用于预测急性心肌梗死风险的试剂盒的制作方法

本发明涉及医学诊断领域，具体而言，涉及一种用于预测急性心肌梗死风险的试剂盒。

背景技术：

(1)引言

心血管疾病，又称为循环系统疾病，包括急性风湿热、慢性风湿性心脏病、高血压性疾病、缺血性心脏病、肺源性心脏病即肺心病和肺循环疾病、脑血管疾病，以及其它心脏与血管等循环系统疾病。世界卫生组织2015年的统计数据指出，心血管疾病是全球的头号死因，在2012年有1750万人死于心血管疾病，占全球死亡总数的31％。我国心血管病患病人数为2.9亿，其发病率、死亡率居各种疾病之首。目前心血管疾病的风险评估主要是血压、血糖、血脂等指标的检测，而在预防和治疗上，一般根据病史和影像学检查结果采取缓解病因，减少诱发因素以及改善生活方式等方法降低新的心脏损害发生，并不能达到早期预防和快速诊断的效果。

急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,ami)作为全世界范围内高发病率和死亡率的心血管疾病之一，一直是心血管疾病的研究热点。ami是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，甚至危及生命。ami在中国近年来发病率呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患至少200万。对ami及早、快速、准确的进行诊断，是降低死亡率的有效举措。

现有影像学和生物标志物检查结果的灵敏度和特异性有一定的局限性，不能达到早期预防和快速诊断的效果。因此，预防和快速诊断急性心肌梗死以便后续治疗，已成为医学和生物学研究的重大任务之一。

(2)micrornas

micrornas(mirnas)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小rna，这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个mirnas，在不同组织、不同发育阶段中的表达水平有显著差异。几个mirnas也可以调节同一个基因，或可以通过几个mirnas的组合来精细调控某个基因的表达。mirnas表达模式具有分化的位相性和时序性等特性，提示其有可能作为参与调控基因表达的分子，因而对疾病诊断具有重要现实意义。

在细胞核中，mirnas由dna转录而来。mirnas的前体(pre-mirna)由rnaseiii酶切割后形成的。然后被运输至细胞质中，进一步裂解成19至23个核苷酸长度的成熟的mirna双链核苷酸。其中一条链被降解或从细胞中释放出来，另一条链被加载至rna诱导沉默复合体(rna-risc)，可以防止目标mrna转化为蛋白质。

microrna-risc对靶基因mrna的作用一直主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，主要有三种方式。第一种是切断靶基因的mrna分子——mirna与靶基因完全互补结合，作用方式和功能与sirna非常相似，最后切割靶mrna。第二种是抑制靶基因的翻译——作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mrna的稳定性，这种mirna是目前发现最多的种类(如线虫lin-4)。第三种是结合抑制——具有以上两种作用模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mrna；当与靶基因不完全结合时，起调节基因表达的作用。

mirnas在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，已经引起研究人员的广泛关注。随着对于mirnas作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的例如mirnas芯片等高通量的技术手段对于mirna和疾病之间的关系进行研究，人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解将会提高到一个新的水平。这也将使mirna可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，给人类疾病的治疗提供一种新的手段。

(3)mirnas作为生物标志物的优势

生物标志物，用于建立ami患者的诊断，最初开始于心肌蛋白的定向分析，已经成为ami诊断的越来越重要的指标。肌酸激酶同工酶(ck-mb)及肌钙蛋白(t或i)升高是诊断急性心肌梗死的重要指标，并已广泛应用于临床诊断。其中，心肌肌钙蛋白(ctni)是目前公认的“金标准”的ami诊断。然而，随着早期诊断ami的敏感性和特异性的要求不断提高，新的生物标志物的探索也从未停止。

理想的生物标志物具有以下特性：能够通过非损伤性的方法获得；诊断结果具有较高的灵敏性和特异性；在疾病的早期即能够检测到，且随疾病的发展呈现特定的变化特征，能够反映组织器官病理生理的特异性变化；具有快速简便的检测技术。相比于传统ami检测标准，mirnas满足以上全部特点，且能够通过基因序列特异性扩增技术进行特异性检测，比蛋白生物标志物在疾病诊断方面更为有效。

近年来，ami的发病率和死亡率居高不下，各个国家和地区的人们都被备受其扰。“早发现、早诊断、早治疗”可以有效地提高患者的生存率和治愈率，从而减轻患者的精神和经济负担。因此，低成本、及时有效的ami早期诊断手段仍有待开发。mirnas高度稳定存在于血液循环中，已经被证实在基因表达的转录和转录后调节中起到重要作用。且有研究表明，mirnas也在动物的尿液中检测出来。尿液生物标志物的研究，将赋予人类在疾病预防、诊断、治疗及预后监测等诸多方面实现更多进步的可能性。

对血液中ami特异性mirnas研究结果表明，mirnas可以作为血液和尿液中的生物标志物，用于ami的早期诊断和快速鉴定，由于其较早达到表达峰值的特性，可能比传统的鉴定标准ctni更为灵敏。然而，现有研究均基于小样本的人群分析，且已知的mirnas数量很少，并不能评估mirnas与ami患者临床特点及潜在预后价值的相关性，其诊断价值需要进一步更大范围的筛选鉴定研究。

(4)ami特异性mirnas生物标志物研究具有重要的理论和实践意义

检测mirnas具有一定的临床价值，其可以作为ami早期诊断的生物标志物。目前关于循环mirnas在外周血中作为ami发生早期的生物标志物的研究较少，且目前尚未发现有关ami患者尿液样本中mirnas可以作为生物标志物的相关报道。发现更多的mirnas，筛选出血液和尿液样本中的特异性表达指标，对提高诊断ami的灵敏性和特异性，具有重要的理论和现实意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于寻找与急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,ami)相关的血浆新型生物学标志物，用于ami患者的早期诊断和预警，指导ami的预防和诊断，减轻ami的威胁。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及microrna-22-5p和/或microrna-375作为分子标记物在制备用于预测急性心肌梗死风险的试剂盒中的应用。

其中，microrna-22-5p和microrna-375的acessionnumber分别为mimat0004495以及mimat0000728，其核苷酸序列分别如seqidno:5和seqidno:6所示。

本发明申请人通过对32例ami患者和20例健康对照的血浆microrna-22-5p、microrna-375的表达水平进行比较，研究microrna-22-5p、microrna-375和ami的相关性，寻找可信的ami易感生物人群标记。步骤是使用edta-na抗凝管采集ami患者和健康人群的外周血5ml，3000×g，25℃离心十分钟后提取上层血浆，采用trizol法提取血浆rna，然后采用实时荧光定量pcr方法进行对microrna-22-5p、microrna-375和外参cel-mir-39进行扩增；在分别计算每例标本的microrna-22-5p、microrna-375相对cel-mir-39的归一化表达水平，结果经过spss16.0进行检验，以p＜0.05为显著性检验标准，发现在ami患者和健康人群中表达存在显著性差异。

本发明还涉及一种用于预测急性心肌梗死的试剂盒，包括microrna-22-5p和/或microrna-375的检测剂。

与现有技术相比，本发明所提供的试剂盒对ami有很好的诊断和预测效能，能够预测ami的发病风险，指导ami的预防和治疗，减轻ami的威胁。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为ami患者和健康人群的血浆中microrna-22-5p表达水平(即与cel-mir-39相比microrna-22-5p的归一化水平)；

图2.为ami患者和健康人群的血浆中microrna-375表达水平(即与cel-mir-39相比microrna-22-5p的归一化水平)；

其中*：p＜0.05，即有显著统计学差异；

图3为ami患者和健康人群血浆中microrna-136-3p和microrna-4791单独及二者联合运用的工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，简称roc曲线)，该图中显示了roc曲线、曲线下面积(areaunderthecurve，auc)、灵敏性(sensitivity)、特异性(specificity)，其中auc反映了预测效能(auc＝0.5，没有预测效能；0.5＜auc＜0.7很小的预测价值；0.7＜auc＜0.9相当准确的预测价值；0.9＜auc＜1，很准确的预测价值)。

具体实施方式

本发明涉及microrna-22-5p和/或microrna-375作为分子标记物在制备用于预测急性心肌梗死风险的试剂盒中的应用。

具体的，本发明涉及microrna-22-5p和/或microrna-375的检测剂在制备用于预测急性心肌梗死风险的试剂盒中的应用。

所述检测剂用于通过测量来自受试者的受试样品中的microrna-22-5p和/或microrna-375的表达水平来诊断所述受试者是否具有急性心肌梗死风险；其中相对于健康人样品中的相应microrna-22-5p和/或microrna-375表达水平会上调，以指示受试者具有急性心肌梗死风险大小。

本发明还涉及一种用于预测急性心肌梗死风险的试剂盒，包括microrna-22-5p和/或microrna-375的检测剂。

优选的，如上所述的应用或试剂盒，所述检测剂包括下述核酸序列中的一种或多种：

a)、能够与所述microrna-22-5p和/或microrna-375杂交的带有显示信号强度的指示剂的探针a；

b)、能够对所述microrna-22-5p和/或microrna-375反转录得到的cdna进行扩增的引物对；

c)、与b)中所述cdna结合的带有显示信号强度的指示剂的探针b。

具体的，检测剂对应的检测方法可为，原位杂交(特别是荧光原位杂交，fish)、northernblot、qrt-pcr(使用taqman探针或者荧光染料)以及其他可用于rna定量分析的方法。

优选的，如上所述的应用或试剂盒，显示信号强度的指示剂包括荧光物质、生物素、放射性同位素、地高辛中的任一种。

优选的，如上所述的应用或试剂盒，所述荧光物质包括alexa350、alexa405、alexa430、alexa488、alexa555、alexa647、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、cascadeblue、cy2、cy3、cy5、cy7、6-fam、丹磺酰氯、荧光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、oregongreen488、oregongreen500、oregongreen514、pacificblue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、lajolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninb、藻蓝蛋白c、藻蓝蛋白r、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白r、reg、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、rox、tamra、tet、trit(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种；

优选的，所述放射性同位素包括¹¹⁰in、¹¹¹in、¹⁷⁷lu、¹⁸f、⁵²fe、⁶²cu、⁶⁴cu、⁶⁷cu、⁶⁷ga、⁶⁸ga、⁸⁶y、⁹⁰y、⁸⁹zr、⁹⁴mtc、⁹⁴tc、⁹⁹mtc、¹²⁰i、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹³¹i、^154-158gd、³²p、¹¹c、¹³n、¹⁵o、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、⁵¹mn、⁵²mmn、⁵⁵co、⁷²as、⁷⁵br、⁷⁶br、⁸²mrb和⁸³sr中的一种或多种。

优选的，如上所述的应用或试剂盒，在b)中，能够对所述microrna-22-5p反转录得到的cdna进行扩增的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示；

能够对所述microrna-375反转录得到的cdna进行扩增的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别如seqidno:3和seqidno:2所示。

优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于扩增外参microrna反转录得到的cdna的引物对。

优选的，如上所述的试剂盒，所述外参microrna为cel-mir-39。

优选的，如上所述的试剂盒，所述外参microrna为cel-mir-39反转录得到的cdna的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别如seqidno:4和seqidno:2所示。

优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒还包括rna提取试剂、逆转录酶、荧光定量pcr反应缓冲液、用于对扩增产物进行定量的指示剂、样品处理液、无核酸水、dna聚合酶、阴性对照以及阳性对照中的一种或多种；

优选的，所述dna聚合酶选自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶、klenow片段中的任一种；

优选的，所述对扩增产物进行定量的指示剂选自sybrgreeni、evagreen、picogreen、pekogreen、碘化丙啶、钙黄绿素或羟基萘酚蓝中的任一种。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

一、材料与标本收集描述

ami患者合计32例。正常人群的血浆标本合计19例。ami的诊断是通过目前公认的“金标准”——心肌肌钙蛋白(ctni)的检测结果来确认的。每个样本用edta-na抗凝管合计收集5ml血液。

二、样品处理和rna提取

在静脉血采集后10min内，在3000×g，25℃下离心10分钟之后，用无rna酶和无细菌的吸头取上层血浆于无rna酶和无细菌的ep管中-80℃保存备用。血浆中的rna通过trizol法进行提取和纯化。

三、实时荧光定量pcr(sybr染料法)

运用中国大连宝生物有限公司的microrna实时荧光定量pcr试剂盒(sybrpremixextaqii，货号：rr820a)对microrna-22-5p、microrna-375和外参cel-mir-39进行扩增，分别得到ct值(cyclethreshold)，通过公式：(其中：△△ct＝△ct(试验样品)—△ct(基准样品)△ct(试验样品)＝ct(试验样品,目的基因)—ct(试验样品,内参基因)△ct(基准样品)＝ct(基准样品,目的基因)—ct(基准样品,内参基因))。在分别计算每例标本的microrna-22-5p、microrna-375的表达水平，具体操作过程见说明书。每个样本重复三次实验。microrna-22-5p、microrna-375和外参cel-mir-39引物序列见表3.

四、统计分析方法。

运用统计学软件spss16.0进行统计。正态性检验采用shapiro-wilk法，显著性差异用mann-whitney检验(mann-whitneytest)，工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，简称roc曲线)及线下面积(areaunderthecurve，auc)用于评价microrna-22-5p、microrna-375单独的预测效能。当p＜0.05时认为有统计学差异。

运用二元logistic回归，建立microrna-22-5p、microrna-375的相关方程，得到预测概率p，并以预测概率p为检验变量进行roc曲线分析，继而评价microrna-22-5p和microrna-375联合运用的预测效能。当p＜0.05时认为有统计学差异。

五、结果分析

1.ami患者和健康人群血浆microrna-22-5p的表达量相比，p＜0.05，有极显著统计学差异。

2.ami患者和健康人群血浆microrna-375的表达量相比，p＜0.05，有极显著统计学差异。

3.血浆microrna-22-5p对ami的预测效能通过roc曲线可以知道，microrna-22-5p对ami的预测效能是很好的，auc为0.847(95％ci，0.723-0.930)。

4.血浆microrna-375对ami的预测效能通过roc曲线可以知道，microrna-375对ami的预测效能是很好的，auc为0.788(95％ci，0.657-0.887)。

5.联合运用血浆microrna-22-5p和microrna-375对ami的诊断效能通过roc曲线可以知道，联合运用血浆microrna-136-3p和microrna-4791对ami的预测效能是很好的，优于其单独运用，auc为0.854(95％ci，0.732-0.935)。

六、结论

血浆中microrna-22-5p和microrna-375对ami的预测效能是很好的，能够预测ami的发病风险，并且二者的联合运用的预测效能优于分别单独使用。

表1ami患者与健康人群血浆中microrna的表达水平

*代表ami患者组vs.健康人群：p<0.05。

表2microrna的基本信息

表3mir-22-5p、mir-375、cel-mir-39引物信息

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>青岛大学

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