本发明涉及生物技术领域。鉴于alpha菌毛仅存在于致仔猪腹泻大肠杆菌及其他一些致病性大肠杆菌基因组中，因此可作为分子标记，利用其基因片段中的保守序列设计一对特异性的引物，通过常规pcr扩增特征性基因片段进行检测。
背景技术：
仔猪腹泻是生猪生产中最常发的疾病，可以导致仔猪日增重减少，脱水甚至死亡，给生猪养殖业带来严重的经济损失。除了由猪传染病胃肠炎病毒(tgev)，猪流行性腹泻病毒(pedv)和猪轮状病毒(rdv)等病毒引起的仔猪腹泻外，产肠毒素大肠杆菌(etec)，沙门菌，魏氏梭菌等细菌也是引起仔猪腹泻的最常见的病原体，。其中etec根据其表达的菌毛类型可以进一步分类为k88+，f18+，987p+，f41+，k99+等不同血清型。目前临床上对猪场新发仔猪腹泻疾病的诊断主要是：(方法1)通过不同病原体的常规分离鉴定和进一步对利用单因子抗血清进行分离菌的玻板或者试管凝集实验以确认阳性。因此，在确定细菌病原引发的腹泻时，需要使用不同大肠杆菌k88，k99，f18，987p，f41菌毛的单因子抗血清，不同沙门菌单因子抗血清，以及魏氏梭菌鉴定方法分别进行检测，直到获得阳性反应结果，成本较高；(方法2)通过实验室对肠道、粪便样品进行划线分离、培养等常规分离鉴定，在进一步通过生化试验确定菌属后(通常培养需要一天)，再通过血清凝集或者针对不同抗原血清型的特异性引物进行pcr以确定具体病原菌血清型，过程繁琐，耗时耗力。值得注意的是，许多标准株和绝大多数临床分离株都需要筛选特殊的培养基，并且在适宜的环境下(如温度、ph值等)进行实验室的连续培养传代，其用于血清学检查的外膜抗原表达需较为充分，由于未经上述方法处理的菌株其粘附素在体外培养条件下不能达到一定程度的表达，因而采用单因子血清进行玻板或试管凝集试验检测时，往往不能产生肉眼可见的凝集反应，这就导致基于菌毛检测的玻板或试管凝集试验的应用性受到很大程度的限制。
alpha菌毛一般又称为5类菌毛或者称类定植因子抗原i(cfa/i-like)家族。在人源etec上，定植因子(cfs)是非常重要的黏附素，并且至今至少发现了25种不同的cf。其中cfa/i，cs4，cs14，cs1，cs17和cs19的抗原决定簇同源性很高。cfa/i是研究最为透彻的cf之一：该菌毛由大约1000个主要亚单位cfab组成，顶端装配一个拷贝的黏附素蛋白cfae；其装配由伴侣蛋白cfaa和前导蛋白cfac共同协助完成。alpha菌毛的构成与之类似，由操纵子cblabcd转录的四个亚单位组成：cbla和cblc分别是是伴侣蛋白和前导蛋白，cblb是菌毛的主要亚单位，cbld是顶端黏附素。genbank中现有的alpha菌毛序列数据全部来源于全基因组测序(例如登录号cp025036.1，通过搜索基因cbla或cblb或cblc或cbld可以找到该序列，注释为全基因组软件自动注释)。但是关于大肠杆菌alpha菌毛具体功能描述的文献还未有发表。对于该菌毛的表述仅能从关于洋葱伯克氏菌同源菌毛的文章(umadevis.sajjan,hongxie,matthewd.lefebre,miguela.valvanoandjanetf.forstner.identificationandmolecularanalysisofcablepilusbiosynthesisgenesinburkholderiacepacia.microbiology(2003),149,961–971)中得到部分信息。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供alpha菌毛基因在仔猪腹泻致病性大肠杆菌监测、鉴别中的应用，并提供一种快速、简便、特异性强、适合临床使用的特异性检测试剂盒，利用pcr反应快速鉴别环境样本中是否包含致仔猪腹泻的产肠毒素大肠杆菌或其他一些致病型大肠杆菌，为猪场养殖过程中监测和有效预防致仔猪腹泻的产肠毒素大肠杆菌或其他一些致病型大肠杆菌发生提供技术支持。
本发明的技术方案：从已知的基因序列信息和比较分析表明，大肠杆菌alpha菌毛普遍存在于致仔猪腹泻的产肠毒素大肠杆菌及其他致病型大肠杆菌菌株中，并且该菌毛操纵子cbl序列相对保守，尤其是长约500bp的主要亚单位基因cblb序列。
鉴于cbl操纵子的以上特征，根据其中alpha菌毛主要亚单位基因cblb序列设计上下游引物。以各种饲料、饮水(或污水)、扬尘和粪便等待检样品制备dna模板进行pcr检测，当模板能扩增出预期为500bp大小的条带时，说明该待检菌株为致仔猪腹泻的产肠毒素大肠杆菌或其他致病型大肠杆菌；当模板不能扩增相应条带，则该待检菌株不是致仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌或其他致病型大肠杆菌。
本发明公开了alpha菌毛基因作为监测、鉴别仔猪腹泻致病性大肠杆菌的分子标记的应用。
本发明还公开了用于检测仔猪腹泻致病性大肠杆菌的特异性引物，序列如下：
af-cblb-f:atgaaaaaggtatttgcaaaatctc(seqidno.1)
af-cblb-r:ttagatatcctgagacagat(seqidno.2)。
进一步地，本发明提供了一种用于检测仔猪腹泻致病性产肠毒素大肠杆菌的试剂盒，包括：
pcr缓冲液、dntps、dna聚合酶、阳性对照dna模板和上述特异性引物。
本发明中所述的alpha菌毛基因如seqidno.3所示。其主要亚单位基因cblb序列如seqidno.4所示。
本发明的优点在于：
1.用于检测、监测临床样品中致仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌或其他致病型大肠杆菌，已通过多株致病性大肠杆菌pcr检测验证，该pcr检测方法得出的结果准确无误，且没有假阳性和相互交叉反应的发生。
2.该检测方法所需的试剂及设备成本较低，设计合成的检测引物-20℃可以长期保存，能多次使用。
3.该方法可以用于临床监测和鉴别致仔猪腹泻大肠杆菌产肠毒素大肠杆菌或其他致病型大肠杆菌，使用饲料、饮水(或污水)、扬尘和粪便等环境样品可直接制样扩增，免去分离培养细菌过程，快速简便。
附图说明
图1致仔猪腹泻大肠杆菌的特异性快速检测电泳图。其中：
m为trans2kplusiidnamarker分子标记，泳道1为987p野生株204，泳道2为工程菌dh5α，泳道3为k99标准株c83907，泳道4为k99野生株637，泳道5为牛源etec野生株b41，泳道6为f18ab标准株f107/86，泳道7为f18ac标准株2134p，泳道8为f18ab野生株sec470，泳道9为人源etec菌株h10407，泳道10为k88ab标准株c83901，泳道11为k88ac标准株c83902，泳道12为k88ad标准株c83903，泳道13为k88ac野生株2534-86，泳道14为k88ac野生株gt60，泳道15为k88ac野生株bd1107/7508，泳道16为k88ac野生株yz20，泳道17为k88ac野生株3030-2，泳道18为987p野生株1592，泳道19为肠炎沙门菌50336。
具体实施方式
下述实施例中所用到的生物材料信息如下：
c83901株、c83902株和c83903株分别为k88ab、k88ac和k88ad三种血清型产肠毒素大肠杆菌标准株均购自中国兽药监察所菌种保藏中心；c83907株k99血清型大肠杆菌标准株购自中国兽药监察所菌种保藏中心；f18ab血清型产肠毒素大肠杆菌标准株f107/86，k88ac血清型野外分离株3030-2，牛源f41血清型标准株b41由美国南达科达州立大学davidfrancis教授馈赠；肠炎血清型沙门菌50336由美国宾夕法尼亚大学diterschifferli教授馈赠；工程菌dh5α购自于takara公司；k88ac血清型野外分离株2534-86株，gt60株，bd1107/7508株和yz20株，f18血清型野外分离株sec470，987p血清型野外分离株204株和1592株，k99血清型野外分离株637株，均由扬州大学朱国强教授实验室分离并保存。
f18ab血清型产肠毒素大肠杆菌标准株f107/86：bertschinger,h.u.,bachman,m.,mettler,c.,pospischil,a.,schraner,e.m.,stamm,m.,sydler,t.,wild,p.,1990.adhesivefimbriaeproducedinvivobyescherichiacoli0139:k12(b):h1associatedwithenterotoxaemiainpigs.veterinarymicrobiology.25,267–281
k88ac血清型野外分离株3030-2：francis,d.h.andj.a.willgohs.1991.evaluationofaliveavirulentescherichiacolivaccinefork881,lt1enterotoxigeniccolibacillosisinweanedpigs.americanjournalofveterinaryresearch.52:1051–1055.
牛源f41血清型标准株b41：j.a.morris,*c.thorns,a.c.scott,w.j.sojka,andg.a.wells.,1982.adhesioninvitroandinvivoassociatedwithanadhesiveantigen(f41)producedbyak99mutantofthereferencestrainescherichiacolib41.infectionandimmunity.36(3),1146-1153
肠炎血清型沙门菌50336；xiameng,xianchenmeng,chunhongzhu,hengwang,jinqiuwang,jiajianie,philipr.hardwidge4&guoqiangzhu.,2013.thernachaperonehfqregulatesexpressionoffimbrial-relatedgenesandvirulenceofsalmonellaentericaserovarenteritidis.,femsmicrobiologyletters.346(2):90-6
f18血清型野外分离株sec470:hliu，lsong，ycai，ywang，lyu.,2016.draftgenomesequenceofescherichiacolistrainsec470,isolatedfromapigletexperiencingdiarrhea.genomeannouncements.4(2):e00088-16
k88ac血清型野外分离株gt60，yz20株，987p血清型野外分离株204株和1592株，张信军，胡会杰，何章科，周明旭，许绵，朱国强*.,2015.大肠埃希菌i型菌毛fima基因的克隆和序列比较分析.扬州大学学报(农业与生命科学版).36(4):13-17
k99血清型野外分离株637株:cmferreiros，mtcriado.,1983.purificationandpartialcharacterizationofak99-antigenassociatedadhesininescherichiacoli(637strain).revista
k88ac血清型野外分离株2534-86株:nmclark，emberberov，mwang，ramoxley.,2006.anti-capsularantibodiesactivatekillingofescherichiacolio8:k87bythealternatecomplementpathwayinporcineserum.veterinaryimmunology&immunopathology.114(1-2):185-191
k88ac血清型野外分离株bd1107/7508株:l.blomberg&p.l.conway.,2009.aninvitrostudyofilealcolonisationresistancetoescherichiacolistrainbd1107/7508(k88)inrelationtoindigenoussquamousgastriccolonisationinpigletsofvaryingages.microbialecologyinhealth&disease.2(4):285-291。
实施例1
本发明的pcr检测方法所用引物的核苷酸序列如下：
af-cblb-f:atgaaaaaggtatttgcaaaatctc(seqidno.1)
af-cblb-r:ttagatatcctgagacagat(seqidno.2)
本发明检测方法过程如下：
1.环境样品收集：(1)饲料：取饲料0.1g，研磨成粉末，备用；(2)饮水(或污水)：1.5ml离心管取水样1ml，10000rpm离心5分钟，去掉上清液，沉淀备用；(3)扬尘：在猪场不同位置放置经灭菌的硫酸纸一张，24h后将硫酸纸上落下的灰尘收集起来，取0.1g备用；(4)粪便：经灭菌的棉拭子取猪粪便0.1g备用。
2.制备待检样品的染色体dna模板：取上一步待检样品加入用灭菌处理后的50-100μl的超纯水悬浮于1.5ml离心管中，充分混匀后，置于100℃沸水中水浴5分钟，冷却至室温后，静止沉淀10分钟(有条件可以10000rpm离心1分钟)吸取2-3μl上清做pcr模板。
3.pcr扩增及产物检测：50μl扩增体系包含了1×pcr缓冲液，0.2mmdntp，上下游引物各1mm，5μl待检样品pcr模板以及0.5μldna聚合酶。扩增循环参数为94℃预变性4min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min。取5μlpcr产物在1.2％琼脂糖胶中以90v恒定电压电泳40min，溴乙锭eb染色，以trans2kplusiidnamarker(全式金公司)为标准分子量分析结果，待测样品如同阳性对照能扩增出预期大小为500bp左右条带的pcr产物，则被测样品含有致仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌或其他致病型大肠杆菌。
致仔猪腹泻大肠杆菌的特异性快速检测
以af-cblb-f/af-cblb-r一对上下游引物，猪产肠毒素大肠杆菌c83901，c83902，c83903，3030-2，f107/86，2143p，sec470，2534-86，gt60，bd1107/7508，yz20，c83907，637，1592和204均能扩增出约500bp大小条带，而其他血清型大肠杆菌dh5α，牛源产肠毒素大肠杆菌b41，人源产肠毒素大肠杆菌h10407和肠炎沙门菌50336均无任何条带，为阴性对照，如图1所示。
sequencelisting
<110>扬州大学
<120>alpha菌毛基因在仔猪腹泻致病性大肠杆菌监测、鉴别中的应用
<130>
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
atgaaaaaggtatttgcaaaatctc25
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
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<210>3
<211>5015
<212>dna
<213>大肠杆菌
<400>3
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<212>dna
<213>大肠杆菌
<400>4
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