一种发酵生产高含量多黏菌素B1的方法与流程

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产高含量多黏菌素B1的方法。

背景技术：

多黏菌素B(Polymyxin B，简称PMB)是一种由多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的氨基酸和脂肪组成的碱性多肽类抗生素。多黏菌素B为抗革兰氏阴性菌的抗生素，对大多数革兰氏阴性菌均有较强的抑制或杀菌作用，尤其是绿脓杆菌效果极为显著，对副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等也有较好的杀菌效果。多黏菌素B临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。多黏菌素B通过改变细菌的渗透性从而达到杀菌的目的，并对生长繁殖期和静止期的细菌均有效。

随着抗生素的广泛应用，细菌的耐药性成为全球性医学难题并被WHO作为2011年世界健康日的主题，革兰氏阴性菌的多药耐药性问题突出，多黏菌素作为治疗革兰氏阴性菌引起感染的最后一道防线，其地位尤为重要。

多黏菌素B是一种多组分物质，包括B1、B2、B3及B1-1，其中B1是主要活性组分之一，分子式C56H98N16O13,分子量1204。

多黏菌素B1的结构见下：

专利CN103044529A对多黏菌素B中提取B1组分的方法进行描述，多黏菌素B1组分的产品纯度最高为98.3％；专利CN106868079A的发酵方法获得的成品B1组分的含量在45.9～54.2％。

目前我国多黏菌素B原料药主要依赖于进口，主要是因为微生物发酵过程产生的大多数杂质属于发酵主要产物的结构类似物，因此这些杂质在提取过程很难去除，这是目前多黏菌素B的生产难点。

关于多黏菌素B1的相关研究不多，虽然国内外对多黏菌素的组分有相关要求和质量标准，但除B1和B2之外的其他组分及杂质依然在一定程度上影响药品的作用和效果，B1组分作为多黏菌素B中抗菌活性最高的分子，获得高含量、高纯度的多黏菌素B1意义深远。

技术实现要素：

本发明提供了一种发酵生产高含量多黏菌素B1的方法，该方法采用多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)为生产菌株，该菌株在基础发酵培养基中，通过添加氨基酸组合物，进行有氧发酵的步骤，所述的氨基酸组合物包括L-亮氨酸和L-异亮氨酸。

作为优选，所述基础发酵培养基包括可同化的碳源、可同化的氮源以及无机盐。

优选的实施方案中，上述可同化的碳源优选自面粉、葡萄糖、麦芽糊精、甘露醇之一或上述任何两种或多种物质的组合，优选为面粉。

优选的实施方案中，上述可同化的氮源优选自酵母抽提物、棉籽饼粉、酵母粉、玉米浆、麸质粉、麸皮、铵盐之一或上述任何两种或多种物质的组合，优选为酵母抽提物和硫酸铵的组合。

优选的实施方案中，所述无机盐包括硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、氯化钠、碳酸钙之一或任何两种或多种物质的组合，优选为硫酸铵、磷酸氢二钾和碳酸钙的组合。

优选的实施方案中，上述氨基酸组合物L-异亮氨酸的加入量为0.25～2.00g/L，优选为0.50～1.00g/L，更优选为0.80g/L；上述氨基酸组合物L-亮氨酸的加入量为0.25～2.00g/L，优选为0.50～1.00g/L，更优选为0.80g/L。

进一步优选的实施方案中，上述氨基酸组合物中L-异亮氨酸和L-亮氨酸的加入量均为0.80g/L。

优选的实施方案中，上述氨基酸组合物还包括D-苯丙氨酸。

优选的实施方案中，上述氨基酸组合物D-苯丙氨酸的优选加入量为0～1.00g/L，更优选0.50～0.80g/L。

本发明中所述的g/L是指1L发酵培养基中所添加的相关物质的重量。

优选的实施方案中，上述氨基酸组合物的加入时间为0～48h，更优选为0～24h，更优选为0h，所述氨基酸组合物的加入时间为0h时是指在基础发酵培养基灭菌前加入氨基酸组合物；大于0h是指在基础发酵培养基接种培养一段时间后加入氨基酸组合物，比如氨基酸组合物的加入时间为24h时，是指在基础发酵培养基接种培养24h时加入氨基酸组合物。

优选的实施方案中，所述发酵培养的温度为22～26℃，发酵培养时间为66～72h。

本发明具备以下优点：本发明提供了一种发酵生产高含量多黏菌素B1的方法，本发明通过不同的氨基酸组合和培养基配方，利用有氧发酵提高了多黏菌素B1在发酵产物中的比例，有效提高了多黏菌素B1的提取收率；通过该方法发酵后，多黏菌素B1组分的含量明显提高，最高可达83.01％；本发明的发酵方法有利于降低生产成本和扩大多黏菌素B1组分的应用范围。

附图说明

图1为多黏菌素B标准品中各组分的高效液相色谱图。

图2为对比例1中发酵液中各组分的高效液相色谱图。

图3为实施例8中发酵液中各组分的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅为本发明的一部分。以下对比例及实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

本发明中，所述多黏菌素B产生菌为多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa，本发明的实施例使用的菌种为多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxaATCC10401，购自美国菌种保藏中心。本发明中，所述的物料没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的物料来源即可。

多黏菌素B组分高效液相检测方法：色谱柱采用C18硅胶柱(5μm，4.6×250mm)。缓冲液：溶解4.46g的无水硫酸钠到900ml的水中，使用稀磷酸调节pH至2.3，使用水稀释至1000ml。以乙腈:缓冲液(体积比为20:80)为流动相进行分离，流速1.0ml/min，紫外波长215nm，进样量20μl，柱温为30℃，多黏菌素B1峰的保留时间为40min左右，运行时间为多黏菌素B1保留时间的1.4倍。

本发明中所使用的多黏菌素B标准品为USP REFERENCE STANDARD(生产批号：1547007)，标准品用水-乙腈(80:20)溶解稀释，将标准品用高效液相色谱检测，图谱见附图1，图谱中的峰分别记作1^#,2^#,3^#～22^#；所述B1组分的含量是指：20^#峰面积与1～22^#峰面积之和的比值；对比例1～3及实施例1～9依据此方法标识发酵液中相对应的峰，同时计算B1组分的含量。

制备例1

种子液培养方法：种子培养基每升包括：面粉50g、葡萄糖15g、酵母抽提物3g、三水磷酸氢二钾0.15g、硫酸铵4.5g、碳酸钙3g，消泡剂0.1ml，pH自然，摇瓶采用1L三角瓶装量200ml，经121℃灭菌30min。将生长的新鲜斜面多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa ATCC10401菌种接入种子培养基中，摇床转速250rpm，28℃培养16～18h，种子OD600:18～25，种子液接种量2.5％(体积百分比)。

对比例1

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分基础发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml、余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

发酵液按如下方法检测多黏菌素B1(对比例2～3及实施例1～9中的多黏菌素B1的检测方法与此相同)：

1)发酵液用稀盐酸或稀硫酸调节pH至4.0左右；

2)取发酵液用水稀释5倍,摇匀；

3)超声30min，离心机4000rpm离心15min；

4)取上层水相，以0.22μm水相针式滤膜过滤；

5)过滤后液体通过高效液相色谱仪进行组分检测。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为48.55％，图谱见附图2。

对比例2

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml、L-异亮氨酸0.10g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为43.24％。

对比例3

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml、L-亮氨酸0.10g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为46.37％。

实施例1

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml、L-亮氨酸0.25g，L-异亮氨酸0.25g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为64.27％。

实施例2

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml、L-亮氨酸0.25g，L-异亮氨酸0.80g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为70.78％。

实施例3

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml，L-亮氨酸0.50g，L-异亮氨酸0.50g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为76.42％。

实施例4

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml，L-亮氨酸0.80g，L-异亮氨酸0.50g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为76.38％。

实施例5

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml，L-亮氨酸0.80g，L-异亮氨酸0.80g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为81.00％。

实施例6

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml，L-亮氨酸1.00g，L-异亮氨酸1.00g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为79.82％。

实施例7

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml，L-亮氨酸2.00g，L-异亮氨酸2.00g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为76.02％。

实施例8

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml，L-亮氨酸0.80g，L-异亮氨酸0.80g，D-苯丙氨酸0.50g，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为83.01％，图谱见附图3。

实施例9

将制备例1中制备得到的种子液接入含以下成分基础发酵培养基(以1L计)中：面粉100g、酵母抽提物1g、三水磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵5g、碳酸钙4g、消泡剂0.1ml，余量为水，pH自然，经121℃灭菌30min。温度25℃，250rpm摇床振荡培养至24hr补加下述氨基酸无菌溶液(母液浓度5g/100ml)：L-亮氨酸10ml，L-异亮氨酸10ml，培养72h得发酵液。

将发酵液用高效液相色谱检测，结果B1组分的含量为72.98％。