罗丹明-唾液酸缀合物及其合成方法与溶酶体成像应用与流程

本发明涉及罗丹明-唾液酸缀合物，尤其是涉及罗丹明-唾液酸缀合物及其合成方法与在细胞中溶酶体的荧光成像、长时间和实时荧光追踪中的应用。

背景技术：

溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，其在细胞的众多生物过程中都起到重要作用，主要参与细胞自吞噬、凋亡、及癌症发展等过程。在上述过程中，溶酶体参数，如体积、形态、位置等会发生显著的变化^[1-2]。商业化溶酶体探针通过酸化滞留在溶酶体中，溶酶体ph升高后该类探针离开溶酶体(如lysotrackergreendnd26)，丧失了对溶酶体定位能力与成像效能^[3]。低背景的、能够长时间实时追踪、并能够标记溶酶体形态与位置的荧光探针，对研究与溶酶体相关细胞信号传导，以及癌症分析等不同领域都有重要意义^[4]。

参考文献：

[1]g.kroemer,m.jaattela,natrevcancer2005,5,886-897。

[2]v.i.korolchuk,s.saiki,m.lichtenberg,f.h.siddiqi,e.a.roberts,s.imarisio,l.jahreiss,s.sarkar,m.futter,f.m.menzies,c.j.o'kane,v.deretic,d.c.rubinsztein,natcellbiol2011,13,453-460.

[3]z.li,s.wu,j.han,s.han,analyst2011,136,3698-3706.

[4]y.urano,d.asanuma,y.hama,y.koyama,t.barrett,m.kamiya,t.nagano,t.watanabe,a.hasegawa,p.l.choyke,h.kobayashi,naturemedicine2009,15,104-109.

[5]x.chen,s.-w.nam,m.j.jou,y.kim,s.-j.kim,s.park,j.yoon,org.lett.2008,10,5235-5238.

技术实现要素：

本发明的目的在于为了解决传统溶酶体染料光稳定性差、细胞滞留时间短和伴随着酸性丧失而流失等缺点，提供罗丹明-唾液酸缀合物及其合成方法与溶酶体成像应用。

所述罗丹明-唾液酸缀合物的化学结构式如下：

在罗丹明-唾液酸缀合物中，连接罗丹明与唾液酸的连接臂可采用酰胺键或其它结构，所述其它结构可采用硫脲等。

所述唾液酸可采用唾液酸单糖，所述唾液酸单糖的c-2取代基可为羟基或其它取代基，所述其它取代基可采用苯硫酚等。

所述罗丹明-唾液酸缀合物的合成方法如下：

将9-氨基唾液酸与n-羟基琥珀酰亚胺罗丹明x-5羧酸酯加入二氧六环和水的混合溶液，利用饱和碳酸钠溶液调至ph9，反应过夜，除去反应体系的溶剂，利用hplc分离得到罗丹明-唾液酸缀合物。

所述9-氨基唾液酸、n-羟基琥珀酰亚胺罗丹明x-5羧酸酯、二氧六环、水的配比可为：300mg︰400mg︰3ml︰3ml，其中，9-氨基唾液酸和n-羟基琥珀酰亚胺罗丹明x-5羧酸酯以质量计算，二氧六环和水以体积计算。

所述罗丹明-唾液酸缀合物在细胞中溶酶体的荧光成像、长时间和实时荧光追踪中的应用。

所述细胞为活细胞；所述在细胞中溶酶体的荧光成像时间可超过60h；所述实时荧光追踪的拍摄次数可超过600次。

所述荧光成像可以应用于活细胞的超高分辨率的随机重构荧光显微成像法。

所述细胞中溶酶体的荧光成像方法包括荧光显微镜法、激光共聚焦荧光显微镜法、转盘共聚焦荧光显微镜法、结构分辨荧光显微镜法和随机重构荧光显微镜法等。

本发明的原理如下：

所述罗丹明-唾液酸缀合物是通过罗丹明x的4位或5位的活性基团与唾液酸衍生物的9位氨基反应，将罗丹明x与9-氨基-唾液酸连接，形成罗丹明-唾液酸缀合物。该化合物能富集在溶酶体，罗丹明的红色荧光不随ph值改变而改变，该化合物在溶酶体中的滞留不依赖于溶酶体的酸度，能够对溶酶体进行长时间、实时的荧光成像。

本发明的有益效果如下：

所述罗丹明-唾液酸缀合物1)准确地定位活细胞溶酶体，信噪比高；2)在溶酶体中发射红色荧光，溶酶体酸度变化，探针保持强荧光；3)长时间滞留在溶酶体中(超过60h)；4)在溶酶体中的滞留不依赖于溶酶体的酸度；5)对溶酶体进行实时荧光成像(共聚焦拍摄超过600次)；5)用于溶酶体进行超高分辨率的随机重构荧光显微成像。

附图说明

图1为本发明实施例的罗丹明-唾液缀合物的吸收光谱；

图2为本发明实施例的罗丹明-唾液缀合物的荧光激发光谱和荧光发射光谱；

图3为本发明实施例的罗丹明-唾液缀合物在不同ph下的荧光值(激发波长为585nm，发射波长为615nm)；

图4为本发明实施例的罗丹明-唾液缀合物在细胞中与溶酶体特异的蛋白共定位的激光共聚焦荧光显微图；

图5为本发明实施例的罗丹明-唾液缀合物在细胞溶酶体中的滞留不依赖酸度的激光共聚焦荧光显微图；

图6为本发明实施例的罗丹明-唾液缀合物在细胞饥饿条件长时间滞留在细胞中的荧光显微图；

图7为本发明实施例的罗丹明-唾液缀合物用于活细胞溶酶体的超高分辨率的随机重构荧光显微图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

所述罗丹明-唾液酸缀合物的化学结构式如下：

所述罗丹明-唾液酸缀合物的合成方法如下：

将9-氨基唾液酸与n-羟基琥珀酰亚胺罗丹明x-5羧酸酯加入二氧六环和水的混合溶液，利用饱和碳酸钠溶液调至ph9，反应过夜，除去反应体系的溶剂，利用hplc分离得到罗丹明-唾液酸缀合物。

所述9-氨基唾液酸、n-羟基琥珀酰亚胺罗丹明x-5羧酸酯、二氧六环、水的配比可为：300mg︰400mg︰3ml︰3ml，其中，9-氨基唾液酸和n-羟基琥珀酰亚胺罗丹明x-5羧酸酯以质量计算，二氧六环和水以体积计算。

所述罗丹明-唾液酸缀合物在细胞中溶酶体的荧光成像、长时间和实时荧光追踪中的应用。

所述细胞为活细胞。

所述细胞中溶酶体的荧光成像方法包括荧光显微镜法、激光共聚焦荧光显微镜法、转盘共聚焦荧光显微镜法、结构分辨荧光显微镜法和随机重构荧光显微镜法等。

以下给出具体实施例：

1)罗丹明-唾液酸缀合物的合成：

取300mg9-氨基唾液酸与400mgn-羟基琥珀酰亚胺罗丹明x-5羧酸酯加入二氧六环(3ml)及水(3ml)的混合溶液，利用饱和碳酸钠溶液调至ph9，反应过夜。除去反应体系的溶剂，利用hplc分离得到罗丹明-唾液酸缀合物289mg。

2)配制浓度为20mm罗丹明-唾液酸缀合物的标准溶液：

称取8mg的罗丹明-唾液酸缀合物溶于0.5ml的超纯水。即得20mmol/l(20mm)的罗丹明-唾液酸缀合物的标准溶液。

3)收集罗丹明-唾液酸缀合物的吸收光谱、荧光激发光谱和荧光发射光谱：

取1μl罗丹明-唾液酸缀合物标准溶液与2ml超纯水混合，得到含有10μmol/l(10μm)罗丹明-唾液酸缀合物溶液，从紫外可见光谱(图1)可知，罗丹明-唾液酸缀合物的最大吸收波长为585nm，从荧光激发光谱和荧光发射光谱(图2)可知，罗丹明-唾液酸缀合物的最大荧光激发波长为585nm，最大荧光发射波长为615nm。

4)检测罗丹明-唾液酸缀合物(10μm)在不同ph值的缓冲溶液中(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)的荧光发射强度(参见图3)，可以发现该罗丹明-唾液酸缀合物的最大荧光发射强度不随ph的改变而改变。

5)配制浓度为20μm罗丹明-唾液酸缀合物的细胞培养溶液：

取10μl罗丹明-唾液酸缀合物衍生物标准溶液与10ml细胞培养溶液混合，得到含有20μmol/l(20μm)罗丹明-唾液酸缀合物的细胞培养液。

6)共聚焦荧光显微镜评估罗罗丹明-唾液酸缀合物在细胞溶酶体中的分布：

将含有20μm罗丹明-唾液酸缀合物的细胞培养液与生长在35mm玻璃底培养皿上的表达有溶酶体相关膜蛋白2融合绿色荧光蛋白的hela细胞共同孵育24h，用新鲜的细胞培养液洗三遍，再用共聚焦荧光显微镜对细胞内荧光信号进行采集。

从图4可以观察到罗丹明-唾液酸缀合物的红光与溶酶体相关膜蛋白2融合绿色荧光蛋白的绿光定位一致，说明罗丹明-唾液酸缀合物在溶酶体中富集，并能发射出红色荧光。

7)共聚焦荧光显微镜评估罗丹明-唾液酸缀合物在细胞的溶酶体酸度丧失之后仍能继续对溶酶体进行标记：

将含有20μm罗丹明-唾液酸缀合物的细胞培养液与生长在35mm玻璃底培养皿上的野生型hela细胞(2盘)共同孵育24h，用新鲜的细胞培养液洗三遍，再分别用含有二甲亚砜(0.1％)的细胞培养液和含有巴佛洛霉素a1(100nm)的细胞培养液分别孵育野生型hela细胞8h，最后利用共聚焦荧光显微镜观察罗丹明荧光的强度变化。从图5可以看出，在巴佛罗霉素a1处理后，罗丹明荧光并没有下降，仍然能很好地标记溶酶体。

8)共聚焦荧光显微镜评估罗丹明-唾液酸缀合物在细胞溶酶体中的滞留时间：

将含有20μm罗丹明-唾液酸缀合物的细胞培养液与生长在12孔板中的野生型u2os细胞共同孵育24h，用新鲜的细胞培养液洗三遍，再用去掉血清的细胞培养液继续对细胞进行饥饿培养，每隔24h用共聚焦荧光显微镜拍摄细胞中的红色荧光变化。从图6可以看出，罗丹明-唾液酸缀合物可以在细胞的溶酶体中滞留超过120h。

9)罗丹明-唾液酸缀合物用于活细胞溶酶体的超高分辨率随机重构荧光显微成像：

将含有20μm罗丹明-唾液酸缀合物的细胞培养液与生长在12孔板中的野生型u2os细胞共同孵育24h，用新鲜的细胞培养液洗三遍，放置4h后用随机重构荧光显微镜进行拍摄，从图7可以看出，罗丹明-唾液酸缀合物能够对活细胞的溶酶体进行超高分辨率的随机重构荧光显微成像。