本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种扁蓿豆ssr标记的检测引物组、试剂盒及其应用和扁蓿豆自交亲和基因型的筛选方法。
背景技术：
扁蓿豆是一种多年生豆科牧草，在我国北方地区多有分布。它抗寒、耐旱、适应性强，是一种不可多得的重要基因资源。研究、改造、利用扁蓿豆，对提高草原生产能力，促进畜牧业发展，有着现实的生产意义。
扁蓿豆是多年生异花授粉植物。目前，扁蓿豆品种的选育常采用轮回选育的方法。杂交育种与轮回选择育种相比，具有目的性状聚合快、育种周期短等优点。在扁蓿豆育种中，缺乏自交系和细胞质雄性不育系，限制了其利用杂交育种方法改良目的性状。
随着生物技术的发展，分子标记广泛应用于分子育种和遗传分析，但是目前尚未有利用分子育种的方法筛选具有亲和自交基因型的扁蓿豆单株母本的方法。
因此，目前需要一种利用分子育种有效筛选扁蓿豆自交亲和基因型的方法。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种扁蓿豆ssr标记的检测引物组，缓解了现有技术中缺少一种扩增能够筛选扁蓿豆自交亲和基因型分子标记的引物组的问题；本发明的第二目的在于提供一种包含上述检测引物组的试剂盒；缓解了现有技术中存在的缺乏一种能够检测扁蓿豆的自交亲和基因型的试剂盒的技术问题；本发明的第三目的在于提供了一种上述检测引物组和上述试剂盒在筛选扁蓿豆自交亲和基因型中的应用，可广泛应用于扁蓿豆自交亲和基因型、自交子代和杂交子代的筛选；本发明的第四目的在于提供一种扁蓿豆自交亲和基因型的筛选方法，缓解了现有技术中存在的缺乏一种能够有效筛选扁蓿豆自交亲和基因型的方法的问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
一种扁蓿豆ssr标记的检测引物组，所述检测引物组包含如下引物对中至少两组引物对：
引物对mre-ssr190：包含mre-ssr190-f和mre-ssr190-r，其中mre-ssr190-f具有如seqidno.1所示序列，mre-ssr190-r具有如seqidno.2所示序列；
引物对mre-ssr-578：包含mre-ssr-578-f和mre-ssr-578-r，其中mre-ssr-578-f具有如seqidno.3所示序列，mre-ssr-578-r具有如seqidno.4所示序列；
引物对mre-ssr137：包含mre-ssr137-f和mre-ssr137-r，其中mre-ssr137-f具有如seqidno.5所示序列，mre-ssr137-r具有如seqidno.6所示序列；
引物对mre-ssr492：包含mre-ssr492-f和mre-ssr492-r，其中mre-ssr492-f具有如seqidno.7所示序列，mre-ssr492-r具有如seqidno.8所示序列；
引物对mre-ssr-669：包含mre-ssr-669-f和mre-ssr-669-r，其中mre-ssr-669-f具有如seqidno.9所示序列，mre-ssr-669-r具有如seqidno.10所示序列；
引物对mre-ssr200：包含mre-ssr200-f和mre-ssr200-r，其中mre-ssr200-f具有如seqidno.11所示序列，mre-ssr200-r具有如seqidno.12所示序列；
引物对mre-ssr-534：包含mre-ssr-534-f和mre-ssr-534-r，其中mre-ssr-534-f具有如seqidno.13所示序列，mre-ssr-534-r具有如seqidno.14所示序列；
引物对mre-ssr-650：包含mre-ssr-650-f和mre-ssr-650-r，其中mre-ssr-650-f具有如seqidno.15所示序列，mre-ssr-650-r具有如seqidno.16所示序列；
引物对mre-ssr-676：包含mre-ssr-676-f和mre-ssr-676-r，其中mre-ssr-676-f具有如seqidno.17所示序列，mre-ssr-676-r具有如seqidno.18所示序列；
引物对mre-ssr143：包含mre-ssr143-f和mre-ssr143-r，其中mre-ssr143-f具有如seqidno.19所示序列，mre-ssr143-r具有如seqidno.20所示序列；
引物对mre-ssr140：包含mre-ssr140-f和mre-ssr140-r，其中mre-ssr140-f具有如seqidno.21所示序列，mre-ssr140-r具有如seqidno.22所示序列；
引物对mre-ssr-614：包含mre-ssr-614-f和mre-ssr-614-r，其中mre-ssr-614-f具有如seqidno.23所示序列，mre-ssr-614-r具有如seqidno.24所示序列；
引物对mre-ssr256：包含mre-ssr256-f和mre-ssr256-r，其中mre-ssr256-f具有如seqidno.25所示序列，mre-ssr256-r具有如seqidno.26所示序列；
引物对mre-ssr101：包含mre-ssr101-f和mre-ssr101-r，其中mre-ssr101-f具有如seqidno.27所示序列，mre-ssr101-r具有如seqidno.28所示序列；
引物对mre-ssr539：包含mre-ssr539-f和mre-ssr539-r，其中mre-ssr539-f具有如seqidno.29所示序列，mre-ssr539-r具有如seqidno.30所示序列；
引物对mre-ssr727：包含mre-ssr727-f和mre-ssr727-r，其中mre-ssr727-f具有如seqidno.31所示序列，mre-ssr727-r具有如seqidno.32所示序列。
一种扁蓿豆ssr标记检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述检测引物组。
一种上述检测引物组或上述试剂盒在筛选扁蓿豆自交亲和基因型中的应用。
一种扁蓿豆的自交亲和基因型的筛选方法，所述筛选方法包括扩增扁蓿豆单株母本和所述扁蓿豆单株母本的子代的dna，通过比较扩增产物电泳后谱带的带型得到所述扁蓿豆单株母本的子代的类型的分布，筛选出所述自交亲和基因型；
所述扩增为使用上述检测引物组或者上述试剂盒扩增所述扁蓿豆单株母本与所述扁蓿豆单株母本的子代的dna。
进一步的，扩增所述扁蓿豆单株母本的子代的数量为25-30个。
进一步的，所述子代的类型包括杂交子代和自交子代。
进一步的，在至少任意六组引物对的扩增产物中，所述自交子代的谱带的带型与母本的谱带的带型完全相同；或，
母本的谱带包含两条带，所述自交子代的谱带中的一条带与母本的谱带中的一条带相同。
进一步的，在至少任意两组引物对的扩增产物中，所述杂交子代的谱带中有一条带与母本的谱带中的一条带相同，另一条带与母本的任何一条带均不相同。
进一步的，所述扩增包括多重pcr扩增，所述多重pcr扩增的反应至少包括两组引物对；
优选地，引物对mre-ssr190和引物对mre-ssr-578在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr137和引物对mre-ssr492在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr-669和引物对mre-ssr200在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr-534和引物对mre-ssr-650在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr-676和引物对mre-ssr143在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr140和引物对mre-ssr-614在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr256和引物对mre-ssr101在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr-539和引物对mre-ssr-727在同一pcr体系内进行多重pcr扩增。
进一步的，所述电泳为5％-10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，优选为6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的扁蓿豆ssr标记检测引物组，能够分别特异性的扩增扁蓿豆的ssr标记，使用该检测引物组分别扩增母本和该母本子代的ssr标记可以比较子代与母本的ssr标记谱带的异同，从而判断该子代为杂交子代或者自交子代。本发明提供的包含上述检测引物组的试剂盒具有使用便捷快速的优点，通过使用试剂盒中包含的上述检测引物组通过pcr扩增样品dna，即可检测样品的ssr标记。本发明提供的上述检测引物组和包含上述检测引物组的试剂盒应用广泛，可用来筛选自交亲和基因型的扁蓿豆母本，也可以用来筛选扁蓿豆的自交子代或者杂交子代。
本发明提供了筛选扁蓿豆自交亲和基因型的分子标记方法。包括使用上述检测引物组或试剂盒扩增扁蓿豆单株母本和所述扁蓿豆单株母本的子代的dna，通过比较扩增产物电泳后谱带的带型得到所述扁蓿豆单株母本的子代的类型的分布，筛选出所述自交亲和基因型。通过对大量扁蓿豆材料的筛选，可发掘自交率高的基因型。本发明提供的方法用于扁蓿豆自交亲和基因型的筛选，可提高自交亲和基因型筛选准确性和效率，为培育扁蓿豆自交系奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的扁蓿豆母本和子代的dna扩增产物电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种扁蓿豆ssr标记的检测引物组，所述检测引物组包含下表中至少两组引物对：
ssr(simplesequencerepeat)，又称微卫星dna(microsatellite)，是一种2-5个核苷酸为重复单位组成的几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于整个真核生物基因组的不同座位上，每个座位重复单位的数量可能不完全相同，因而形成多态性，即ssr分子标记。由于ssr标记两端多为相对保守的单拷贝序列，可以通过设计特异性引物进行pcr扩增，通常表现为共显性。
本发明提供的扁蓿豆ssr标记的检测引物组，能够特异性的扩增扁蓿豆的ssr标记，使用该检测引物组分别扩增母本和该母本子代的ssr标记可以比较子代与母本的ssr标记的异同，从而判断该子代为杂交子代或者自交子代。
本发明还提供了一种扁蓿豆ssr标记检测的试剂盒，该试剂盒包含上述检测引物组。本发明提供的包含上述检测引物组的试剂盒具有使用便捷快速的优点，通过使用试剂盒中包含的上述检测引物组通过pcr扩增样品dna，即可检测样品的ssr标记。在一些可选的实施方式中，该试剂盒包含上述检测引物组的冻干粉，或者是溶解于任何分子生物学试验中可接受的缓冲液中；在一些可选的实施方式中，上述试剂盒包括预混的多组引物对，以应用于多重pcr；可选地，该试剂盒中还可以包括一些分子生物学实验中可接受的试剂，例如可以为但不限于为pcr缓冲液、dntp、镁离子、或者用于q-pcr的荧光染料。
本发明还提供了一种上述检测引物组和上述试剂盒在筛选扁蓿豆自交亲和基因型中的应用。可用来筛选自交亲和基因型的扁蓿豆母本，也可以用来筛选扁蓿豆的自交子代或者杂交子代。
本发明还提供了一种扁蓿豆自交亲和基因型的筛选方法，所述筛选方法包括扩增扁蓿豆单株母本和所述扁蓿豆单株母本的子代的dna，通过比较扩增产物电泳后谱带的带型得到所述扁蓿豆单株母本的子代的类型的分布，筛选出所述自交亲和基因型；
其中，使用上述检测引物组或者试剂盒扩增扁蓿豆单株母本和该扁蓿豆单株母本的子代的dna。
本发明提供的方法用于扁蓿豆自交亲和基因型的筛选，可提高自交亲和基因型筛选准确性和效率，为培育扁蓿豆自交系奠定基础。
在本发明的一些可选的实施方式中，扩增所述扁蓿豆单株母本的子代的数量为25-30个。在实施上述筛选方法时，每个扁蓿豆单株母本可选择该单株母本25-30个子代进行检测，子代样品量过少会降低筛选的准确率，过多会增加筛选的工作量，因此子代数量以25-30个为宜。
在本发明的一些可选的实施方式中，所述子代的类型包括杂交子代和自交子代。可选地，在实施上述筛选方法时，可以通过挑选出一个扁蓿豆单株母本的所有的自交子代，根据自交子代在全部子代的中的数量比判断该扁蓿豆单株母本是否是自交亲和基因型；也可以通过挑选出一个扁蓿豆单株母本的所有的杂交子代，根据杂交子代在全部子代的中的数量比判断该扁蓿豆单株母本是否是自交亲和基因型。
在本发明的一些可选地实施方式中，可是使用自交率判断扁蓿豆单株母本是否为自交亲和基因型，可选地，上述自交率通过公式(a)或公式(b)计算得到：
公式(a)：自交率＝自交子代的数量/子代总数量×100％；
公式(b)：自交率＝(子代总数量-杂交子代的数量)/子代总数量×100％。
在实际筛选的过程中，根据育种的目的和实际生产的需要，划分自交亲和基因型的自交率范围。
检测引物组位于ssr标记两端的保守区，ssr标记中的重复单元为可变区，因此，使用一组引物组扩增母本及其子代的同一个ssr标记时，由于可变区中重复单元的数量不同，导致扩增产物的长度出现差异，因此比较母本和子代中同一个ssr标记的扩增产物的差异可以判断出该子代是自交子代或者是杂交子代。
在一个可选地实施方式中，在至少任意六组引物对的扩增产物中，所述自交子代的谱带的带型与母本的谱带的带型完全相同，或，母本的谱带包含两条带，所述自交子代的谱带中的一条带与母本的谱带中的一条带相同。
在一个可选的实施方式中，在至少任意两组引物对的扩增产物中，所述杂交子代的谱带中有一条带与母本的谱带中的一条带相同，另一条带与母本的任何一条带均不相同。
在本发明的一些可选地实施方式中，所述扩增使用多重pcr的方法扩增，其中所述多重pcr扩增的反应至少包括两组引物对。使用多重pcr，可以降低筛选工作量，提高筛选效率。
优选地，引物对mre-ssr190和引物对mre-ssr-578在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr137和引物对mre-ssr492在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr-669和引物对mre-ssr200在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr-534和引物对mre-ssr-650在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr-676和引物对mre-ssr143在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr140和引物对mre-ssr-614在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr256和引物对mre-ssr101在同一pcr体系内进行多重pcr扩增；
优选地，引物对mre-ssr-539和引物对mre-ssr-727在同一pcr体系内进行多重pcr扩增。
通过优化多重pcr的因无选择可以提高pcr的反应效率，从而提高整个筛选方法的效率。
在一些可选的实施方式中，扩增产物可以使用高浓度琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，优选为5％-10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，优选6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过优化凝胶浓度使电泳后条带更清晰，有利于母本和子代的对比和筛选。
下面结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
利用ssr标记检测引物组，对扁蓿豆单株母本，编号m1及其子代(p1～p25)进行自交率检测。多重pcr扩增扁蓿豆母本和子代的dna，使用12组引物对进行多重pcr扩增扁蓿豆母本和子代的dna。
其中，引物对mre-ssr190和引物对mre-ssr-578，引物对mre-ssr137和引物对mre-ssr492，引物对mre-ssr-669和引物对mre-ssr200，引物对mre-ssr-534和引物对mre-ssr-650，引物对mre-ssr-676和引物对mre-ssr143，引物对mre-ssr140和引物对mre-ssr-614分别在同一pcr体系内进行多重pcr扩增。
试验方法如下：
dna提取：取扁蓿豆单株母本及子代(20-50个)，使用新型植物基因组提取试剂盒(dp320，天根生化科技(北京)公司)提取dna，对dna质量、浓度进行检测，合格的dna样品稀释为10ng/μl。
pcr反应体系：5μlpcrsupermix(as112-3，北京全式金生物技术有限公司)，引物各0.4μl，1μl模板dna，2.4μlddh2o。
pcr反应程序：预变性95℃5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；延伸72℃10min。
电泳、显色：6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，拍照。
引物对mre-ssr190和引物对mre-ssr-578的电泳结果如图1所示：在图中m表示母本、p表示子代、杂交子代用星号标出。
自交率为按照自交率＝自交子代的数量/子代总数量×100％计算得到，结果如表1所示，√表示在该位点为表现为杂交性状，扁蓿豆单株母m2自交率为28％，为非亲和自交基因型的扁蓿豆母本。
表1扁蓿豆单株母m1子代的类型分布
上表中引物对1-16依次为mre-ssr190、mre-ssr-578、mre-ssr137、mre-ssr492、mre-ssr-669、mre-ssr200、mre-ssr-534、mre-ssr-650、mre-ssr-676、mre-ssr143、mre-ssr140和mre-ssr-614。
实施例2
利用ssr标记检测引物组，对扁蓿豆单株母本，编号m2及其子代(p1～p30)进行自交率检测。多重pcr扩增扁蓿豆母本和子代的dna，使用16组引物对进行多重pcr扩增扁蓿豆母本和子代的dna。
其中，引物对mre-ssr190和引物对mre-ssr-578，引物对mre-ssr137和引物对mre-ssr492，引物对mre-ssr-669和引物对mre-ssr200，引物对mre-ssr-534和引物对mre-ssr-650，引物对mre-ssr-676和引物对mre-ssr143，引物对mre-ssr140和引物对mre-ssr-614，引物对mre-ssr256和引物对mre-ssr101，引物对mre-ssr-539和引物对mre-ssr-727分别在同一pcr体系内进行多重pcr扩增。
试验方法同实施例2，结果如表2所示，√表示在该位点为表现为杂交性状，扁蓿豆单株母m2自交率为73％，为亲和自交基因型的扁蓿豆母本。
表2扁蓿豆单株母m2子代的类型分布
上表中引物对1-16依次为mre-ssr190、mre-ssr-578、mre-ssr137、mre-ssr492、mre-ssr-669、mre-ssr200、mre-ssr-534、mre-ssr-650、mre-ssr-676、mre-ssr143、mre-ssr140、mre-ssr-614、mre-ssr256、mre-ssr101、mre-ssr-539和mre-ssr-727。
实施例3
随机选择10株扁蓿豆单株母本(m3-m12)，每株扁蓿豆单株母本随机选择其25株子代，分别使用本发明提供的16组引物对，按照实施例3提供的试验方法筛选自交亲和基因型，以自交率≥50％的扁蓿豆单株母本为自交亲和基因型单株母本，其中，母本m7、m10、m11和m12为自交亲和基因型的扁蓿豆单株母本，试验结果如下表所示。
表3自交亲和基因型扁蓿豆单株母本的筛选结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
sequencelisting
<110>中国农业科学院草原研究所
<120>扁蓿豆ssr标记的检测引物组、试剂盒及其应用和扁蓿豆自交亲和基因型的
筛选方法
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