本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体的说是涉及一种用于肺癌egfr基因t790m位点检测的mgb引物和探针序列。
背景技术：
：taqman探针法是高度特异的定量pcr技术，核心是利用taq酶的3′→5′外切核酸酶活性切断探针产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在taqman探针法的定量pcr反应体系中，包括一对pcr引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(reporter,r)如fam、vic等，3′端标记有荧光淬灭基团(quencher,q)，如tamra等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着pcr的进行，taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以每经过一个pcr循环，荧光信号也和目的片段一样有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板dna的拷贝数。taqman探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的taqman探针和taqmanmgb探针。mgb探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(non-fluorescentquencher)本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有mgb(minorgroovebinder)修饰基团，可以将探针的tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的tm值mgb探针可以比普通taqman探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的dna碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。每个肺癌病人产生耐药性的原因各不相同，但超过60％患者出现的是t790m突变。所谓的t790m其实还是egfr基因上的一个位点，一代tki治疗后这个基因的第790号“守门员”的氨基酸由t突变成了m。这一改变影响了第一代tki与egfr的结合，导致第一代tki失去治疗作用，肿瘤重新开始生长。定期复查中医生发现肿瘤进展了，患者对一代tki产生耐药性。这个时候就需要重新进行二次t790m的检测。跟初次检测相比，耐药后组织检测仍然是普遍的选择。对于取不到病理组织但有胸水等细胞学样本(包括痰液及支气管刷片)的患者，可以取胸水等细胞学样本进行t790m检测；若胸水也没有的患者，血液基因检测也是检测t790m突变的良好选择。技术实现要素：本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种用于肺癌egfr基因t790m位点检测的mgb引物和探针序列，基于mgb的特异性特点，进行egfr检测明确基因是否发生突变，从而在医生指导下选择相应的靶向治疗方案。本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于肺癌egfr基因t790m位点检测的mgb引物和探针序列，引物序列由序列为atctgcctcacctccaccgt的上游引物t790m-f和序列为gcaggtactgggagccaata的下游引物t790m-r组成引物对，肺癌egfr基因t790m位点探针的碱基序列由cagctcatcatgcagctcatgcc的突变型t790m-pt组成。本发明中的序列属于带有荧光修饰的核苷酸序列，单链链型，线性拓扑结构。分子类型为dna；假设：否；反义：否；最初来源：人工设计。用于肺癌egfr基因t790m位点检测的mgb引物和探针序列能够特异快捷的检测到被检测血样是否存在肺癌egfr基因t790m位点突变。用于肺癌egfr基因t790m位点检测的mgb引物和探针序列是基于肺癌egfr基因的保守序列筛选设计，是肺癌egfr基因t790m位点特异序列。本发明的具体原理是：利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一对特异性荧光探针，采用耐热dna聚合酶(taq酶)、四种核苷酸单体(dntp)等成分，并应用pcr技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(r)和荧光淬灭基团(q)的寡核苷酸。在探针完整时，报名.基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在pcr扩增过程中，taq酶的5'端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。本发明的有益效果是：本发明提供的引物和探针的检测灵敏度对含有目的亚型样品可达1000个拷贝，说明其具有良好的灵敏度。本发明提供的引物和探针对于不含有目的亚型的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。由于本发明采用荧光pcr技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如pcr—电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对pcr产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。本发明设计得到的mgb探针引物能够通过血液特异检测肺癌egfr基因t790m位点，进行egfr检测明确基因是否发生突变，从而在医生指导下选择相应的靶向治疗方案。具体实施方式以下结合具体实施方式对本发明作详细描述。一种用于肺癌egfr基因t790m位点检测的mgb引物和探针序列，引物序列由序列为atctgcctcacctccaccgt的上游引物t790m-f和序列为gcaggtactgggagccaata的下游引物t790m-r组成引物对，肺癌egfr基因t790m位点探针的碱基序列由cagctcatcatgcagctcatgcc的突变型t790m-pt组成。本发明用于肺癌egfr基因t790m位点检测的mgb引物和探针序列能够特异快捷的检测到被检测血样是否存在肺癌egfr基因t790m位点突变，mgb引物和探针序列是基于肺癌egfr基因的保守序列筛选设计，是肺癌egfr基因t790m位点特异序列。1、引物和探针设计：通过对所有己知的玉米谷氨酸亚胺甲基转移酶1基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：上游引物t790m-f：atctgcctcacctccaccgt；下游引物t790m-r：gcaggtactgggagccaata；探针t790m-pt：cagctcatcatgcagctcatgcc。2、反应体系的建立和优化：试剂盒采用天根生化科技(北京)有限公司的相应试剂盒；反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板均通过已知序列合成构建全基因质粒的方法获得，由百力格生物技术有限公司合成构建，并对实验模板进行102～105质粒拷贝数的稀释梯度实验，最终选取103拷贝数做模板浓度。2.1：引物浓度的优化在反应体系中，将引物浓度分别从0.1pmol/l至0.8pmol/l作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.3pmol/l。2.2：探针浓度的优化在反应体系中，将探针浓度分别从0.05mol/l至0.5mol/l作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2mol/l。利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光pcr反应体系为20ul体系，所需各组分及相应浓度见表1：表1优化后的pcr反应体系组分终浓度2×pcrmix1x引物(上游)0.3pmol/l引物(下游)0.3pmol/l探针mix0.2mol/l模板103copies补水至20ul注：在荧光pcr反应体积不同时，各试剂应按比例调整；使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。2.3：仪器检测通道的选择：在进行荧光pcr反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。2.4：pcr条件选择如下：95℃，5min,1个循环；95℃，10s，60℃，1min，40个循环。3、检测步骤：1)选取引物和探针：均由百力格生物技术有限公司合成；2)制备待测模板：由百力格生物技术有限公司合成构建质粒标准品；3)反应体系的建立：试剂盒采用天根生化科技(北京)有限公司的相应试剂盒；4)选择仪器的检测通道；5)上机检测。最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12