefortopologicallyunlinkedproductsfollowingrecombination",cell32,1301-1311)从大肠杆菌基因组中除去抗生素抗性基因，所述cre重组酶被克隆到pkd46(参见datsenkoandwanner,2000)框架(chassis)中para启动子的控制下。对于不同的岩藻糖基转移酶，除转移酶活性以外，证明了gdp-l-岩藻糖水解酶活性。同样对于wbgl——此处用于2’-岩藻糖基乳糖合成的α-1,2-岩藻糖基转移酶，示出了这种水解活性(参见ep3050973a1)。为了拯救游离的l-岩藻糖用于2’-岩藻糖基乳糖产生并从培养液中清除污染的l-岩藻糖，使用ez-tn5tm转座酶、<ptet-fkp-lox-aacc1-lox>(seqid6)，通过转位将ptet启动子的转录控制下的脆弱拟杆菌的编码双功能的l-岩藻糖激酶/l-岩藻糖1-磷酸鸟苷酰转移酶的fkp基因以及侧翼为lox71/66的aacc1基因以染色体方法整合到实施例1中所述的菌株中。成功整合之后，从基因组中除去庆大霉素抗性基因，如上文所述。实施例6用于产生2’-岩藻糖基乳糖的优化发酵过程使用包含3g/lkh2po4、12g/lk2hpo4、5g/l(nh4)2so4、0.3g/l柠檬酸、2g/lmgso4×7h20,0.1g/lnacl和0.015g/lcacl2×6h2o的优化矿物盐培养基，以及1ml/l微量元素溶液(54.4g/l柠檬酸铁铵、9.8g/lmncl2×4h2o、1.6g/lcocl2×6h2o、1g/lcucl2×2h2o、1.9g/lh3bo3、9g/lznso4×7h2o、1.1g/lna2moo4×2h2o、1.5g/lna2seo3、1.5g/lniso4×6h2o)和作为碳源的2％丙三醇，在33℃下于3l发酵罐中培养实施例5中所述的大肠杆菌菌株。通过滴定25％氨，将ph保持在7。使用在相同培养基中生长的预培养物来接种发酵罐，至od600nm为0.1。当培养物的od600nm为5时添加乳糖以获得浓度30mm。在整个发酵过程中保持乳糖浓度为20-30mm，根据hplc分析进行调节。在该批次中的丙三醇以4.5ml/l/h的流速消耗20小时之后开始丙三醇加料(60％v/v)，之后以5.7ml/l/h加料33小时，以7.1ml/l/h加料18小时(加料速率参考初始体积)。总体上，93小时之后，获得的2’-岩藻糖基乳糖的效价为106.5g/l(217mm)。实施例7通过代谢挑战(challenging)改造增强的2’-岩藻糖基乳糖生产菌株为了增加被代谢的碳源丙三醇通过葡萄糖异生途径从三糖磷酸到果糖-6-磷酸的流量，以向gdp-l-岩藻糖生物合成加料，在实施例5中所述的菌株中过表达编码果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fbab)和来自豌豆的异源果糖-1,6-二磷酸磷酸酶(fbpase)的基因。来自大肠杆菌bl21(de3)的fbab基因与ptet启动子融合。叶绿体豌豆fbpase的活性受到由于硫氧还蛋白的还原而导致的二硫-二巯基交换的变构调节。半胱氨酸残基153替换为丝氨酸产生组成型活性酶。从genescript购买编码豌豆叶绿体fbpase的基因(登录号aad10213)，进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，n端用六组氨酸标签标记并修饰以编码所述酶的c153s变体。从t7启动子转录fbpase基因。将所述盒<ptet-fbab-pt7-his6-fbpase-lox-aacc1-lox>(seqid7)用于宿主菌株中ez-tn5tm转座酶介导的整合。在从大肠杆菌基因组中除去庆大霉素抗性基因之后，将该菌株用于2’-岩藻糖基乳糖产生。实施例8通过发酵过程产生150g/l2’-岩藻糖基乳糖将实施例7中所述的经遗传修饰的2’-岩藻糖基乳糖生产菌株在如实施例5中所述在33℃下于相同培养基中培养。此外，对于2％丙三醇批次，最初将60mm乳糖添加到发酵培养基中。在od600nm约为10时，开始使用0.66m乳糖进行连续乳糖加料。此外，使用1m储液进行乳糖补充。乳糖浓度保持在约30mm。分批期结束(由溶氧水平升高指示)之后，开始以6.9ml/l/h的流速进行丙三醇加料(60％v/v)37小时(参考初始体积)。之后加料降低至9.4ml/l/h，持续19小时，然后再次升至7.3ml/l/h，持续19小时。在给发酵罐加料93小时之后，2’-岩藻糖基乳糖的效价达到150.2g/l。实施例9从丙三醇产生3-岩藻糖基乳糖使用大肠杆菌bl21(de3)laczδwcajδfuclk(染色体整合了编码用于从头合成gdp-岩藻糖的酶(manb、manc、gmd、wcag))的基因，构建3-岩藻糖基乳糖生产菌株。编码脆弱拟杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因(ep2439264a1)以及编码大肠杆菌糖外排转运蛋白seta的基因(us2014/0120611a1)和赋予庆大霉素抗性的基因被整合到大肠杆菌基因组中。在实施例6中所述的条件下进行菌株发酵以产生3-岩藻糖基乳糖。分批期结束之后开始丙三醇加料，加料速率为7.4ml/l/h(参考初始体积)。当od600nm达到30时，向培养物中添加乳糖至浓度33mm。在整个过程中，添加乳糖以保持上清液中浓度为至少10mm。88小时之后终止过程，上清液中3-岩藻糖基乳糖的浓度为30g/l。序列表<110>jenneweinbiotechnologiegmbh<120>改良的用于产生岩藻糖基化寡糖的方法<130>2827p112ep<140>ep16196486.1<141>2016-10-29<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>6783<212>dna<213>人工序列<220><223>转座子盒<400>1gccagatgattaattcctaatttttgttgacactctatcattgatagagttattttacca60ctccctatcagtgatagagaaaagtgaaatgaatagttcgacaaaaatctagaaataatt120ttgtttaactttaagaaggagatatacaatttcgtcgacacacaggaaacatattaaaaa180ttaaaacctgcaggagtttgaaggagatagaaccatggcgcagtcgaaactctatccagt240tgtgatggcaggtggctccggtagccgcttatggccgctttcccgcgtactttatcccaa300gcagtttttatgcctgaaaggcgatctcaccatgctgcaaaccaccatctgccgcctgaa360cggcgtggagtgcgaaagcccggtggtgatttgcaatgagcagcaccgctttattgtcgc420ggaacagctgcgtcaactgaacaaacttaccgagaacattattctcgaaccggcagggcg480aaacacggcacctgccattgcgctggcggcgctggcggcaaaacgtcatagcccggagag540cgacccgttaatgctggtattggcggcggatcatgtgattgccgatgaagacgcgttccg600tgccgccgtgcgtaatgccatgccatatgccgaagcgggcaagctggtgaccttcggcat660tgtgccggatctaccagaaaccggttatggctatattcgtcgcggtgaagtgtctgcggg720tgagcaggatatggtggcctttgaagtggcgcagtttgtcgaaaaaccgaatctggaaac780cgctcaggcctatgtggcaagcggcgaatattactggaacagcggtatgttcctgttccg840cgccggacgctatctcgaagaactgaaaaaatatcgcccggatatcctcgatgcctgtga900aaaagcgatgagcgccgtcgatccggatctcaattttattcgcgtggatgaagaagcgtt960tctcgcctgcccggaagagtcggtggattacgcggtcatggaacgtacggcagatgctgt1020tgtggtgccgatggatgcgggctggagcgatgttggctcctggtcttcattatgggagat1080cagcgcccacaccgccgagggcaacgtttgccacggcgatgtgattaatcacaaaactga1140aaacagctatgtgtatgctgaatctggcctggtcaccaccgtcggggtgaaagatctggt1200agtggtgcagaccaaagatgcggtgctgattgccgaccgtaacgcggtacaggatgtgaa1260aaaagtggtcgagcagatcaaagccgatggtcgccatgagcatcgggtgcatcgcgaagt1320gtatcgtccgtggggcaaatatgactctatcgacgcgggcgaccgctaccaggtgaaacg1380catcaccgtgaaaccgggcgagggcttgtcggtacagatgcaccatcaccgcgcggaaca1440ctgggtggttgtcgcgggaacggcaaaagtcaccattgatggtgatatcaaactgcttgg1500tgaaaacgagtccatttatattccgctgggggcgacgcattgcctggaaaacccggggaa1560aattccgctcgatttaattgaagtgcgctccggctcttatctcgaagaggatgatgtggt1620gcgtttcgcggatcgctacggacgggtgtaaacgtcgcatcaggcaatgaatgcgaaacc1680gcggtgtaaataacgacaaaaataaaattggccgcttcggtcagggccaactattgcctg1740aaaaagggtaacgatatgaaaaaattaacctgctttaaagcctatgatattcgcgggaaa1800ttaggcgaagaactgaatgaagatatcgcctggcgcattggtcgcgcctatggcgaattt1860ctcaaaccgaaaaccattgtgttaggcgg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