治疗性HPV卵黄抗体及其应用的制作方法

文档序号：15182717发布日期：2018-08-17 06:22阅读：494来源：国知局

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种hpve6/e7重组微环dna的卵黄抗体及其在治疗hpv感染的应用。

背景技术：

宫颈癌占女性妇科恶性肿瘤的第二位，现已成为威胁女性健康的重要疾患，中国每年死于宫颈癌的人数将近5万，宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视，研究发现引起宫颈癌的关键是hpv的感染。hpv属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是球形、双链环状dna病毒。hpv主要通过直接或间接接触污染物品或通过性传播感染人类。hpv的感染有宿主特异性和组织特异性，只能感染人类的皮肤和粘膜受损的基底细胞。

hpv经损伤的宫颈粘膜首先感染基底细胞层，病毒以少量游离dna状态潜伏在基底细胞内，以实现免疫逃逸。当基底细胞不断分化、成熟、向粘膜表层迁移，hpv病毒就大量增殖。随着粘膜表层上皮细胞的凋亡，病毒颗粒大量释放到上皮表面，作为新的感染源可进一步加重感染。长期hpv持续感染导致宿主细胞相关基因表达发生变化，可逐渐发展为宫颈癌。

hpv至今已鉴定明确的大约有200多个亚型，根据其致病和预后不同又可分为高危型hpv(hr-hpv)和低危型hpv(lr-hpv)，其中hr-hpv15种，包括hr-hpv16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58型等，感染后可引起癌前病变和宫颈癌。其中hpv16和hpv18是最主要的流行株。

hr-hpv的持续感染，使hr-hpvdna与宿主宫颈基底膜细胞dna整合，引起hr-hpve2片段(e2基因参与转录调节，e2蛋白是主要的病毒转录因子)的缺失，e2片段的缺失加快宫颈病变的进展，增加恶性转化的可能性，主要原因是e2片段的缺失引起hpve6/e7mrna表达，e6/e7蛋白促进﹑维持hr-hpvdna与宫颈基底细胞dna整合，使宫颈基底细胞异常增生，hpve6/e7mrna干扰正常细胞周期，导致细胞基因组不稳定，转录生成的e6/e7蛋白，可以灭活抑癌蛋白p53、rb和p21等，使正常的宿主细胞向恶性方向转化，e6/e7蛋白可以使hpv逃避宿主的免疫监视以及干扰机体免疫反应。e6/e7蛋白为癌蛋白，因此可以针对e6/e7蛋白开发治疗hpv感染的药物。

卵黄抗体(immunoglobulinofyolk,igy)为通过免疫注射产蛋鸡，由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗。dna核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(igy)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。而目前尚无核酸抗原免疫获得的hpve6/e7卵黄抗体用于治疗hpv感染的先例。

目前预防性疫苗gardasil/cervarix可有效预防hpv感染，但对于已有hpv感染或癌前病变者并无明显治疗作用，故有必要开发针对hpv感染的治疗性药物。

因此开发一种核酸抗原免疫获得的hpve6/e7卵黄抗体以及其在治疗hpv感染中的应用，对于治疗治疗hpv感染和预防宫颈癌具有重大意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包含hpve6/e7片段的重组dna片段，其消除e6/e7致癌能力，并增强了e6/e7的免疫原性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一段包含hpve6/e7片段的dna重组片段，其由信号肽序列区、flt3l序列区、连接区、hpve6/e7片段、标签区依次连接组成；

所述hpve6/e7片段的核苷酸序列如seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3所示；

所述flt3l序列区的的核苷酸序列如seqidno:4所示。

本发明选择了hpv最主要的流行株hpv16和hpv18，通过对其编码e6和e7蛋白的核苷酸序列的剪切和重排消除其编码的蛋白的致癌能力，同时保留了e6和e7的抗原决定簇，保持其免疫原性。

三种hpve6/e7核苷酸片段编码三种氨基酸序列的三维结构变形的e6/e7融合多肽。

本发明首先对hpve6、e7的抗原决定簇进行分析，确定其抗原决定簇。后将抗原决定簇的位置重排，并确认重排后的融合多肽消除了致癌能力。经过筛选，上述seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3的核苷酸序列对应的融合多肽符合既保留免疫原性又消除致癌能力的要求。

作为优选的方案，hpve6/e7核苷酸片段的核苷酸序列为seqidno:3所示。

本发明的e6/e7融合多肽是在细胞核内表达的蛋白，其免疫力弱。因此，由信号肽序列表达的信号肽诱导三维结构变形的e6/e7融合蛋白分泌至细胞外，从而增强抗原特异性体液免疫应答及细胞免疫应答。

上述信号肽可使用包括哺乳动物等的高等真核细胞内的信号肽，如tpa(组织型纤溶酶原激活物)、hsvgds，或可使用生长激素等的分泌信号序列。作为优选的方案，上述信号肽使用tpa。

进一步，本发明的tpa信号肽序列区的核苷酸序列为seqidno:7所示。

免疫增强肽指激活与免疫应答相关的细胞(如，树突状细胞等)以增强免疫应答的肽。flt3l为本发明的免疫增强肽，用于增强hpv-e6/e7重组片段的免疫原性。

作为优选的方案，上述连接区的核苷酸序列如seqidno:5所示。

作为优选的方案，上述标签区的核苷酸序列如seqidno:6所示。

作为优选的方案，上述dna片段尾端还包含终止密码子。

综上所述，本发明的dna重组片段最优的核苷酸序列为seqidno:8所示。

本发明的目的之二在于提供一种重组微环dna，微环dna作为目的一的重组dna片段的载体具有稳定、安全的优点。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种hpve6/e7重组微环dna，其包含目的一的重组dna片段。

微环dna是亲本质粒(parentalplasmid，pp)体内位点特异性重组的产物。在携带真核表达框的亲本质粒两侧插入重组酶识别位点，诱导体内相关重组酶表达，该重组酶将识别位点中间的dna序列切断，亲本质粒被分成2个超螺旋分子，即具有复制功能的小质粒(miniplasmid，mp)和携带真核表达框的微环(minicircle，mc)dna。

微环dna是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性，可在体内长期表达高水平的转基因产物。mc在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与共价键密闭环状dna(cccdna)相同，使mc成为安全、高效的理想载体。

与传统质粒和病毒载体比较，微环dna在动物细胞内表达外源基因具有一系列独特的优势：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)去除了传统质粒中的抑制信号，表达外源基因较传统质粒稳定，高效。

因此本发明的重组微环dna具有安全、稳定、高效、产业化生产成本低的优点。

本发明的目的之三在于提供一种重组微环dna作为核酸抗原制备的卵黄抗体，其抗体效价高，特异性强。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的目的二的重组微环dna作为核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡，获得卵黄抗体(igy)。

dna核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(igy)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。

因此本发明的hpve6/e7的卵黄抗体采用重组微环dna作为核酸抗原免疫获得，具有抗体效价高，特异性强的优点。

本发明的目的之四在于提供一种上述hpve6/e7的卵黄抗体的制备方法，其制备较为简单，且成本较低。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的hpve6/e7的卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)目的二的重组微环dna作为抗原，免疫产蛋鸡；

2)取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄；

3)纯化蛋黄中的所述重组微环dna的卵黄抗体。

卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而igy是γ卵黄球蛋白。因此igy的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离igy。

已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以peg、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。

工业上大规模生产igy的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。

本发明的目的之五在于提供一种上述卵黄抗体在用于制备治疗hpv感染的药物的用途，其制备的药物具有效价高、特异性强的优点。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的卵黄抗体能够直接中和hpv病毒的e6/e7蛋白。e6/e7蛋白可以使hpv逃避宿主的免疫监视以及干扰机体免疫反应。e6/e7蛋白被抗体中和后将不能灭活抑癌蛋白p53、rb和p21，因此可用于治疗hpv感染，以及预防hpv阳性患者产生e6/e7蛋白进而进一步发展为宫颈癌。

由此，本发明的卵黄抗体可用于制备治疗hpv感染的药物。

本发明的目的之六在于提供一种治疗hpv感染的药物，其包含hpve6/e7卵黄抗体，具有安全、直接中和细胞内的hpv病毒的e6/e7蛋白的优点。

作为优选的方案，上述治疗hpv感染的药物为阴道用药，包括阴道洗剂、阴道凝胶或阴道栓剂等。上述药物可用于hpv阳性女性快速阳转阴以及对于宫颈癌的预防有重要意义。

本发明的目的之七在于提供转一种用于治疗hpv感染的组合物，其包含上述卵黄抗体，并能够完成卵黄抗体的跨膜转运，使其直接进入细胞内，中和细胞内的hpv病毒产生的e6/e7蛋白。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种用于治疗hpv感染的组合物，该组合物的活性成分为选自上述的卵黄抗体或制备所述卵黄抗体的重组微环dna免疫的鸡的蛋黄的水溶性成分的一种或多种；所述组合物还包含脂质体。

脂质体(liposome)是由磷脂及其他附加成分形成的一种双分子层小囊泡。由于这种双分子膜层具有生物膜特征,可与细胞融合,将脂质体囊泡中包裹的药物或其他成份导入细胞中。脂质体常作为核酸载体将其导入细胞，目前脂质体作为蛋白载体导蛋白入细胞技术也逐渐得到重视。脂质体可以与细胞膜融合而只将蛋白导入细胞。

本发明通过脂质体方法，实现抗体的跨膜转运，使抗体直接中和细胞内的hpv病毒产生的e6/e7蛋白，解决了目前临床上对宫颈粘膜细胞内hpv病毒持续感染造成宫颈癌无有效解决方法的难题，以及能够用于治疗hpv感染。作为优选的方案，上述脂质体为纳米脂质体。

作为优选的方案，上述组合物还包含乳糖。

作为优选的方案，上述组合物包含抗菌剂聚己亚甲基盐酸盐(phmb)。

本发明的目的之八在于提供一种上述组合物在用于制备治疗hpv感染的药物的用途。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

上述组合物在本发明的卵黄抗体的基础上添加脂质体，使脂质体包裹抗体完成跨膜转运进入细胞，可直接中和细胞内的hpv病毒产生的e6/e7蛋白，使抑癌蛋白p53、rb和p21免于被降解，进而达到治疗hpv感染的效果，以及hpv阳性患者避免发展为宫颈癌。因此上述组合物用于制备治疗hpv感染的药物，对已感染hpv女性预防宫颈癌有重要意义。

作为优选的方案中添加的聚已亚甲基盐酸(phmb)是一种被公认为21世纪最安全高效的广谱抗菌剂，无色无味，抑菌浓度低，广谱低毒，作用速度快，泡沫量低，并且能够在物品/皮肤表面形成一层阳离子持续长时间的抑菌。

本发明的目的之九在于提供一种治疗hpv感染的药物，其包含上述的组合物以及药学可接受的载体。

作为优选的方案，上述药物为阴道用药，包括阴道洗剂、阴道凝胶和阴道栓剂。

作为优选的方案，上述药物为阴道凝胶时，药物中还包含甘油。

本发明的有益效果在于：1)本发明提供的hpve6/e7重组微环dna包含hpv16的e6/e7基因片段以及信号肽序列和免疫增强肽序列，可作为核酸抗原引起机体免疫反应。2)dna核酸抗原免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(igy)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。3)本发明的卵黄抗体可用于制备治疗hpv感染的药物，阴道用药对hpv阳性患者输入高活性抗hpv抗体。4)结合纳米脂质体的方法，本发明的卵黄抗体跨膜进入细胞，直接中和细胞内的hpv病毒产生的e6/e7蛋白。因此本发明的卵黄抗体对于治疗hpv感染和预防宫颈癌有重要意义。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1卵黄抗体的制备

1.重组微环dna的制备

1)设计两端加bglii和sali酶切位点的seqidno:8所示的hpve6/e7重组片段，并合成，得目的基因；

2)将上述目的基因片段和zy781载体用bglii和sali同时双酶切，胶回收后按常规方法将目的片段克隆至载体zy781的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本质粒(pp)；

3)用上述亲本质粒转化大肠杆菌zycy10p3s2t，过夜培养，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；

4)将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/mlkana的tb培养液中，37℃，250rpm过夜培养；

5)取过夜培养的菌液与minicleinductionmix按等体积混合，于32℃，250rpm反应5h-8h。反应完结束后，离心，提取质粒，即为重组微环dna质粒。

其中minicleinductionmix：向100mllb中加入1mnaoh4ml和20％阿拉伯糖200μl，混合后经0.22μm滤膜过滤。

2.卵黄抗体的制备

1)上述重组微环dna作为核酸抗原，免疫产蛋鸡：首次免疫,将抗原与等体积弗氏完全佐剂混合乳化,免疫方式为鸡翅根处肌肉注射；初次免疫三周后进行第二次免疫,抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合,剂量与第一次相同；二周后,进行第三次免疫,方法与第二次免疫相同；三次免疫后，每2个月强化免疫1次，使抗体维持在一个较高的水平。

2)取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄：免疫1周后，收集鸡蛋并做好标记；把鸡蛋的蛋清去除得到卵黄后在双蒸水中漂洗，再将卵黄膜剥去，尽量得到纯卵黄液。

3)纯化蛋黄中的所述重组微环dna的卵黄抗体：取1体积蛋黄液加9倍体积的蒸馏水，用hcl调节ph至5.0；4℃放置过夜，所得上清液即为鸡卵黄的水溶性部分(wsf)，igy便包含在wsf中；采用硫酸铵沉淀法，其具体步骤如下：

①50％饱和硫酸铵溶液配制：取固体硫酸铵21.9g溶于100ml蒸馏水中即成。

②将50％饱和硫酸铵溶液缓慢加入到wsf中，使硫酸铵溶液与wsf的体积比为3：1，混合后室温过夜，使igy沉淀在这种高盐的条件下。

③次日，将混合溶液于4℃下8000r/min离心20min,弃上清，保留沉淀，igy抗体就在其中。

④用0.1mol/l的pbs溶液将所得沉淀溶解，于截流分子量为10kd

的透析袋中，4℃蒸馏水中透析过夜，中间换液2～3次。

⑤收集透析过夜的igy抗体，即为本发明的hpvl1卵黄抗体。

实施例2治疗hpv感染的凝胶及其效果评价

1.成分：hpvl1鸡卵黄抗体(含纳米脂质体)、phmb、乳糖、甘油、蒸馏水。

使用阴道凝胶剂型对患者输入高活性抗hpv抗体，通过纳米脂质体方法，实现抗体的跨膜转运，使抗体直接中和细胞内的hpv病毒产生的e6/e7蛋白，避免抑癌蛋白p53、rb和p21的降解，解决了目前临床上对宫颈粘膜细胞内hpv病毒阳性感染导致宫颈癌无有效解决方法的难题。

ph为5.0，呈弱酸性，阴道内环境同样偏酸性，避免对阴道内环境稳态的破坏。

除上述阴道凝胶外，本发明的鸡卵黄抗体还可用于制备阴道洗液或阴道栓剂。

2.临床试验报告

①试验对象：选择hpv阳性患者72例，年龄23-58岁。纳入标准包括：一过性感染、持续或反复感染患者，包括部分轻度细胞学改变(cinⅱ级以下)的患者，剔除cinⅲ以上、罹患宫颈癌以及宫颈癌术后患者。

②试验过程

试验对象分为实验组和对照组，分别使用本发明的卵黄抗体凝胶(42例)和干扰素制剂(30例)。

标本采集：在患者非月经期取样，取样前避免阴道内用药；使用获得药监局认证的专用一次性宫颈细胞取样系统进行取样，切忌使用棉拭子取样；检测所需样本为宫颈脱落细胞而非宫颈分泌物，取样前一定要求使用棉拭子将宫颈分泌物擦拭干净，尽量避免样本中含过多的血液及黏液；按照厂家提供一次性宫颈细胞取样系统说明书进行取样。

治疗周期：实验组使用本发明的凝胶，连续使用3个月，第一个月除月经期及经期前后各3天外，连续使用本产品18天，每天1支；第2、3月隔日使用。停用4周后复查。对照组使用外用干扰素制剂，连续使用3个月，停用4周后复查。

疗效观察指标：采用广东凯普生物科技股份有限公司的检测产品21种hpv分型检测试剂盒(pcr+膜杂交法)对hpv阳性患者治疗前后进行检测，判定hpv阳转阴的情况并记录。

结论：卵黄抗体凝胶实验组临床结果显示，转阴病例数38例，未转阴数4例，转阴率90.48％；外用干扰素对照组转阴病例数11例，未转阴数19例，转阴率36.7％。

由此，本发明的hpve6/e7卵黄抗体对于hpv感染患者阳转阴有重要的作用，可用于制备治疗hpv感染的药物。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>江苏润洁生物科技有限公司

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