本发明涉及烟酸的生产技术领域，更具体地，涉及一种产烟酸的整合型重组耻垢分枝杆菌及其构建方法。
背景技术：
烟酸即3-吡啶甲酸，也称作为维生素b3，属于维生素b族，是一种水溶性维生素，属于维生素b族，是人体必需的13种维生素之一。烟酸是机体组织中重要的递氢体和抗糙皮病的因子，有维持皮肤和神经健康，促进消化的作用。若其缺乏时，可产生糙皮病，表现为皮炎、舌炎、口咽、腹泻及烦躁、失眠感觉异常等症状。与烟酰胺统称维生素pp，用于抗糙皮病，亦可用作血扩张药。作为医药中间体，用于异烟肼、烟酰胺、尼可刹及烟酸肌醇酯等的生产。现烟酸也用于粮食制品，肉品添加剂和饲料添加剂以预防糙皮病。特别是饲料中添加烟酸后可提高畜禽的抗病能力，加快生长速度，提高饲料的利用率，可大量节省饲料，降低饲养成本。美国曾喂养用添加烟酸的饲料的喂养奶牛，与对照组相比，产奶量可提高15％-20％。另外烟酸还可作为形成活性污泥的生化激素，空气和废气的除臭剂。烟酸在染料工业、感光材料工业、染发助剂、洗涤剂等方面也有一定的应用。
目前工业上主要用化学合成法生产烟酸的生产目前工业上应用的主要为化学法，合成方法主要有液相法（高锰酸钾氧化法和硝酸氧化法）和气相法（臭氧氧化法、氨氧化法和空气氧化法），所用原料主要为3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。目前最常用的方法是以3-甲基吡啶为原料用空气氧化法合成烟酸。将3-甲基吡啶、空气和氨气按比例通入流化床反应器中，在290～360℃、v2o5催化下反应生成烟腈；再于氢氧化钠水溶液中、160℃下高压水解生成烟酸钠，最后用盐酸酸化得烟酸。在这个合成过程中需要经过烟腈这一部中间产物，烟腈通过化学反应生成水解为烟酸需要高温高压、强酸强碱的条件，对设备具有一定的要求而且也会腐蚀设备，且对环境也不友好。清华紫光公司的专利cn114288a报道了用3-甲基吡啶一步催化生成烟酸，其过程为将3-甲基吡啶与硫酸反应生成甲基吡啶硫酸盐，然后在氧化剂硝酸的作用下氧化生成烟酸硫酸盐，烟酸硫酸盐加入碱溶液中可和制得烟酸，原料收率为90％左右。此过程中需要硫酸、硝酸、碱溶液等强酸强碱物质，污染严重。
在烟酸化学合成过程中，必须具备特定的高温高压环境或者采用强酸、强碱或化学催化剂处理，反应选择性不高，副产物多，产品的收率不高，环境污染大。相对而言，生物法制备烟酸具有底物选择性高、催化效率高、反应条件温和、环境污染小等特点。此外，生物法制备易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用。目前有报道用微生物枯草芽孢杆菌、玫瑰色红球菌、诺卡氏菌、茄病镰刀菌以及恶臭假单胞菌发酵来生物催化3-氰基吡啶制备烟酸。但是，生物催化法制备烟酸主要是依赖于微生物发酵产腈水解酶，通过此酶来催化3-氰基吡啶转化为烟酸，仍然需要添加原料3-氰基吡啶。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服上述现有烟酸制备技术的不足，提供一种能够直接生产烟酸的工程菌，该工程菌为可表达nudc基因的工程菌。该工程菌是将nudc基因orf序列连接到入整合型质粒转化到耻垢分枝杆菌中得到，在过表达nudc基因的耻垢分枝杆菌的菌液中即可大量获得烟酸。
本发明的第一个目的是提供一种生产烟酸的重组耻垢分枝杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种制备生产烟酸的重组耻垢分枝杆菌的方法。
本发明的第三个目的是提供所述方法构建的产烟酸的重组耻垢分枝杆菌。
本发明的第四个目的是提供所述重组耻垢分枝杆菌在生产烟酸中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种生产烟酸的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种产烟酸的重组耻垢分枝杆菌，所述重组耻垢分枝杆菌含有重组整合型质粒，其中重组整合型质粒含有nudc基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示。
所述重组耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于，将含有nudc基因序列的重组整合型质粒转化入耻垢分枝杆菌。
优选地，所述整合型质粒为pmv361质粒。
优选地，所述耻垢分枝杆菌为耻垢分枝杆菌mc2155。
优选地，采用电击法进行转化，电击参数是：电压2.5kv，电阻1000ω，电容25µf。
优选地，重组耻垢分枝杆菌的构建方法分为以下步骤：
s1.制备耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞；
s2.转化耻垢分枝杆菌mc2155；
s3.筛选阳性重组菌。
更优选地，重组耻垢分枝杆菌的构建方法分为以下步骤：
s1.制备所述的重组耻垢分枝杆菌：
将耻垢分枝杆菌mc2155单菌落接种于7h9液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至对数生长期(od600为0.5～1.0)；培养物以1:（80～100）的比例接种于新鲜的7h9液体培养基中，37℃过夜培养至od600到0.6左右，于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用预冷的10%无菌甘油洗涤，最后加入10ml预冷的10%的甘油，重悬菌体后，分装置-80℃冻存备用。
s2.培养所述重组耻垢分枝杆菌：
取阳性质粒加入200µl的耻垢分枝杆菌mc2155电转感受态细胞中，冰上孵育8～12min，然后转入2mmbtx电转杯中，擦净电转杯外壁上的水，然后使用btxecm630电转化仪电击，电击参数是：电压2.5kv，电阻1000ω，电容25µf。电击完后，立即加入1ml7h9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜后取适量培养液涂布7h10固体平板（含40～60μg/ml硫酸卡那霉素），平板置37℃培养箱培养3～5天。
s3.收集纯化培养液中的烟酸：
挑取平板上长出来的单克隆子，接种到7h9液体培养基中培养2～3天至对数生长期，离心收集菌体并用无菌水洗涤，菌体再次用无菌水重悬后，沸水煮10～20分钟，然后14000～16000rpm离心15分钟后取上清作为pcr的dna模板，pcr使用引物对为：5'-gtggcagcgaggacaacttg-3'，5'-gatgcctggcagtcgatcgtac-3'，pcr验证质粒转入耻垢分枝杆菌中。
所述方法构建的产烟酸的重组耻垢分枝杆菌，也属于本发明的保护范围。
所述产烟酸的重组耻垢分枝杆菌在生产烟酸中的应用，也属于本发明的保护范围。
一种生产烟酸的方法，包括以下步骤，
s1.制备所述的重组耻垢分枝杆菌；
s2.培养所述重组耻垢分枝杆菌；
s3.收集纯化培养液中的烟酸。
优选地，所述步骤s2中，使用7h9液体培养基进行培养。
优选地，所述步骤s3中，收集培养液中的烟酸的具体做法为：使用无菌滤器过滤培养液并收集滤液，用超滤浓缩管去除滤液中的蛋白质及其他大分子物质并收集滤液，进行高效液相色谱分析，分离烟酸。
优选地，高效液相色谱分析的参数为，色谱柱：thermofisher，hypersilgoldaq，150×4.6mm，3μm；柱温：30℃；流动相：水相为含0.1%甲酸的去离子水，有机相为甲醇；梯度洗脱：0min时，95%水相+5%有机相，30min时，5%水相+95%有机相；流速：0.3ml/min；进样量：10μl；波长：284nm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
通过本发明制备得到的工程菌可以一步直接获得烟酸，而不依赖于添加3-氰基吡啶，不仅避免了现有在烟酸化学合成过程中的各种缺点，而且生产条件简单，无污染，简便易行，易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用。
附图说明
图1为pmv361-nudcms质粒经ecorⅰ和hindⅲ限制性内切酶酶切后核酸凝胶电泳，m：dnamarker；1～3：阳性质粒。
图2为pmv361-nudcms质粒示意图
图3为pcr扩增产物核酸凝胶电泳；m：dnamarker；1～3：阳性克隆子。
图4为对照菌株和过表达菌株培养液滤液及烟酸标准品经hplc分离色谱图；a：对照菌株耻垢分枝杆菌mc2155培养液滤液；b：过表达nudc基因的耻垢分枝杆菌mc2155-pmv361-nudcms培养液滤液；c：烟酸标准品。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1nudc基因的扩增及构建质粒pmv361-nudcms
1、nudc基因的扩增
以耻垢分枝杆菌mc2155基因组dna为模板，使用引物对5'-atcggaattcatgagcgaacaccgcacgt-3'/5'-tgcaaagctttcagtcgagtgcggcccagg-3'，pcr扩增nudc基因orf序列。pcr产物经核酸凝胶电泳分离目的dna片段，使用omega公司胶回试剂盒回收目的dna片段，经过测序后得到nudc基因orf序列如seqidno：1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno：2。回收后的dna均使用ecorⅰ和hindⅲ限制性内切酶酶切并通过omega公司cycle-pure回收试剂盒回收酶切后的dna备用。
2、酶切
lb培养含pmv361质粒的大肠杆菌dh5α菌株，使用omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的pmv361质粒使用ecorⅰ和hindⅲ限制性内切酶酶切后进行核酸凝胶电泳并使用omega公司胶回收试剂盒回收线性化的质粒。
3、连接
酶切回收的dna片段和经同样酶切回收的线性化质粒pmv361经t4dna连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂布lb固体平板（含100μg/ml硫酸卡那霉素），平板放置37℃恒温培养箱培养过夜。
4、阳性质粒的筛选
挑取平板上长出的单克隆菌落接种lb液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。然后使用omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使用ecorⅰ和hindⅲ限制性内切酶酶切后经核酸凝胶电泳检测验证，nudc基因orf序列连接到pmv361载体上（如图1）。同时验证正确的质粒pmv361-nudcms经擎科公司测序验证序列无突变。构建成功的pmv361-nudcms质粒图谱示意图如图2。
实施例2构建nudc过表达耻垢分枝杆菌菌株
1、制备耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞
制备耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞，挑取新鲜的耻垢分枝杆菌mc2155单菌落接种于5ml7h9液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至对数生长期(od0.5～1.0)；培养物以1:100的比例接种于新鲜的100ml7h9液体培养基中，37℃过夜培养至od600到0.6左右，于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用预冷的10%无菌甘油至少洗涤两次，最后加入10ml（适量）预冷的10%的甘油，吹匀菌体后，分装置-80℃冻存备用。
2、转化耻垢分枝杆菌mc2155
取构建正确的阳性质粒pmv361-nudcmsdna加入200µl的耻垢分枝杆菌mc2155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后转入2mmbtx电转杯中，擦净电转杯外壁上的水，然后使用btxecm630电转化仪电击，电击参数是：电压2.5kv,电阻1000ω，电容25µf。电击完后，立即加入1ml7h9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜后取适量培养液涂布7h10固体平板（含50μg/ml硫酸卡那霉素），平板置37℃培养箱培养3～5天。
3、筛选阳性重组菌
挑取平板上长出来的单克隆子，接种到5ml7h9液体培养基中培养2-3天至对数生长期，离心收集菌体并使用微生物基因组提取试剂盒（omega）提取基因组dna，使用引物对5'-gtggcagcgaggacaacttg-3'，5'-gatgcctggcagtcgatcgtac-3'，以提取的基因组dna为模板，pcr验证pmv361-nudcms质粒转入耻垢分枝杆菌中（pcr结果如图3）。将验证正确的nudcms过表达的菌株命名为耻垢分枝杆菌mc2155-pmv361-nudcms。
实施例3耻垢分枝杆菌mc2155-pmv361-nudcms分泌烟酸
1、耻垢分枝杆菌mc2155-pmv361-nudcms接种7h9液体培养基，37℃培养至对数生长期后，使用millipore0.22μm无菌滤器过滤培养液并收集过滤的滤液，然后使用millipore3-kda超滤浓缩管去除滤液中的蛋白质等大分子并收集过滤后滤液。获取的滤液使用高效液相色谱仪（hplc）分离并分析烟酸。
hplc具体的条件：
设备型号：thermofisherscientificultimate3000ultrahigh-performanceliquidchromatography
色谱柱：thermofisher，hypersilgoldaq，150×4.6mm，3μm，柱温：30℃；
流动相：水相：去离子水（含0.1%甲酸）；
有机相：甲醇；
梯度洗脱：0min时，95%水相+5%有机相；
30min时，5%水相+95%有机相；
流速：0.3ml/min；
进样量：10μl；
波长：284nm。
2、hplc结果显示，耻垢分枝杆菌mc2155-pmv361-nudcms培养液中含有烟酸（如图4）。
序列表
<110>上海晶诺生物科技有限公司
<120>一种产烟酸的整合型重组耻垢分枝杆菌及其构建方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>936
<212>dna
<213>耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)
<400>1
atgagcgaacaccgcacgttcgggctccgtaacgtcccgctgctgtcccgggtcggcgcc60
gatcgcgccgataccttgcgcaccgacgtcgacgccgccctggcgggctggcccgacgcg120
ctggtgctacgcgtggaccgccgcaaccaggtgctcatcgccaacggtcaggtggtgctc180
ggtgaggccggcgcactcggagaccggccgcccgagcacgcggtgttcctgggacgtctg240
caggacggcaggcacgtatggggtatccgggcggatctggaggcgcccgaggatgccgac300
ctggggaccgaggtgctcgacctgcgccgggccgggcagatcttcgacgacaccagcgcc360
cagttggtggcgaccgccacggcgctgctcaactggcatgacaacgcgcggcacagcgcg420
atcgacggggcgccgacccggcccgccaagggcggctggtcgcgcgtcaacccgctgacc480
ggccacgaggagttcccgcggatcgaccccgccatcatctgcctggtgcacgacgggcat540
gaccgggcggtgctggcccgtcagacgctgtggccggagcggttgttctcgatcctggcc600
ggcttcgtcgaggccggcgagtcgttcgagacatgcgtgcagcgcgagatcgccgaggag660
atcgggctcacggtcaccgacgtgcagtacctcggcagtcagccgtggccgttcccgcgc720
tcgctcatggtgggattccacgcgatcggcgacccggagcagccgttctcctacaacgac780
ggcgagatcgccgaggccgcgtggttcacccgcgatgagatccgcgcggcactcgatcag840
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<210>2
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<212>prt
<213>耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)
<400>2
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