本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白lhcb5在稻瘟病菌抗性中的应用。
背景技术：
水稻作为全球范围内种植最广也是最重要的粮食作物，供给全球超过半数的人口，随着全球人口数量的激增，水稻生产的需求量及安全性变得愈发重要。稻瘟病菌(magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是我国乃至全球稻区广泛发生的、最重要的毁灭性真菌病害，严重威胁着全球的粮食生产安全。稻瘟病在我国每年造成30亿公斤的粮食损失，是我国各水稻主产区最重要的病害之一。目前，对该病害的防治仍以选育抗病品种和化学防治为主，化学防治通常成本高，病菌抗药性不断产生导致效果差，且也造成污染环境。而稻瘟病菌在进化过程中形成的遗传多样性和毒性易变，致使抗病品种推广3-5年后抗病性丧失，品种失去利用价值。因此，深入了解水稻与稻瘟病菌互作的分子机制，不仅有助于开发与应用广谱有效的抗稻瘟病菌防治策略，也挖掘抗稻瘟病菌育种新基因资源提供理论依据，对未来水稻的可持续生产具有重要的应用价值。
在植物与病原微生物长期互作选择及协同进化的过程中，两者之间一直上演着复杂而精准的攻击、防御、再攻击、再防御的军备竞赛。近年来的研究表明，植物中存在与动物相似的先天免疫系统(innateimmunitysystem)，这一系统由病原相关模式分子pamps(pathogen-associatedmolecularpatterns)和效应分子分别诱导两种层面pti(pamp-triggeredimmunity)和eti(effector-triggeredimmunity)的免疫反应构成。植物应对病原菌的基础抗病性(pti)要通过细胞膜上的受体识别病原菌的保守模式分子(pamps)而产生，具有稳定、持久、广谱的特点，解释其机制对改良作物的持久抗病性具有重要理论和实践价值。效应子是病原菌攻击植物的关键武器，稻瘟病菌侵染水稻时能分泌大量效应子到植物细胞中干扰其抗病反应，解释效应子在植物细胞内的作用靶标可以寻找植物的感病基因，不但对认识病原菌的致病机理有重要意义，对通过基因编辑等方法改造感病基因从而构建抗病植物也具有重要价值。
长期以来，对病原物与寄主植物互作的研究中发现，效应分子诱导的免疫反应(eti)相比于pti更迅速且更强烈，同时eti过程还伴随大量活性氧(ros)的积累和植物细胞的过敏反应(hr)。稻瘟病菌侵染水稻时分泌的效应蛋白进入植物体内存在两种不同的外泌机制：一是经bic(biotrophicinterfacialcomplex)特殊结构分泌、进入水稻细胞内的细胞质效应分子，二是侵染菌丝细胞壁与寄主包膜之间的eihm(extra-invasive-hyphalmembrane)结构分泌、滞留在寄主细胞外质外体效应分子[1,2]。不论是细胞质效应分子或是质外体效应分子，都会与对应的靶基因相互作用，干扰水稻免疫反应。前期的研究发现，目前研究比较清楚的无毒效应分子是avr-piz-t，它会靶标到寄主的泛素蛋白酶系统，从而抑制pamp触发的防卫反应[3-5]。效应分子slp1参与稻瘟病菌致病过程，并抑制寄主几丁质触发的防卫反应[6]。此外，无毒效应分子avr-pi-ta，会被水稻抗病(r)基因pi-ta识别，触发强烈的防卫反应[7]。其它一些无毒效应分子蛋白(ace1、avr1-co39、avrpiz-t、avr-pia、avr-pik/km/kp、avr-pii、avr-pib和avr-pi9)，也分别被水稻中的对应抗病基因特异性识别[8-12]，进而调控水稻抗病性。但是这些效应分子在水稻与病原菌互作中的分子作用机制还不清楚。因此鉴定及克隆效应分子靶基因对深入解析水稻抗病机制，挖掘水稻抗病基因资源具有重要的指导价值。
在植物与病原菌互作过程中，植物对光合作应的依赖更强，因为光合作用是很多防卫分子前体生物合成的地方[13,14]。合成水杨酸的前体物质分支酸和异分支酸都是在叶绿体中合成和催化[15]，而水杨酸在植物防卫反应中起着重要作用。cmu1和玉米种的分支酸变位酶zmcm2互作，促进分支酸从基质向细胞质中外流，减少了叶绿体中的分支酸，导致sa合成减少，玉米抗性减弱的作用[16,17]。茉莉酸(ja)是脂质派生的激素，它的合成起始于叶绿体，但是完成与过氧化物酶体。ja的生物合成起始于质体膜上释放的α亚麻酸，随后连续的被定位于基质的脂氧化酶(lox)、丙二烯氧化酶(aos)和丙二烯环化酶(aoc)催化，形成前体分子cis-opda(顺式12-氧-植物二烯)。cis-opda随后被转运到过氧化物酶体中，进行还原反应和β氧化，形成最终的产物(+)-iso-ja。当(+)-iso-ja被释放到细胞质后，会结合异亮氨酸形成具有生物活性的激素ja-ile，进而控制寄主抗性[18]。
光系统ii中相关蛋白psbq也会被诱导激发细胞坏死，从而抑制p.syringae的侵染；而p.syringae分泌的hopn1具有半胱氨酸蛋白酶活性，能够通过讲解psbq，调控寄主抗性[19]。叶绿素a/b结合蛋白lhcb5，属于lhc蛋白家族的的成员，lhcii蛋白需要被磷酸化后，行使电子传递需要及psii和psi的状态转换，其在电子传递过程中有非常重要的作用[20-22]。但是关于该家族蛋白调如何调控水稻对稻瘟病菌抗性还没有报道。因此，水稻通过lhcb5蛋白调控抗病性的发现为搭建水稻光系统蛋白与寄主抗病性关系提供重要的理论依据依据，可望为水稻抗病育种提供优质基因资源，同时利用分子克隆手段筛选并培育抗病高产的水稻植株。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种提高水稻抗稻瘟病菌能力的方法。
本发明提供提高水稻抗稻瘟病菌能力的方法，是提高背景植株中lhcb5的磷酸化水平。
本发明的另一个目的，是通过提高lhcb5基因在背景菌株中的表达，提高水稻的抗病性。
本发明的另一个目的是，通过使lhcb5蛋白持续磷酸化，提高水稻的抗病性。
本发明的进一步目的是提供lhcb5的磷酸化位点。
本发明的另一个目的是提供上述lhcb5基因的表达载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植物。
本发明的进一步目的是提供lhcb5持续磷酸化转基因水稻植株，对田间不同稻瘟病菌小种具有广谱抗病性的应用。
本发明提供的技术方案是：一种水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白lhcb5基因的突变体：以野生型基因编码的蛋白的第24位氨基酸突变为天冬氨酸。
所述野生型基因lhcb5的编码基因如seqidno.1所示，其编码的lhcb5蛋白序列如seqidno.2所示。
本发明还提供水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白lhcb5基因或所述的突变体在植物抗病过程中的应用，其中通过转基因方法在植物中过量表达所述基因。
上述的应用，其中，所述植物为单子叶植物，优选地所述植物为水稻。
上述的应用，所述抗病性指抗稻瘟病菌、或疫霉病菌导致的植物病害。
本发明还提供利用水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白lhcb5基因或所述的突变体在制备抗病转基因植物中的应用，其中通过转基因方法在转植物中过量表达。
上述的应用，所述植物为单子叶植物，优选地所述植物为水稻。
所述的应用，所述抗病性指抗稻瘟病菌、或疫霉病菌导致的植物病害。
本发明涉及水稻中的叶绿素a/b结合蛋白lhcb5在抗病过程中的应用，lhcb5基因沉默和敲除不影响稻瘟病菌的正常侵染；但是，lhcb5的过表达转基因植物，对稻瘟病菌具有显著的抗性，能够抑制稻瘟病菌在寄主细胞内扩展。并且在与稻瘟病菌互作过程中，诱发大量活性氧的产生，导致细胞坏死。同时诱导寄主细胞内抗病相关基因的表达，以及nadph氧化酶酶基因的表达，从而显著提高对稻瘟病菌的抗性。本发明涉及的转基因植物并不影响正常的生长和结实。
本发明发现，在水稻与稻瘟病菌互作过程中，水稻中的lhcb5被磷酸化，该蛋白的磷酸化能够显著提高水稻对稻瘟病菌的基础抗病性。过表达植株接种不同田间稻瘟病菌均表现为抗性，说明lhcb5调控广谱性，可推广实际应用。
本发明还发现，在3000份种质资源扫描中，该基因在不同水稻植株中的表达量差异显著，且具有丰富的多态性，有26个多态性位点分布在内含子、外显子以及启动子区域。本发明还证实，lhcb5基因编码283个氨基酸，其24位的苏氨酸为磷酸化位点，该位点在单子叶植物中保守，但在双子叶植物中并不存在。该位点的持续性激活能够诱导烟草细胞及水稻原生质体活性氧的积累，诱发细胞坏死。在不同水稻品种与稻瘟病菌互作时，发生磷酸化的水稻品种表现为抗病，未发生磷酸化的水稻品种表现为感病，说明lhcb5的磷酸化对于水稻的基础抗病性至关重要。
本发明有利于水稻抗病品种的培育，为后期筛选高抗水稻品种提供依据。例如，本发明能够提供lhcb5过表达植株，利用ems诱变获得lchb5基因的沉默抑制子，并获得对应的转基因植株；另外，本发明能够进一步提供或应用利用上述转基因植株或者种子，进行杂交获得更高抗的转基因水稻植株。
附图说明
图1为lhcb5基因响应稻瘟病菌侵染，图1a表示水稻tp309接种稻瘟病菌后，不同时间段，lhcb5基因转录水平的变化；图1b表示水稻tp309接种稻瘟病菌后，不同时间段，lhcb5基因翻译水平的变化。
图2为lhcb5基因敲除突变体的获得及致病性测定，图2a为利用crispr/cas9技术获得lhcb5基因敲除突变体靶标序列的构建，以及目的基因敲除的测序结果；图2b为lchb5基因敲除突变体致病性接种结果；图2c为图2b病斑大小的统计结果。
图3为lhcb5基因的沉默及过表达转基因植株的验证，图3a表示lhcb5基因沉默和过表达植株表达量的验证；图3b表示lhcb5蛋白过表达植株western验证。
图4为lhcb5基因的沉默及过表达转基因植株抗病性测定，图4a为lhcb5基因沉默和过表达植株致病性测定；图4b为图4a发病面积统计；图4c为图4a中叶片病斑保湿培养的产孢情况；图4d为稻瘟病菌在lhcb5基因沉默和过表达植株中菌丝侵染显微观察；图4e为图4d中侵染菌丝分级(i级，只有附着胞没有侵染菌丝；ii级只有一根初生侵染菌丝；iii级为多根分枝的侵染菌丝，但没有扩展到邻近细胞；iv级为侵染到邻近细胞的侵染菌丝)。
图5为lhcb5转基因植株诱导寄主活性氧积累及细胞坏死，图5a为lhcb5基因沉默和过表达植株叶片dab和trypanblue染色结果；图5b为lhcb5基因沉默和过表达植株水稻原生质体活性氧测定结果；图5c为不同还原剂处理后，lhcb5基因沉默和过表达植株叶鞘dab和trypanblue染色结果；图5d为图5c的dab染色统计结果；图5e为图5c的trypanblue染色统计结果；图5f为lhcb5基因沉默和过表达植株中病程相关基因的表达结果；图5g为lhcb5基因沉默和过表达植株中两个nadph氧化酶的表达结果。
图6为不同稻瘟病菌小种的致病型。
图7为lhcb5过表达植株调控水稻对稻瘟病菌的广谱抗性。
图8为lhcb5蛋白的磷酸化调控水稻对稻瘟病菌的抗病性，图8a为lhcb5过表达植株在病原菌诱导条件下发生磷酸化；图8b为lhcb5基因在不同水稻品种中表达量与抗病性之间的相关性分析；图8c为lhcb5的磷酸化提高水稻对稻瘟病菌的抗性；图8d为lhcb5的磷酸化不调控抗病基因与无毒基因之间的抗病性。
图9为lhcb5磷酸化位点的鉴定及应用，图9a为双子叶植物与单子叶植物中，lhcb5蛋白同源性比对及磷酸化位点的预测；图9b为lhcb5的24位氨基酸的持续磷酸化诱导烟草细胞坏死；图9c为lhcb5的24位氨基酸为磷酸化位点，并被疫霉菌lt263诱导表达；图9d为lhcb5的24位氨基酸的持续磷酸化诱导水稻原生质体活性氧的积累。
具体实施方式
实施例1：lhcb5基因响应稻瘟病菌的侵染
用稻瘟病菌野生型菌株guy11侵染水稻tp309后，提取侵染不同阶段的水稻叶片rnarna的提取利用天根公司的rna提取试剂盒；提取后的rna反转录合成cdna，用于检测lhcb5基因的表达量，反转录利用takara的反转录试剂盒完成；本发明发现稻瘟病菌侵染后，lhcb5基因的表达量上调表达(图1a)。进一步提取不同阶段的水稻叶片蛋白，进行western检测，本发明发现lhcb5蛋白量在侵染后期逐渐积累(图1b)，证实lhcb5基因响应稻瘟病菌的侵染。
实施例2：lhcb5基因敲除突变体的获得及致病性测定
本发明利用crispr/cas9的方法，委托武汉伯远生物公司，获得lchb5基因的水稻敲除突变体。并通过测序证明该基因已被敲除，并存在两种形式的不同突变(图2a)；进一步通过水稻叶片接种稻瘟病菌野生型菌株guy11[23],7天后统计病斑大小，实验重复3次，得到稳定一致的结果，证明lhcb5基因敲除突变体对稻瘟病菌表现为感病(图2b和c)。
实施例3：lhcb5基因沉默及过表达植株的验证
本发明利用puccrnai载体实验lhcb5基因的沉默，首先将lhcb5基因距离起始密码子489bp至696bp的序列分别正向和反向构建到puccrnai载体上，再委托武汉伯远生物公司转化获得lhcb5基因沉默突变体；本发明还利用酶切连接的方法将目的基因lhcb5的编码区构建到pcam2300载体中，引物设计时lhcb5上下游引物分别添加xbai和psti酶切位点，扩增lhcb5基因，再将目的基因和载体用限制性内切酶xbai和psti进行酶切线性化，通过t4连接酶将载体和片段进行连接，构成pcam2300-lhcb5的载体。再将lhcb5基因通过该载体由actin启动子启动基因表达，并自带flag标签，用于后期的验证；载体由本实验室构建，并委托武汉伯远生物公司转化获得lhcb5基因过表达的植株；获得的转基因植株，首先通过qrt-pcr定量分析lhcb5基因的表达量，证明lchb5基因的沉默及表达没有问题(图3a)，进一步通过westerm检测发现，过表达植株中lhcb5蛋白量明显升高(图3b)，证明获得的转基因植株能用于后续实验。
本发明将获得的转基因水稻植株进行繁重，获得第3代稳定遗传的后代植株，用于致病性测定。通过水稻叶片喷雾接种稻瘟病菌野生型菌株guy11孢子液，浓度为5x104个/ml，发现lhcb5基因的沉默突变体表现为感病，而lhcb5基因的过表达植株对guy11表现为抗病，并且抗病叶片上的病斑保湿培养后不能形成分生孢子说明其为坏死斑(图4a、b和c)；进一步利用水稻叶鞘侵染实验，发现guy11在lhcb5基因的过表达植株中，侵染菌丝不能够正常扩展(图4c和d)，说明lhcb5基因的过表达植株能够抑制稻瘟病菌的侵染，提高抗病性。
实施例4：lhcb5基因过表达植株诱导寄主活性氧积累及细胞坏死
本发明利用二氨基联苯胺(dab，sigma公司)对寄主活性氧进行染色观察，利用台盼蓝(tb，碧云天公司)对寄主的坏死细胞进行染色观察。水稻叶片均接种稻瘟病菌孢子24小时以后采集，叶片用1mg/ml浓度的dab，室温黑暗条件下染色8小时以上，再用乙醇：乙酸(94:4)进行脱色，有活性氧积累的叶片被染成深褐色，实验结果表明lhcb5基因过表达材料在稻瘟病菌侵染后积累大量的活性氧；进一步利用台盼蓝染液对叶片染色，再用水合三氯乙醇脱色，坏死细胞能够被染成深蓝色(图5a)，结果发现lhcb5基因过表达材料存在大量细胞坏死的现象。并且我们在水稻原生质体中也得到相同的结果，当lhcb5基因过表达材料用纯化后的稻瘟病菌菌丝处理后，会积累大量的活性氧，该活性氧迸发的检测利用luminol化学发光检测仪，并绘制动力曲线(图5b)。
本发明利用显微观察技术，对lhcb5基因过表达材料寄主活性氧的积累进行认证。将稻瘟病菌孢子液注射入水稻叶鞘中，用dan和trypan染色，如上脱色后，叶鞘利用手术镊撕取内表皮，进行显微观察，发现lhcb5基因过表达材料叶鞘细胞中积累了大量的活性氧，并且稻瘟病菌菌丝扩展被抑制；进一步用还原剂处理叶鞘细胞并染色也发现，还原剂处理后能够抑制部分活性氧的积累(图5c、d和e)，说明lhcb5基因过表达植株确实诱导寄主活性氧积。本发明还发现，lhcb5基因过表达植株中病程相关基因pr1、pbz1、aos2和lox1均上调表达(图5f)，并且两个nadph氧化酶基因在过表达材料中也上调表达(图5g)。
实施例5：lhcb5基因过表达植株调控水稻对稻瘟病菌的广谱抗病性
本发明发现lhcb5基因过表达植株对田间的不同稻瘟病菌小种均具有抗性。我们分离来自田间的21个不同致病型的稻瘟病菌(图6)，分别喷雾接种lhcb5基因过表达植株和tp309野生型植株，接种7天后观察水稻叶片发病情况，发现lhcb5基因过表达植株对21个田间菌株均表现出抗性，而tp309均表现为感病(图7)。说明lhcb5基因过表达植株调控的抗性具有广谱性。
实施例6：lhcb5蛋白的磷酸化调控水稻对稻瘟病菌的抗病性
本发明发现lhcb5调控的抗病性与该蛋白的磷酸化密切相关。用稻瘟病菌野生型菌株guy11接种水稻tp309以及lhcb5基因过表达水稻材料，48小时后，提取叶片蛋白，进行wester检测，发现tp309不管接菌与否，都不发生磷酸化，而lhcb5基因过表达材料在接菌后能够发生磷酸化(图8a)，说明lhcb5响应稻瘟病菌侵染后发生了磷酸化的现象。
本发明还发现lhcb5基因的表达量与水稻的抗病性具有一定的相关性。提取不同水稻品种的rna，并通过qrt-pcr定量分析lhcb5基因的表达量，发现不同水稻中lhcb5基因的表达存在差异，并且这些水稻对稻瘟病菌的抗性也存在差异，lhcb5基因表达量高的菌株对稻瘟病菌表现出抗性，相关性值为-0.713(图8b)。
本发明还涉及，lhcb5基因的表达量与磷酸化之间的关系，我们发现不同水稻品种在接种稻瘟病菌后lhcb5蛋白的磷酸化存在差异，lhcb5蛋白不发生磷酸化的水稻品种对稻瘟病菌表现为感病，lhcb5蛋白发生磷酸化的水稻品种对稻瘟病菌表现为抗病(图8c)。但是这种抗病现象不适用与抗病基因与无毒基因之间的识别(图8d)。
实施例7：lhcb5蛋白磷酸化位点的预测及应用
本发明通过网站预测以及同源比对发现了lhcb5蛋白的磷酸化位点，位于第24位的苏氨酸，该位点在双子叶植物中不存在，在单子叶植物中较保守(图9a)。我们将该位点进行持续性激活突变，将苏氨酸突变为天冬氨酸，并利用pbin载体，含35s启动子，在烟草细胞中进行表达，并用dab染色，发现持续性激活能够诱导活性氧积累(图9b)。进一步研究发现，lhcb5能够响应疫霉菌lt263的侵染，发生磷酸化；将24位苏氨酸突变为丙氨酸，进行失活突变，发现失活突变后lhcb5不能够发生磷酸化(图9c)，说明lhcb5的第24位氨基酸为磷酸化位点。并且我们在水稻原生质体中也得到相同的结果，当在lhcb5基因沉默材料中，表达持续性激活的lhcb5后，水稻原生质体会积累大量的活性氧，而失活突变不会积累活性氧，该活性氧迸发的检测利用luminol化学发光检测仪，并绘制动力曲线(图9d)。
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