化合物及其制备方法与在制备肿瘤耐药逆转剂中的应用与流程

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及化合物及其制备方法与在制备肿瘤耐药逆转剂中的应用。

背景技术：

癌症(cancer)也称恶性肿瘤，癌症是由于机体细胞失去正常调控，过度增殖而引起的疾病。癌症是目前死亡率最高的疾病之一，大多数癌症病人使用化疗药物治疗一段时间后，会产生耐药问题，导致化疗效果不佳。肿瘤的多药耐药性机理较为复杂，其中肿瘤细胞中ABC转运蛋白的高表达是导致肿瘤多药耐药的重要原因。ABC转运蛋白可以使药物被泵出肿瘤细胞外，从而降低药物的抗肿瘤效果。ABCG2是其中一种ABC转运蛋白，现有技术研究表明，恶性肿瘤难以根除的原因之一是癌干细胞过肿瘤中的SP细胞表达ABCG2而形成多要抗性，造成治疗效果不理想。并且，正常细胞液会表达ABCG2蛋白，这给肿瘤治疗带来了严重的困扰。

烟曲霉毒素C(Fumitremorgin C,FTC)是吲哚二酮哌嗪类化合物，从烟曲霉菌发酵产物中分离得到，是最早发现的ABCG2的抑制剂之一。研究表明，FTC能够特异性地逆转大部分ABCG2高表达细胞的耐药性，从而可以逆转米托蒽醌、阿霉素和拓扑替康等抗肿瘤药物的耐药性。另外，FTC结构类似物Ko143逆转效果也很显著。

但是，不论是FTC还是Ko143，它们的合成步骤都较长，产率低，合成成本高。例如，Yuexian Li等人完成了Ko143的合成，第一种合成方法包括9个步骤，总产率0.4％；第二种合成方法包含5个步骤，总产率提高到了5％。但是，这样的产率仍然较低，致使制备成本居高不下，难以满足临床应用的需要。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供化合物及其制备方法与在制备肿瘤耐药逆转剂中的应用。本发明提供的化合物能够逆转肿瘤耐药性，且其制备方法简单，收率高。

本发明提供了式I所示结构化合物：

本发明提供的式I化合物中包含两个酰基，经证实，该化合物能够逆转抗肿瘤药物的耐药性。

本发明还提供了，式II所示结构化合物的制备方法，包括：

以POCl₃和AlCl₃为催化剂，式III化合物与式V化合物反应，得到式II所示结构化合物；

其中，R¹为-H，R²为-OMe；或R¹为-OMe，R²为-H；

其中，R¹为-OMe，R²为或R¹为-H，R²为-OMe。

所述式II化合物为(即1c)或(即2f)。

本发明实施例中，所述式III化合物与式V化合物的摩尔比为1:1或1：2。

式II化合物为式III化合物中，R¹为-H，R²为-OMe；式III化合物与式V化合物的摩尔比为1:1。

式II化合物为式III化合物中，R¹为-OMe，R²为-H；式III化合物与式V化合物的摩尔比为1:2。

本发明实施例中，所述POCl₃与AlCl₃的摩尔比为3.6：1。

本发明实施例中，所述催化剂AlCl₃与式III化合物的摩尔比为3.7：1。

本发明实施例中，所述反应以1,2-二氯乙烷为溶剂。

一些具体实施例中，每10mL溶剂中，加式III化合物588mg；式V化合物1360mg；POCl₃ 5ml；AlCl₃ 2g进行反应。

所述反应的温度为55～65℃，时间为1～10h。一些具体实施例中，反应的温度为60℃，时间为4h。

所述反应后还包括纯化的步骤，所述纯化包括：将反应产物降温后，滴入冰水中，以CH₂Cl₂萃取，柱层析分离得到产物。

本发明利用新的反应条件首次合成了二酰化吲哚衍生物。已有的吲哚类ABCG2抑制剂结构较复杂，合成步骤长，总产率低，而本发明中式II化合物合成步骤短，仅一步反应，且反应简单，并且化合物能够有效地逆转ABCG2诱导的耐药性。

本发明还提供了式II所示结构化合物在制备肿瘤耐药逆转剂中的应用；

其中，R¹为-OMe，R²为或R¹为-H，R²为-OMe。

本发明中，式II所示结构化合物能够逆转的肿瘤耐受药物为米托蒽醌或阿霉素；

本发明中，所述肿瘤的ABCG2过表达。

所述肿瘤为结肠癌或非小细胞肺癌。

本发明的实验表明，式II化合物均能够有效地逆转ABCG2过表达耐药细胞S1-M1-80和H460/MX20的耐药性。

单独使用米托蒽醌时，H460/MX20耐药倍数达到117.6倍。而米托蒽醌与化合物1c或者2f联用时，H460/MX20耐药倍数降低。与化合物1c(5μM)联用的耐药倍数RF值为5.3，与化合物2f(10μM)联用的耐药倍数RF值为6.4，化合物1c(5μM)的逆转活性优于2f(10μM)的逆转活性，并且1c(5μM)逆转活性较接近于FTC(2.5μM)。

单独使用米托蒽醌时，S1-M1-80的耐药倍数达到99.1倍。而米托蒽醌与式II化合物联用时，S1-M1-80的耐药倍数降低。与化合物1c(5μM)联用的耐药倍数RF值为4.9，与化合物2f(25μM)来挪用的耐药倍数RF值为2.4，并且化合物1c或2f逆转活性接近于FTC(5μM)。与阿霉素联用时，S1-M1-80中化合物1c(5μM)的RF值为0.9，化合物2f(25μM)的RF值为0.9，逆转活性接近于阳性对照FTC(5μM)。

本发明中还提供了一种肿瘤耐药逆转剂，包括式II所示结构化合物和药学上可接受的辅料；

其中，R¹为-OMe，R²为或R¹为-H，R²为-OMe。

本发明提供了式II化合物的制备方法，并提供了制得的两种化合物在制备肿瘤耐药逆转剂中的应用；本发明提供的制备方法，以以POCl₃和AlCl₃为催化剂，仅需一步反应，条件简单，收率高。所制得的化合物能够逆转肿瘤耐受药物的耐药性，且其逆转活性与现有ABCG2抑制剂FTC相当。

具体实施方式

本发明提供了化合物及其制备方法与在制备肿瘤耐药逆转剂中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1化合物(5-甲氧基-1H-吲哚)-3-(4-甲氧基苯基)甲酮(5-Methoxy-1H-indol-3-yl)(4-methoxyphenyl)methanone(1c)及其合成

588mg式III化合物，1360mg式V化合物，5ml的POCl₃；2g的AlCl₃，添加于10mL 1,2-二氯乙烷中，60℃反应4h，反应后降至室温，滴入冰水中，以CH₂Cl₂萃取，柱层析分离得到产物，总收率为40％；纯度为99.5％。

IR谱(KBr涂膜cm^-1):3151,2956,1602,1427,1026cm^-1；

¹H NMR谱(ppm):δ(ppm)11.90(br,1H),7.89(d,J＝3.2Hz,1H),7.80(d,J＝8.8Hz 2H),7.76(d,J＝2.4Hz,1H),7.40(d,J＝8.8Hz,1H),7.07(d,J＝8.8Hz 2H),6.88(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),3.85(s,3H),3.80(s,3H).(溶剂DMSO-d₆，TMS内标)

实施例2(4-甲氧基-1H-吲哚)-3,5-双(4-甲氧基苯基)甲酮(4-methoxy-1H-indole-3,5-diyl)bis((4-methoxyphenyl)methanone)(2f)及其合成

588mg式III化合物，1360mg式V化合物，5mL的POCl₃；2g的AlCl₃，添加于10mL 1,2-二氯乙烷中，60℃反应4h，反应后降至室温，滴入冰水中，以CH₂Cl₂萃取，柱层析分离得到产物，总收率为19％；纯度为96.7％。

IR谱(KBr涂膜cm^-1):3380,2935,1600,1361,1075cm^-1；

¹H NMR谱(ppm)12.00(br,1H),7.77(dd,J＝8.8,2.4Hz,4H),7.60-7.56(m,2H),7.13(dd,J＝8.8,2.0Hz,2H),7.05(dd,J＝8.8,2.0Hz,2H),6.78(d,J＝8.8Hz,1H),3.89(s,3H),3.86(s,3H).(溶剂DMSO-d₆，TMS内标)

药效验证

1、细胞培养方法

所用细胞S1为结肠癌敏感细胞株，S1-M1-80为结肠癌耐药细胞株，H460为非小细胞肺癌敏感细胞株，H460/MX20为非小细胞肺癌耐药细胞株。用含10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5％CO₂、恒温培养箱中培养。其中S1-M1-80与H460/MX20使用含米托蒽醌(20nM)的培养基培养一个月后，用不含药物的培养基培养两周后才用于MTT测试。

2、MTT法筛选化合物最大非毒性浓度

收集对数生长期的细胞，以每孔180μL接种于96孔板中，细胞贴壁后加入20μL不同浓度的化合物作用44h，每个浓度设3个平行孔。MTT比色法测各孔570nm吸光度(A)值。计算细胞抑制率。

抑制率＝(对照组A570-实验组A570)/对照组A570

选取细胞抑制率<10％的药物浓度作为该药物对细胞株的最大非毒性浓度。

表1吲哚衍生物最大非毒性浓度

结果如表1所示，米托蒽醌为阳性对照组。化合物1c和2f的最大非毒性浓度分别为10μM、100μM，即化合物1c和2f的浓度分别为10μM、100μM时，细胞的存活率超过90％。

3、化合物对耐药细胞米托蒽醌敏感性的影响

取对数生长期的耐药细胞，接种于96孔板中，对照组加入不同浓度的米托蒽醌，逆转组加入最大非毒性浓度的化合物培养1h后，加入米托蒽醌(含1％的DMSO)，各组培养44h后加入MTT 20μL(5.0mg/mL)作用4h，加入100μL DMSO，震荡10min后，测各孔A570nm，分别计算对照组和联合用药组米托蒽醌的IC₅₀值，并计算耐药倍数(RF)，以检测最大非毒性浓度化合物与米托蒽醌联合应用对耐药细胞生长的影响。

耐药倍数RF＝化合物联合米托蒽醌对耐药细胞IC₅₀值/米托蒽醌对敏感肿瘤细胞IC₅₀值

表2吲哚衍生物逆转ABCG2过表达耐药细胞H460/MX20对米托蒽醌的敏感性

结果如表2所示，以已知的ABCG2抑制剂FTC为阳性对照组。化合物1c和2f均能够有效地逆转ABCG2过表达耐药细胞H460/MX20的耐药性。单独使用米托蒽醌时，耐药倍数达到117.6倍。而米托蒽醌与化合物1c或者2f联用时，耐药倍数降低。化合物1c(5μM)的耐药倍数RF值为5.3，化合物2f(10μM)的耐药倍数RF值为6.4。化合物1c(5μM)的逆转活性优于2f(10μM)的逆转活性，并且1c(5μM)逆转活性较接近于FTC(2.5μM)。

表3吲哚衍生物逆转ABCG2过表达耐药细胞S1-M1-80对米托蒽醌的敏感性

结果如表3所示，以已知的ABCG2抑制剂FTC为阳性对照组。化合物1c和2f均能够有效地逆转ABCG2过表达耐药细胞S1-M1-80的耐药性。单独使用米托蒽醌时，耐药倍数达到99.1倍。而米托蒽醌与化合物1c或2f联用时，耐药倍数降低。化合物1c(5μM)的耐药倍数RF值为4.9，化合物2f(25μM)的耐药倍数RF值为2.4，并且化合物1c或2f逆转活性接近于FTC(5μM)。与阿霉素联用时，化合物1c(5μM)的RF值为0.9，化合物2f(25μM)的RF值为0.9，逆转活性接近于阳性对照FTC(5μM)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。