一种诊断神经胶质瘤的microRNA分子标记物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测神经胶质瘤的microRNA标志物及其在制备神经胶质瘤检测试剂盒中的应用。通过定量PCR的方法检测被测者血中的microRNA-29家族的含量，并与正常microRNA水平比较来诊断神经胶质瘤，该神经胶质瘤分子标志物microRNA灵敏度高、特异性强，操作方便，安全无创伤及易于大量筛查。
【专利说明】-种诊断神经胶质瘤的microRNA分子标记物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学分子生物学【技术领域】，是一种将血中的microRNA作为生物标记 物用于神经胶质瘤的诊断。
【背景技术】
[0002] 神经胶质瘤简称胶质瘤，也称为胶质细胞瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿 瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，广义是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义是指源于各类 胶质细胞的肿瘤。根据世界卫生组织（WHO) 1999年的分类方案分为星形细胞瘤、少支胶质 瘤、室管膜瘤、混合性胶质瘤、脉络丛瘤、来源不肯定的神经上皮组织瘤、神经元及神经元神 经胶质混合瘤、松果体实质肿瘤、胚胎性肿瘤、神经母细胞瘤肿瘤。
[0003] 目前的诊断和筛查在结合临床表现的基础上，诊断有赖于神经影像学和病理学检 查。但是神经影像学检查依赖于仪器且价格高，病理学检查虽然是金标准，但是属于侵入性 的，有带来后遗症的风险。价格便宜、方便快捷和安全的早期诊断和筛查是神经胶质瘤遇到 的最主要问题，往往有临床表现以及发现神经影像学和病理学异常时已经太晚，其五年生 存率只有3%。
[0004] 因此，临床上迫切需要一个非常准确的、价格便宜、方便快捷的能够实现早期诊断 或者筛查的分子标记物。遗憾的目前为止，在神经胶质瘤早期诊断和筛查方面尚未找到可 信的分子标记物。尽管methylguanine methyl transferase、PTEN/MMACl已经被人们提出 来作为神经胶质瘤早期诊断和筛查的标记物，但是目前看来这些标记物在特异性、准确性 等方面都不尽如人意（McNamara MG, Sahebjam S, Mason WP(2013)Emerging biomarkers in glioblastoma. Cancer5(3):1103 - 1119. doi:10. 3390/cancers5031103)。
[0005] MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编 码RNA，其大小长约20?25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列 核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复 合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途 径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
[0006] 最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50 %得到注解的miRNAs在基 因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site)。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中 起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员 将 miRNA 命名为 "oncomirs"。
[0007] 已经有研究认为miRNA可以作为一种潜在的肿瘤早期发现和诊断的标记物，而且 miRNA在血清、血楽、尿液等体液中是稳定的，使得其作为肿瘤标记物的可能性又进一步加 大，而且随着目前技术的进步，miRNA检测技术越来越方便、快捷和价格低廉。
[0008] 在已经报道的miRNA当中，microRNA-29的高表达已经被认为与某些肿瘤的发生 发展相关，比如与结直肠癌，其灵敏度和精确度分别是69.0 %和89. 1 % (Huang Z，Huang D, Ni S1Peng Z1Sheng ff, Du X(2010)Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer.Int J Cancer J Int Cancer 127 (I):118-126. doi :10. 1002/ijc. 25007)。再比如在急性白血病中，microRNA-29的高表达与其发生 发展相关，其灵敏度和优化之后的精确度分别为86. 7%和95.0% (Wang F et al.，2012. miR_29a and miR-142_3p downregulation and diagnostic implication in human acute myeloid leukemia. Mol Biol R印 39 (3) :2713 - 2722. doi :10. 1007/sll033-011-1026-5)。
[0009] 但是由于肿瘤发生、发展的组织特异性，在另外一些肿瘤当中出现了 microRNA-29 家族低表达的情况，在这些肿瘤当中，肿瘤的发生发展是与microRNA-29家族的低表达相 关的，这些肿瘤包括肝癌（SU et al·· MicroRNA-101, down-regulated in hepatocellular carcinoma, promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity. Cancer Res 2009 ； 69:1135-1142.)、乳腺癌（Iorio MV, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res 2005;65:7065-7070·)、慢性白血病（Pekarsky Y，et al.Tcllexpression in chronic lymphocytic leukemia is regulated by miR_29and miR-181. Cancer Res 2006 ；66:11590 - 11593.)〇
[0010] 尤其是在白血病当中，急性和慢性白血病中microRNA-29家族扮演了截然相反的 角色。因此，在特定的肿瘤当中microRNA-29家族扮演的角色如何，没有现成的答案、也无 法由其他肿瘤的结果给出教导和启示，需要深入的开展特异性的研究。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于检测神经胶质瘤及其分期的 microRNA标志物，通过检测被测者血清或者血浆中microRNA-29家族的含量，并与正常人 群血清或者血楽中的microRNA-29家族的水平进行比较来诊断神经胶质瘤，该microRNA的 灵敏度和精确度高；通过microRNA-29家族的水平高低差异可以区分早期和晚期肿瘤。
[0012] 本发明解决上述技术问题的技术方案是：一种筛查和诊断神经胶质瘤及其分期的 microRNA 标志物，所述标志物为 microRNA-29 家族（包括 miR-29a、miR-29b 和 miR-29c)， miR-29a、miR-29b 和 miR-29c 的序列分别如序列表序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
[0013] 本发明的有益效果是：筛查出的microRNA标志物作为用于检测神经胶质瘤的精 确度和灵敏度高。
[0014] 更进一步的，在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0015] 本发明还包括一种诊断神经胶质瘤的microRNA标志物在制备神经胶质瘤诊断试 剂中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1与内参microRNA-24的水平相比的血清miR-29家族的归一化水平
[0017] Control指正常人群，WHO I-II指早期神经胶质瘤患者，WHO III-IV指晚期神 经胶质瘤患者。显著性差异含义为，P〈0.05，*P〈0.01，〃P〈0.005。早期患者（WHO I-II)与正常（Control)比较〃 Ρ〈0·01，为极显著性差异。晚期患者（WHO III-IV)与正 常（Control)比较〃 w Ρ〈0· 005,为极显著性差异。早期患者（WHO I-II)与晚期患者（WHO ΙΙΙ-?ν)比较Wp〈0. 05,为显著性差异。
[0018] 图2神经胶质瘤患者血清miR-29家族的ROC曲线（Receiver operating characteristic curves，ROC curves)及曲线下面积（areas under the curve, AUC)图中 显示了早期患者（WHO 1-11)、晚期患者（WHO III-IV)和所有患者（WHO I-IV)的ROC曲线、 曲线下面积、灵敏度（Sensitivity)和准确度（Specificity)。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图对本发明进行描述，所列举的实施例仅仅是用来解释本发明，并非 用于限制本发明的范围。
[0020] 实施例1临床血清标本microRNA-29家族的表达与神经胶质瘤发病的相关性研究
[0021] 一、材料与标本收集描述
[0022] 神经胶质瘤患者血清标本收集至来自临床的处于不同分期的神经胶质瘤患者， 合计83例。正常人群的血清标本收集至来自正常健康人群，合计69例。神经胶质瘤的 诊断是通过组织病理学或者磁共振成像来确认的，标准是基于WHO的分类；神经胶质瘤的 分期是根据 WHO 和 TNM 的分类标准（Sobin LH, Fleming ID, 1997. TNM classification of malignant tumors, fifth edition (1997). Union Internationale contre Ie cancer and the American joint committee on cancer. Cancer 80 (9) : 1803 - 1804)。神经胶质瘤患 者在取血之前没有经过外科手术、化疗或者放疗等任何抗肿瘤方面的治疗。每个样本用 PAXgene Blood RNA tubes (BD Biosciences, Basel, Switzerland)合计收集 IOml 血液。
[0023] 二、样品处理和RNA提取
[0024] 血液在凝血之后，在500 X g、4摄氏度下离心60分钟之后取上层血清保存于-80摄 氏度下备用。血清中的 RNA通过MiRNeasy Kit (Qiagen GmbH, Hombrechtikon, Switzerland) 按照说明书操作步骤进行提取和纯化。
[0025] 三、定量 PCR
[0026] 定量 PCR 实验参照 W Wei 等人的方法（Wei W, et al. · miR_29targets Akt3to reduce proliferation and facilitate differentiation of myoblasts in skeletal muscle development. Cell Death and Disease(2013)4, e668 ；doi:10. 1038/ cddis. 2013. 184)。血清中 microRNA-29 家族表达的高低通过 Ct 值（Cycle threshold)来 评估，计算方法是2_ΛΛα。本实验中microRNA-24作为内参，microRNA-29家族的Ct值通 过内参microRNA-24的量来归一化。每个样本做三个重复实验。
[0027] 四、统计分析方法
[0028] 显著性差异用 t 检验（student，s t test)、Mann - Whitney 检验（Mann - Whitney test)和 x 检验（xtest)。ROC 曲线（Receiver operating characteristic curves，ROC curves)及曲线下面积（areas under the curve, AUC)被用作为预测miR-29家族在神经胶 质瘤中标记物的指标。优化的灵敏度和精确度根据检验前概率（pre-test probability) 和由ROC获得的值比（cost ratio)来计算获得。所用的统计软件为SPSS 19. 0,当P值小 于0. 05时认为显著。
[0029] 五、实验结果
[0030] l、miR-29家族在早晚等各期神经胶质瘤患者及正常人群中的表达
[0031] 如图1所示，与内参microRNA-24的水平相比的血清miR-29家族的归一化水平在 所有神经胶质瘤组和正常人群组之间都有显著性差异（p〈0. 01)。而且晚期患者组和正常人 群组之间有极显著性差异（P〈〇. 005)。再比较早期患者和晚期患者组，组间也有显著差异 (Ρ〈0· 05)。
[0032] 2、神经胶质瘤中miR-29家族的水平作为生物标记物的预测值
[0033] 不同分期的神经胶质瘤患者血清miR-29家族作为生物标记物的预测表现通过 ROC曲线（图2)可知。所有阶段（I-IV期）的神经胶质瘤患者血清miR-29家族作为生物 标记物的预测表现是中等的，其AUC为0. 74(95% CI，0. 67 - 0. 82)，优化的灵敏度和准确 度分别为68. 5%和77. 3%。晚期患者血清miR-29家族作为生物标记物的预测表现是最佳 的，AUC高达0. 81 (95% Cl, 0. 73 - 0. 89)。早期患者血清miR-29家族作为生物标记物的预 测表现尚可，AUC 为 0· 66(95% Cl, 0· 58 - 0· 76)。
[0034] 六、结论
[0035] 1、血中miR-29家族的水平可以作为生物标记物来筛查和诊断神经胶质瘤；
[0036] 2、血中miR-29家族的水平可以作为生物标记物来对神经胶质瘤患者进行分期。
【权利要求】
1. 一种用于诊断神经胶质瘤的microRNA分子标记物，其特征为，所述microRNA分子标 记物为microRNA-29家族。
2. 如权利要求1所述的一种用于诊断神经胶质瘤的microRNA分子标记物，其特征为， 所述 microRNA-29 家族包括 microRNA_29a、microRNA_29b 和 microRNA_29c。
3. 如权利要求2所述的一种用于诊断神经胶质瘤的microRNA分子标记物，其特征为， 所述 microRNA-29a、microRNA-29b 和 microRNA-29c 的序列分别为 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3。
4. 权利要求1-3任意一项所述的一种用于诊断神经胶质瘤的microRNA分子标记物在 制备神经胶质瘤的诊断试剂中的用途。
5. 权利要求1-3任意一项所述的一种用于诊断神经胶质瘤的microRNA分子标记物在 制备神经胶质瘤早晚期分期诊断试剂中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104313171SQ201410621604
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】吴俊华, 江春平 申请人:南京大学