本发明涉及一种玉米小斑病菌lamp检测引物及其可视化检测方法和应用，专用于玉米小斑病菌的快速可视化检测，同时可实现田间玉米小斑病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。
背景技术：
玉米是我国重要的粮食作物、经济作物，还具有能源、饲料、果蔬等多种用途，是种植面积居首位、产量居次席的农作物，需求量极大。玉米产业健康发展对改善我国农业产业结构，保障粮食安全具有十分积极的重要作用。玉米小斑病是由平脐蠕孢属玉蜀黍平脐蠕孢菌(bipolarismaydis)侵染引起的叶部真菌病害。在充足水分或者高湿条件下，玉米小斑病病情迅速扩展，在玉米孕穗期以及抽穗期遇降水多、湿度高，光照时数少的天气情况下小斑病容易大流行，己成为玉米生产的主要病害。堆放在田间的玉米秸秆，遗留的玉米病叶、玉米苞叶都是来年发病的初侵染源。越冬的病原菌在来年遇到适宜温湿度等气候条件，便产生大量的分生孢子，并且借助气流或者雨水传播到田间生长的玉米叶片上，形成病斑，之后病斑产生大量分生孢子，又借助气流传播，对田间生长的玉米进行反复侵染，造成病害爆发流行，玉米上小斑病的潜育期为4d-6d，显症期大约为7d，玉米发病初期的化学防治是治理玉米小斑病的主要防治措施，而小斑病菌侵染初期难以从症状上与弯孢霉叶斑病、圆斑病及大斑病区分，且以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差。病害发生时常因难以做到病害及时检测而错过最佳防治时期，不能有效控制病原菌的传播和病害流行。而玉米小斑病菌在形态特征上与玉米大斑病菌极其相似，难以鉴定，因此迫切需要建立一种快速、灵敏的检测方法用于玉米小斑病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑。
随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，pcr(polymerasechainreaction)技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断，但其需要昂贵的仪器设备，难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技术是由日本科学家notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现109-1010倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比不同的pcr技术，lamp技术全程恒温反应，无需pcr仪，且扩增量大灵敏度高。
技术实现要素：
针对现有技术中对玉米小斑病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，pcr检测需要依靠扩增仪等设备的问题，本发明提供了一种玉米小斑病菌lamp检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种玉米小斑病菌lamp检测引物，所述玉米小斑病菌lamp检测引物包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip，各引物核苷酸序列为：
f3：5’-accactggtatcgtcctcg-3’；
b3：5’-gcagagcttctccttgatgt-3’；
fip:5’-catgtcgacacgggagatggc-tctggtgacggtgtcactc-3’；
bip:5’-ggtcgtgacttgaccgactacc-cgatttctcgctcggcag-3’。
一种玉米小斑病菌lamp可视化检测方法，利用正向外引物f3：5’-accactggtatcgtcctcg-3’、反向外引物b3：5’-gcagagcttctccttgatgt-3’、正向内引物fip：5’-catgtcgacacgggagatggc-tctggtgacggtgtcactc-3’以及反向内引物bip：5’-ggtcgtgacttgaccgactacc-cgatttctcgctcggcag-3’进行lamp反应。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.特异性强、准确性高：本发明是根据真菌actin(act)基因序列在真菌种内的高度保守性和科属间可变性的特点，选取了6个特定区域设计了对玉米小斑病菌具有特异扩增作用的4条lamp引物。已经对不同地理来源的玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌、携带玉米小斑病菌的植物组织和健康的玉米组织进行了检测验证，只有玉米小斑病菌和携带该病菌的玉米组织呈现阳性，说明本发明所设计的引物及检测方法用于检测玉米小斑病菌准确可靠，能有效区分发生在玉米上症状特征相似的病害；
2.灵敏度高：lamp对玉米小斑病菌的检测灵敏度在dna水平上可达100fg，具有很高的灵敏度；
3.适用性广、实用性好：本发明的玉米小斑病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的玉米组织进行检测，可实现玉米小斑病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防止病害的爆发流行。
4.操作简便快速：lamp是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，结果可视化，一般整个检测过程可在1.5小时内完成，操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明lamp检测方法对玉米小斑病菌的特异性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果。上图中泳道m为5000bpdnamarker，泳道1为阳性对照、泳道2-泳道4为不同来源玉米小斑病菌dna，泳道5-泳道10分别为下列病原菌dna：玉米大斑病菌、玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌、阴性对照；下图可视化显色结果中1-4显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
图2为本发明lamp检测方法对玉米小斑病菌的灵敏性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图可视化显色结果。上图中泳道m为5000bpdnamarker，泳道1-泳道9的模板dna浓度分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，泳道10-泳道11为阴性对照；下图可视化显色结果中1-7显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
图3为本发明lamp检测方法对玉米发病组织实用性检测结果，上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果。上图中泳道m为5000bpdnamarker，泳道1-泳道3分别为玉米小斑病菌dna、玉米小斑病自然发病的玉米组织dna、人工接种玉米小斑病菌发病的玉米组织dna，泳道4为健康玉米组织dna，泳道5和泳道6分别为阳性对照、阴性对照；下图可视化显色结果中1-3、5显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1玉米小斑病菌lamp引物设计
根据玉米小斑病菌actin(act)基因序列在真菌种内的高度保守性和科属间可变性的特点设计对玉米小斑病菌具有特异扩增作用的lamp检测引物，包括2条外引物(f3和b3)和2条内引物(fip和bip)，其核苷酸序列分别为：
f3：5’-accactggtatcgtcctcg-3’；
b3：5’-gcagagcttctccttgatgt-3’；
fip:5’-catgtcgacacgggagatggc-tctggtgacggtgtcactc-3’；
bip:5’-ggtcgtgacttgaccgactacc-cgatttctcgctcggcag-3’。
实施例2玉米小斑病菌lamp可视化检测方法的建立
1.待测样品dna的提取：
①用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法提取供试菌株基因组dna，具体步骤如下：
(1)取0.1g菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl2wt.％ctab提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15min；
(2)取上清液700μl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(各体积比为25:24:1)，温和摇动，室温条件下，8000r/min离心10min；
(3)取上清液500μl，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000r/min离心10min；
(4)取上清液350μl，加入1/10体积3mol/lnaac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000r/min离心5min；
(5)弃去上清液，加入700μl体积浓度为70％冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000r/min离心10sec，晾干，加入50μlte缓冲液，-20℃保存备用。
②用于检测玉米植株组织是否存在玉米小斑病菌时，采用naoh快速裂解法提取玉米植株组织基因组dna，具体步骤如下：
a.称取待检测的植物组织0.1g，加入0.5mol/lnaoh30μl，将组织充分磨碎成糊；
b.将糊状组织转入1.5ml离心管中，12000r/min离心6min，取上清液5μl；
c.上清液中加入495μl0.1mol/ltris-hcl(ph＝8.0)，混合均匀，取1.0μl作为pcr模板进行扩增；
2.以提取待测样品dna为模板进行lamp扩增：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/lf3，0.2mmol/lb3，1.6mmol/lfip，1.6mmol/lbip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5μl的lamp反应混合液(40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2％trionx-100)，用无菌的超纯水补足25μl。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0μl，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在玉米小斑病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在玉米小斑病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μllamp扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在玉米小斑病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在玉米小斑病菌。
实施例3玉米小斑病菌lamp检测特异性测定
1.采用ctab法提取3株不同来源玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌的基因组dna。
2.以提取供试菌的dna为模板进行lamp扩增：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/lf3，0.2mmol/lb3，1.6mmol/lfip，1.6mmol/lbip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5μl的lamp反应混合液(40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2％trionx-100)，用无菌的超纯水补足25μl。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0μl，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在玉米小斑病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在玉米小斑病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μllamp扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在玉米小斑病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在玉米小斑病菌。
4.特异性验证结果
如图1所示，3株不同来源玉米小斑病菌显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征性梯形条带，而供试其它作物病原菌和阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现lamp特征性梯形条带，表明本发明的lamp引物可以将玉米小斑病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于玉米小斑病菌的特异性检测和鉴定。
实施例4玉米小斑病菌lamp检测灵敏性测定
1.采用ctab法提取玉米小斑病菌的基因组dna；
2.将提取的玉米小斑病菌的基因组dna，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
3.以配制的成系列浓度dna为模板进行常规lamp扩增：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/lf3，0.2mmol/lb3，1.6mmol/lfip，1.6mmol/lbip，bstdna聚合酶为8u，dna模板1fg～100ng，12.5μl的lamp反应混合液(40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2％trionx-100)，用无菌的超纯水补足25μl。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
4.lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0μl，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在玉米小斑病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，未检测到玉米小斑病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μllamp扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在玉米小斑病菌；没有出现条带则判断为阴性，未检测到玉米小斑病菌。
5.检测结果
如图2所示，显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征性的梯形带，检测灵敏度可达100fg。
实施例5发病玉米小斑病的玉米植株中病原菌的lamp检测
1..采用ctab法提取玉米小斑病菌基因组dna；采用naoh快速裂解法提取玉米植株组织基因组dna。
2.以提取供试样品的dna为模板进行lamp扩增：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/lf3，0.2mmol/lb3，1.6mmol/lfip，1.6mmol/lbip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5μl的lamp反应混合液(40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2％trionx-100)，用无菌的超纯水补足25μl。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0μl，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在玉米小斑病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在玉米小斑病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μllamp扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在玉米小斑病菌；没有出现梯形条带则判断为阴性，不存在玉米小斑病菌。
4.检测结果
如图3所示，玉米小斑病菌dna、自然发病玉米小斑病的玉米组织dna、人工接种玉米小斑病菌发病的玉米组织dna、阳性对照显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征性的梯形带，而健康玉米组织、阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现lamp特征性的梯形带，表明本发明lamp引物和检测方法还可用于田间玉米小斑病发病植株的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110>福建省农业科学院植物保护研究所
<120>玉米小斑病菌lamp检测引物及其可视化检测方法和应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
accactggtatcgtcctcg19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gcagagcttctccttgatgt20
<210>3
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
catgtcgacacgggagatggctctggtgacggtgtcactc40
<210>4
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ggtcgtgacttgaccgactacccgatttctcgctcggcag40