本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种玉米抗逆相关基因zmdi19-9及其应用。
背景技术：
玉米已经成为世界上最重要的粮食作物之一，作为我国的第一大粮食作物，玉米的种植地域广阔，产量丰盛，每年玉米在全世界的种植面积可达20亿亩以上，总产量可达10亿吨。然而我国种植的玉米中，50％以上都位于缺水的东北、西南和西北地区，玉米受干旱等非生物逆境影响较为严重。另外，非生物胁迫中的土壤盐渍化也会严重影响玉米的产量，有相关学者预测，到2050年，全球大约会有超过一半的土壤发生盐渍化。由此可见，培育高产抗逆的玉米品种刻不容缓。在众多玉米品种的培育方法中，转基因育种技术发展至今仅30年，但是由于其可对目标植物进行定向性状的改变，使育种效率得到了一定的提高，在育种的大家庭中也发挥着更加重要的作用。其中，转录因子是被研究的较为充分的一类逆境相关蛋白，对转录因子进行有效研究将极大的推动玉米育种的发展。
植物在自然生长过程中会受到各种各样的逆境胁迫，包括病虫害等生物胁迫和干旱、高温、低温、高盐等非生物胁迫，其中非生物胁迫又因与气候环境息息相关，常常直接影响植物的生长及产量而受到科学工作者的广泛重视。这些非生物胁迫是影响植物自然地理分布的主要环境因素，制约了农业中的植物产量和粮食安全。此外，抗逆性较差的作物需要消耗更多的水和肥料，从而对环境造成负担，因此提高植物的抗逆性对于环境的可持续性发展也至关重要，越来越多的学者已经着手研究植物是如何感应逆境信号并适应不利环境的。其中，参与干旱与高盐胁迫的包括初生胁迫信号与次生胁迫信号。由干旱引起的初生胁迫信号是高渗胁迫，由于低渗环境通常不会影响植物细胞生长，该初生胁迫信号也可直接称为渗透胁迫；盐胁迫则同时包括渗透作用和离子或离子毒性作用。干旱和盐胁迫的次生胁迫信号是由缺水或富盐引起的，包括氧胁迫、细胞成分(如膜脂质、蛋白质和核酸)的破坏和代谢功能障碍等，原理更加复杂。
转录因子(transcriptionfactor，tf)，也叫作反式作用因子，能调控植物的生长发育、形态建成，还能帮助植物对外界的非生物胁迫产生应激反应，是指在真核生物中，能够和它的启动子区域中的顺式作用元件相结合，产生特异性的作用的dna结合蛋白。tf可以互相作用，也可以和其他蛋白互相作用，调控转录起始，使基因的转录被激活，有的时候会使之受到抑制。经典的转录因子通常由dna结合区(dna-bindingdomain，dbd)、寡聚化位点区(oligomerizationsite，os)、核定位信号区(nuclearlocationsignal，nls)和转录调控区(transcriptionregulationdomain，trd)4个功能区域组成。这些功能结构域使转录因子可以和目的基因启动子的顺式作用元件作用，或者别的转录因子的功能结构域也能使之作用来促进或抑制基因的转录表达。
植物转录因子具有非常丰富多样的作用，植物的生长发育过程中经常有转录因子的身影，在遇到生物与非生物胁迫时也能看到转录因子发生作用。tcp转录因子家族基因就可以参与到植物细胞的生长和分化过程中。植物在面对非生物胁迫情况时，转录因子也可以起到十分重要的调控作用，很多逆境相关转录因子功能均已被证实。比如植物nac家族转录因子可以参与植物逆境响应；热激转录因子pshsf1可以提高植物对氧化胁迫的耐受性；棉花myb转录因子gbmyb5可以提高植物对干旱的承受力；aadreb1可以转基因植株对冷胁迫的耐受力；等等。已经研究出的转录因子功能丰富，但是还有很多为研究的转录因子等着研究者去挖掘，发现它们的功能，以对我们的生产生活提供帮助。
1995年，gosti等最早在干旱处理拟南芥时发现了一类干旱调节蛋白(drought-induced19)并将其命名为di19蛋白，并且发现其中有些基因对干旱的响应依赖于aba，而另一些则不依赖aba，预示着di19家族基因的信号传导途径可能不止一个。2006年，milla等人第一次完整的鉴定了拟南芥中的7个di19家族基因atdi19-1～7，同时发现它们都能参与失水、高盐的响应途径中，atdi19-1和atdi19-3在受到干旱胁迫诱导时能迅速响应，atdi19-2和atdi19-4在受到高盐胁迫诱导时能快速应答，显示出很强的抗逆特性。值得注意的是，hrbl(atdi19-7)除了可以被非生物胁迫诱导外，还受光信号影响表达，它可以与钙依赖性蛋白激酶(cdpks)相互作用并在体外被cdpk磷酸化。此外，atdi19蛋白还可以与发病机理相关的pr1，pr2和pr5启动子的taca(a/g)t元件结合，直接上调它们的表达来抵抗干旱胁迫。最近几年在其他物种中，在小麦、水稻、棉花、大豆等植物中又陆续有di19家族基因的功能被鉴定出来，而且几乎都是与非生物胁迫密切相关的。其中已报道的水稻中含有7个di19基因osdi19-1～7，大豆中含有7个di19家族基因gmdi19-1～7，均已进行生物信息学的进化分析。tadi19a、tadi19b在小麦中参与依赖于aba的非生物胁迫反应。棉花ghdi19-1和ghdi19-2基因参与了依赖于aba的干旱、高盐响应。大豆gmdi19-5基因参与非生物胁迫的响应，同时能够与gmlea3.1互作。这些研究表明di19家族转录因子在各个不同物种中都发挥了类似的作用，即能够参与非生物胁迫的诱导反应。
中国专利文献201710307119.7公开了“一种玉米抗逆相关基因zmdi19-5及其应用”，首次公开了玉米中di19家族基因及其功能，丰富了玉米抗逆相关基因的资源，对玉米抗逆新品种的选育具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种玉米抗逆相关基因zmdi19-9及其应用，以提供另一种新的可用于玉米抗逆遗传改良的基因。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种玉米抗逆相关基因zmdi19-9，其核酸序列如seqidno.1所示，或为与seqidno.1所示序列互补的核苷酸序列，全长744bp。
本发明还提供了上述玉米抗逆相关基因zmdi19-9在降低或提高植物抗逆性中的应用。
本发明还提供了一种植物过量表达载体，所述植物过量表达载体为pcambia1301载体，所述pcambia1301载体的多克隆位点区域依次连接有35s启动子、zmdi19-9基因和终止子。
本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述植物过量表达载体，或其基因组中整合有外源的所述zmdi19-9基因的正向或反向序列。
本发明还提供了一种提高植物抗逆性的方法，所述方法是将所述zmdi19-5基因导入植物的细胞、组织或器官中，获得抗逆性强的转基因植株新品种。
进一步地，所述植物包括玉米、水稻、小麦、拟南芥、烟草。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种玉米抗逆相关基因zmdi19-9及其应用，该基因为一种新的植物抗逆相关基因，该基因在茎中表达水平最高，根和叶次之，雄穗中最低。亚细胞定位实验结果显示，zmdi19-9蛋白为定位在细胞核和细胞膜的蛋白质。转录活性实验结果表明zmdi19-9蛋白具有转录自激活活性。该基因的发现，丰富了抗逆相关基因的资源，对玉米抗逆新品种的选育具有重要意义，而相比较现有已发现的玉米抗逆相关基因，其抗逆能力更强。
附图说明
图1为zmdi19-9基因pcr扩增电泳图；
图2a为zmdi19-9基因在200mmnacl处理不同时间下的表达量；
图2b为zmdi19-9基因在玉米不同组织中的表达量；
图3为p1305-35s-gfp和p1305-35s::zmdi19-9-gfp载体构建图；
图4为zmdi19-9基因转录活性分析结果；a：阴性对照组(pgbkt7)；b：阳性对照组(pgbkt7-53+pgadt7-t)；c：实验组(pgbkt7-zmdi19-9)
图5为zmdi19-9转基因拟南芥幼苗在不同浓度nacl下生长情况；wt：野生型；l1～3：zmdi19-9转基因拟南芥株系；
图6为nacl处理前后转基因拟南芥的生理生化指标测定结果；其中：a-相对含水量、b-相对电导率、c-丙二醛含量、d-脯氨酸含量；wt：野生型，l1～3：zmdi19-9转基因拟南芥株系。
具体实施方式
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1玉米zmdi19-9基因的克隆
2.1.1引物的设计
根据玉米基因组数据库网站已公布的数据，获得了玉米zmdi19-9(grmzm2g014066_t01)基因的cds序列，设计上游与下游引物需要primerpremier5.0软件，结合后续所需要的使用的过量表达载体pcambia1301a载体的多克隆位点，并通过限制性酶切位点分析网站(http://nc2.neb.com/nebcutter2/)确定该基因可用的酶切位点，最终确定在上游引入kpni(ggtacc)，下游引入bamhi(ggatcc)及它们的酶切位点保护碱基。上游与下游引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(下同)。引物的核苷酸序列为：
zmdi19-9-f：5’-ggggtaccatggactcggagcactggat-3'
zmdi19-9-r：5’-cgggatcctcagtctccaaatagagtggagag-3'
2.1.2pcr扩增
选择玉米b73自交系为实验材料，提取玉米叶片组织rna，并反转录成cdna，以cdna为模板，以zmdi19-9-f和zmdi19-9-r为引物，用
加完试剂后，点震混匀，进行pcr反应参数的设置，具体如下：
需要注意的是，在第5步最终延伸之前，需暂停pcr反应，打开pcr仪并向微量离心管中加入easytaqdnapolymerase0.2～0.5μl，以给克隆产物3’端加上polya尾巴。然后将微量离心管放回pcr仪中，继续刚才的最终延伸步骤。
反应结束后，对pcr产物电泳，置于紫外凝胶成像系统下观察拍照。
结果如图1所示，图中可以很清楚地看出，得到了一条750bp左右清晰明亮条带，而zmdi19-9基因的cds序列长度为744bp，大小相符合，说明此基因的pcr扩增效果比较好，可以进行接下来的相应操作。
进一步地，将目标基因用axygen公司的胶回收试剂盒进行切胶回收，与
2.2玉米zmdi19-9基因组织表达模式分析
2.2.1逆境诱导处理
待玉米幼苗正常生长至三叶期时，以正常生长的玉米为对照0h，分别用200mm的nacl、和100μm的aba进行模拟逆境的处理，在处理后1h，3h，6h和12h，24h的时间点剪取被处理的玉米植株相同部位的叶片各3份，当时取样，当时就放到液氮中并保存至-80℃备用。
同时取玉米b73自交系幼苗生长至三叶期的根、茎、叶以及成苗时期的雄穗、果穗、花丝、花粉和苞叶等不同组织，放到液氮中并保存至-80℃备用。
2.2.2荧光定量pcr
提取步骤2.2.1的玉米各组织rna，并反转录成cdna。
引物设计：送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成的qrt-pcr引物是由beacondesigner7设计的，目的基因zmdi19-9(grmzm2g014066_t01)及玉米内参基因actin1(j01238)的引物的核苷酸序列为：
qzmdi19-9-f：5’-ggactcggagcactggatctcgcgc-3’
qzmdi19-9-r：5’-tctccatctccatctccaagccccc-3’
qzmactin-f：5’-gggattgccgatcgtatgag-3’
qzmactin-r：5’-gagccaccgatccagacact-3’
荧光定量pcr：
加完试剂后，点震混匀，荧光定量pcr程序如下：50℃2分钟，95℃10分钟，95℃15秒，40个循环数，60℃1分钟，添加溶解曲线，用2–δδct法进行数据处理。每个基因重复3次操作并且每次做3次平行样实验。
2.2.3分析结果
通过对玉米b73自交系幼苗生长至三叶期的根、茎、叶以及成苗时期的雄穗、果穗、花丝、花粉和苞叶等不同组织，以及用200mm的nacl处理0h，1h，3h，6h，12h和24h的玉米三叶期幼苗叶片中的zmdi19-9基因表达量进行实时荧光定量pcr分析，结果如图2所示。
图2a中可看出，在200mm的nacl的处理下，zmdi19-9基因在3h开始表达，并在24h大量表达，且表达量约为0h的9倍。
图2b中可看出，zmdi19-9基因在所检测的玉米组织中均有所表达，茎中最多，根、叶次之，雄穗最低。
2.3玉米zmdi19-9亚细胞定位分析
2.3.1亚细胞定位载体构建
为了研究zmdi19-9蛋白的定位情况，如图3所示，利用pcambia1305(p1305)作为骨架，gfp绿色荧光蛋白作为报告基因，构建了p1305-35s::zmdi19-9-gfp融合表达载体。融合表达载体的构建方法为基因工程载体构建的常规方法，在此不做详细阐述。
2.3.2转基因农杆菌的制备
cacl2法制备农杆菌eha105感受态细胞，将p1305-35s::zmdi19-9-gfp融合表达载体转化农杆菌eha105感受态细胞中并筛选阳性克隆子，获得转p1305-35s::zmdi19-9-gfp的农杆菌。
2.3.3转基因农杆菌介导的本式烟草的遗传转化
转p1305-35s::zmdi19-9-gfp的农杆菌介导的本式烟草的遗传转化，步骤包括：
(1)将转p1305-35s::zmdi19-9-gfp的农杆菌和p19农杆菌菌株在双抗yep液体培养基中培养；
(2)在超净台上，吸取适量培养2天左右的上述农杆菌菌液及含双抗yep液体培养基(用于调零)，使用u-2900分光光度计(hitachi)测量上述各溶液od600的吸光值(1.5～2.0之间为较适)；
(3)依据所用叶片的数量以及最终所需的体积(vfinal)，计算所需农杆菌菌液的体积：
vconstruct＝n×vfinal×0.5/od600
v19＝n×vfinal×0.3/od600
n：所用叶片的数量，本实验为3；vfinal：最终所需的体积，本实验为2ml
(4)将计算出来的两种菌液按所需体积混合均匀，5000转/分离心15分钟；
(5)弃去上清，用vfinal(2ml)体积的配制好的处理液悬浮菌体，室温避光静置3小时左右；
(6)用2ml注射器(去掉针头)注射长势良好的本氏烟叶片下表皮，使菌液能够逸散到整个烟草叶片；
(7)将烟草置于黑暗条件下生长36～48小时后，制片，激光共聚焦显微镜观察拍照。
2.3.4亚细胞定位检测
将构建成功的p1305-35s::zmdi19-9-gfp融合表达载体导入农杆菌eha105中，处理液处理后瞬时转化本氏烟的叶片，同时转化pcambia1305载体于本氏烟叶片中作为对照。将转化后2天左右的烟草下表皮细胞制片，置于激光共聚焦显微镜下观察蛋白定位情况。结果显示，对照组烟草叶片细胞在显微镜下能观察到细胞核和细胞质都显示出强烈的绿色荧光信号，实验组zmdi19-9-gfp融合蛋白也表现出了类似的定位情况，在细胞核和细胞质中都有gfp信号的存在，表明zmdi19-9是一个定位在细胞核和细胞膜的蛋白质。
2.4玉米zmdi19-9转录活性分析
2.4.1zmdi19-9转录活性载体的构建
为了研究zmdi19-9蛋白的转录自激活活性情况，我们利用购自clontech公司的酵母杂交载体pgbkt7作为骨架，酵母菌ahl09菌株的ade2、his3、mel1作为报告基因，构建了pgbkt7-zmdi19-9融合表达载体。设计引物使用primerpremier5.0软件，结合pgbkt7载体的多克隆位点，并通过限制性酶切位点分析网站确定该基因可用的酶切位点，最终确定在上游引入ecori(gaattc)，下游引入bamhi(ggatcc)，并加入相对应的酶切位点保护碱基。引物的核苷酸序列为：
zmdi19-9-bk-f：5’-cggaattcatggactcggagcactggat-3'
zmdi19-9-bk-r：5’-cgggatcctcagtctccaaatagagtggagag-3'
2.4.2liac法转化酵母菌ah109
常规方法制备酵母ah109感受态细胞。
将pgbkt7-zmdi19-9载体(实验组)、pgbkt7载体(阴性对照组)、pgbkt7-53和pgadt7-t共转化载体(阳性对照组)按照酵母双杂交试剂盒内所附的实验步骤，转入酵母菌ah109中，分别划线接种于选择性培养基sd/-trp固体培养基和sd/-trp-his-ade/x-α-gal固体培养基上2～3天，观察结果。
2.4.3结果分析
结果如图4所示，图中可以看出，实验组、阴性对照组和阳性对照组均能在单缺培养基sd/-trp固体培养基上正常生长，且菌落为白色；但是在三缺培养基sd/-trp-his-ade/x-α-gal固体培养基上，只有阳性对照组和实验组能正常生长，菌落呈现出蓝色，即表现出了α-半乳糖苷酶活性。该实验证明zmdi19-9蛋白在酵母中具有自激活活性，符合转录因子的特征。
2.5玉米zmdi19-9基因过量表达载体的构建和遗传转化
以pcambia1301为原始载体，在其多克隆位点的ecori和sali酶切位点之间连接一个35s启动子，并在sphi和hindiii酶切位点之间加上一段终止子，获得改造的载体pcambia1301a。
用kpni、bamhi双酶切t1+zmdi19-5载体得到小的目的片段，同时用kpni、bamhi双酶切p1301a得到大片段。
连接反应体系为：
连接反应在16℃下进行3h后，转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑斑、摇菌、提质粒，并通过双酶切验证，获得p1301a-35s::zmdi19-9融合表达载体。
cacl2法制备农杆菌eha105感受态细胞，将p1301a-35s::zmdi19-9融合表达载体转化农杆菌eha105感受态细胞中并筛选阳性克隆子，获得转p1305-35s::zmdi19-9-gfp的农杆菌。
为了研究玉米zmdi19-9基因的生物学功能，我们按照基因工程常规方法将构建的玉米zmdi19-9基因过量表达载体转入模式植物拟南芥中，并筛选获得转基因拟南芥植株。选取t2代zmdi19-9转基因拟南芥阳性植株和同时收取的wt拟南芥种子用于分析。
2.6玉米zmdi19-9转基因拟南芥植株对高盐胁迫的敏感性分析及生理指标的测定
将收取的zmdi19-9过量表达转基因拟南芥t2代种子和同代的wt拟南芥种子进行消毒春化后，移植到含100mm、150mm和200mmnacl与不含nacl(作为对照)的ms固体培养基上进行盐胁迫实验，重复3次。时刻观察表型，并进行拍照、统计。
结果发现，随着时间的推移，对照ms固体培养基上的所有拟南芥幼苗均正常生长，且长势基本一致；而含有nacl的ms固体培养基上的所有拟南芥幼苗则表现出受胁迫的表型，叶片绿色加深且更加卷曲，在150mmnacl处理下甚至卷成花骨朵状，根长变短，侧根数量明显减少，且受胁迫的程度随着培养基所含nacl浓度的升高而更严重，直至死亡，生长在200mmnacl的拟南芥wt幼苗在移栽2～3天内即死亡，虽然转基因拟南芥随后也死亡，但是其绿色叶片数比wt要略多。除此之外，zmdi19-9过量表达转基因拟南芥的幼苗的根长较wt而言也更长。为了进一步说明问题，本实施例还对它们的主根根长进行了统计，结果如图5所示，结果表明在150mmnacl处理下，转基因植株与对照组存在显著性差异。
为了更清楚的了解zmdi19-9转基因拟南芥植株在自然生长条件下，受到盐胁迫时产生的差异，我们将在无菌环境(ms固体培养基)里正常生长11天的长势一致的拟南芥幼苗移栽至土壤中(营养土：蛭石＝1：3)，待其生长至快开花时定时浇灌定量的200mmnacl进行盐处理，具体步骤均参照赵海泉主编《基础生物学实验指导·植物生理学分册》一书。
结果发现，植株在盐处理前长势基本一致，但是盐处理后10天左右即表现出明显差异：与wt相比，zmdi19-9过量表达转基因拟南芥植株在盐处理后，虽然长势变差，叶片发黄，但仅有几棵植株的部分叶片枯萎，所有植株均正常存活；然而对应的wt植株在同样环境同样处理下，仅有少量植株存活，大部分植株都萎蔫死亡。继续处理植株至其开花结果，发现转基因植株长势明显优于存活的wt植株，具体表现为抽薹数更多，相应的荚果数更多，且有着更高的株高，表明zmdi19-9转基因拟南芥植株有较好的耐盐性。
同时，我们测量了nacl处理前和处理后的相对含水量(rwc)、相对电导度、丙二醛含量和脯氨酸含量，结果如图6所示，可以发现，转基因拟南芥有着更高的相对含水量，更小的相对电导度，更少的丙二醛含量以及更高的脯氨酸含量，这些生理生化指标进一步证明了zmdi19-9转基因拟南芥植株对盐有较好的耐受性。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
序列表
<110>安徽农业大学
<120>玉米抗逆相关基因zmdi19-9及其应用
<141>2018-04-19
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>744
<212>dna
<213>玉米(zeamays)
<400>1
atggactcggagcactggatctcgcgcctggccgccgccaagcgttactacgcggcgcag60
ctcggccacgtcgacgatgtgcccgggatagggacggaggaggtggagatggagattgag120
gacgacgggggcttggagatggagatggagatggcgctggggctcggggacgcgacgtgg180
ccggatgtcgcctgcccctactgctacgaggaccatgacgtcgcgtccctctgcgtccac240
ctcgaggaggaccacccctatgagccccactccgcgccctgccccatttgctcccaaagg300
gttacaagagatatgcttaaccatatgaccatgcagcatggttacctgttcaagaacggt360
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gcagtgactacaaacatttccagcgatcctcttctttcgtcgtttggcctgggcttctca540
ccatcagatgcaccagaaccatcaaaatcggcgtcttctattccagatggcgcctcaata600
cgtaaggagacaccggttcagccttgggagtcgagtattgattcatctctcacaagcgag660
gaaagggagcaaaagcggaaacaggccaccggcagagcaacctttgtgcaaggcctagtg720
ctctccactctatttggagactga744