一种能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽的制备方法及应用与流程

本发明涉及蛋白肽技术领域，具体涉及一种能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽的制备方法及应用。

背景技术：

在新能源发展的今天，乙醇作为一种清洁能源备受关注，然而我国当前乙醇生产中成本、能耗较高而效率低，因此在生产酿造过程中，寻找并应用低碳酿造新技术以提高质量和生产效率、降低生产能耗和成本变得尤为重要、迫切。而超高浓酿造技术由于可在不增加发酵设备的基础上大幅度提高乙醇产量、提高生产效率和降低能耗，而日益受到酿造企业的青睐。但在超高浓酿造过程中，过高的糖度使得发酵初期渗透压较高，这种环境压力会使酵母生长代谢受到影响，并且引起发酵滞缓或停止。因此提高酵母渗透压耐受性变得尤为重要和迫切。然而酵母对渗透压耐受性一直是限制超高浓酿造发展中的一个难点。

距今发现多种生物肽具有如抗高血压、抗血栓、抗氧化抗癌、抗疟疾、抗菌、阿片样活性、降低胆固醇、耐冻、促发酵以及提高免疫调等活性，其中关于小麦面筋蛋白水解物促酵母增殖和发酵的报道启发：小麦面筋蛋白肽用于提高酵母渗透压耐受性的制备探索。此外，目前均未有相关文献报道小麦面筋蛋白肽具有提高酵母渗透压耐受性的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽的制备方法。该制备方法以小麦面筋蛋白为原料，经双螺杆挤压机挤压、均质预处理、酶解、醇沉以及大孔树脂柱层析，制备得到能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽。

本发明的目的还在于提供上述制备方法制得的能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽的应用。上述方法制备的小麦面筋蛋白肽能有效提高酿酒酵母细胞的渗透压耐受性，可有效应用于提高酿酒酵母细胞的渗透压耐受性、高渗透压下的细胞活性、高渗透压下维持酿酒酵母细胞的表观形态或高渗透压下提高酿酒酵母细胞的出芽率。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)小麦面筋蛋白的预处理：将小麦面筋蛋白经双螺杆挤压机挤压后，再加水混合，均质，得到小麦面筋蛋白料液；

(2)小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋蛋白料液加热后，调节体系pH值，再加入蛋白酶，恒温搅拌下进行酶解；酶解完成后，灭酶，冷至室温，离心，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；

(3)小麦面筋蛋白酶解清液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解清液减压浓缩后，加入无水乙醇进行醇沉除去大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉；

(4)柱层析：将小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉溶解于水后装入大孔树脂层析柱，用水洗脱，得到的洗脱液经冷冻干燥，得到所述能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽。

进一步地，步骤(1)中，所述复合改性为双螺杆挤压机挤压的工艺条件为：加入小麦面筋蛋白质量10～20％的水混合后，在螺杆转速150～300r/min下挤压，挤压温度为70～140℃，出料模孔直径5mm。

进一步地，步骤(2)中，经双螺杆挤压机挤压后的小麦面筋蛋白与水的混合质量比为1～4∶10。

进一步地，步骤(2)中，所述加热是加热至40～50℃。

进一步地，步骤(2)中，所述调节体系pH值是调节体系pH值为6.0～9.0。

进一步地，步骤(2)中，所述蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、Alcalase2.4L碱性内切蛋白酶或碱性蛋白酶中的一种。

进一步地，步骤(2)中，所述蛋白酶的加入量为小麦面筋蛋白质量的1～2％。

进一步地，步骤(2)中，所述酶解的时间为12～36h。

进一步地，步骤(2)中，所述灭酶是在95～100℃下加热10～20min。

进一步地，步骤(2)中，所述离心的转速为3000～5000rpm，离心的时间为5～15min。

进一步地，步骤(3)中，所述减压浓缩是在温度40～50℃、真空度0.08MPa～0.1MPa条件下，浓缩2～4h。

进一步地，步骤(3)中，所述无水乙醇加入量为：使无水乙醇与浓缩液的混合液中，乙醇浓度达到70～90wt％。

进一步地，步骤(4)中，所述大孔树脂为型号为AB-8、DA-201E或XAD-16的大孔树脂。

进一步地，步骤(4)中，所述大孔树脂的质量为小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉的质量的10～20倍。

进一步地，步骤(4)中，所述洗脱液为层析柱体积的2～4倍。

由上述任一项所述制备方法制得的能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽应用于提高高浓度或高密度发酵过程中酿酒酵母细胞的渗透压耐受性、细胞活性和出芽率。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明制备方法以小麦面筋蛋白为原料，采用生物酶制剂降解小麦面筋蛋白，使蛋白得以充分释放，然后通过乙醇醇沉使得大分子物质降低，最后结合大孔树脂分离技术进一步使得小麦面筋蛋白肽得到分离富集，从而达到高效富集小麦面筋蛋白肽活性成分的目的；

(2)本发明制备方法操作简单、成本较低，安全性高，具有酶解分离效果好、提取率高的特点；

(3)本发明方法制备的小麦面筋蛋白肽具有提高酿酒酵母耐渗透压的效果，可应用于具有提高酿酒酵母耐渗透压、高渗透压下的细胞活性、高渗透压下维持酿酒酵母细胞的表观形态或高渗透压下提高酿酒酵母细胞的出芽率。

附图说明

图1为实施例1～3不同大孔树脂洗脱制备小麦面筋蛋白肽的得率柱状图；

图2为添加和未添加了实施例1～3制备的小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨醇YNB培养基中细胞生长的曲线图；

图3为添加了与未添加实施例1～3制备的小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨糖醇培养基中酵母细胞活性随时间变化的曲线图；

图4a为未添加小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨糖醇培养基中24h酵母细胞表观形态的SEM图；

图4b为添加了实施例1制备的小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨糖醇培养基中24h酵母细胞表观形态的SEM图；

图4c为添加了实施例2制备的小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨糖醇培养基中24h酵母细胞表观形态的SEM图；

图4d为添加了实施例3制备的小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨糖醇培养基中24h酵母细胞表观形态的SEM图。

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案作进一步详细的描述，但本发明的保护范围和实施方式不限于此。

具体实施例中，酶解清液或醇沉清液中肽的分子量分布情况的测定如下：

将酶解清液或醇沉清夜稀释至1mg/mL的蛋白浓度，采用Waters 600高效液相色谱测定酶解清液和醇沉清液的稀释液中肽的分子量分布情况；凝胶柱型号为：TSk gel G2000SWXL分析柱，洗脱液为磷酸缓冲液(0.04mol/L)，流速设定1mL/min，检测波长为214nm，标准肽样品分别为：谷胱甘肽(307Da)，杆菌肽(1422Da)，牛胰岛素(5800Da)，细胞色素C(12384Da)，白蛋白(43000Da)，伴清蛋白(75000Da)；相对分子质量的对数值与洗脱液体积拟合直线方程为y＝-0.1602x+5.5996(R²＝0.9988)，其中y为标准肽分子量的对数，x为洗脱体积。

具体实施例中，小麦面筋蛋白肽的洗脱得率由如下公式计算得到：

肽得率＝洗脱物总质量/层析物总质量×100％。

实施例1

能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽的制备方法，具体步骤如下：

(1)小麦面筋蛋白的预处理：将小麦面筋蛋白与小麦面筋蛋白质量10％的水混合后，在螺杆转速150r/min下挤压，挤压温度为70℃，出料模孔直径5mm，然后将挤压后的小麦面筋蛋白与水按1∶10(m/m)的比例加水混合，均质，得到小麦面筋蛋白料液；

(2)小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋蛋白料液加热至40℃，调节体系pH值至6.0，加入木瓜蛋白酶(以小麦面筋蛋白质量为计算基准，木瓜蛋白酶添加量为1％)，恒温搅拌酶解12h，然后95℃加热20min灭酶，冷却至常温，3000rpm离心15min，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；

(3)小麦面筋蛋白酶解液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解过滤，滤液于40℃、真空度0.08MPa条件下，浓缩4h，浓缩液加入无水乙醇醇沉(浓缩液与无水乙醇混合成的混合液中，乙醇浓度为70wt％)去除大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉；

(4)柱层析：将小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉溶解于水，通过质量10倍于小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉的AB-8大孔树脂进行柱层析吸附，用水洗脱，洗脱液为层析柱体积的4倍，洗脱液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白肽，记为AB-8。

实施例2

能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽的制备方法，具体步骤如下：

(1)小麦面筋蛋白的预处理：将小麦面筋蛋白与小麦面筋蛋白质量15％的水混合后，在螺杆转速200r/min下挤压，挤压温度为100℃，出料模孔直径5mm，然后将挤压后的小麦面筋蛋白与水按2∶10(m/m)的比例加水混合，均质，得到小麦面筋蛋白料液；

(2)小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋蛋白料液加热至45℃，调节体系pH值至7.0，加入复合蛋白酶(以小麦面筋蛋白质量为计算基准，复合蛋白酶添加量为1.5％)，恒温搅拌酶解24h，然后98℃加热15min灭酶，冷却至常温，4000rpm离心10min，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；

(3)小麦面筋蛋白酶解液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解过滤，滤液于45℃、真空度0.09MPa条件下，浓缩3h，浓缩液加入无水乙醇醇沉(浓缩液与无水乙醇混合成的混合液中，乙醇浓度为80wt％)去除大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉；

(4)柱层析：将小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉溶解于水，通过质量15倍于小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉的DA-201E大孔树脂进行柱层析吸附，用水洗脱，洗脱液为层析柱体积的3倍，洗脱液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白肽，记为DA-201E。

实施例3

能提高酿酒酵母细胞渗透压耐受性的小麦面筋蛋白肽的制备方法，具体步骤如下：

(1)小麦面筋蛋白的预处理：将小麦面筋蛋白与小麦面筋蛋白质量20％的水混合后，在螺杆转速300r/min下挤压，挤压温度为140℃，出料模孔直径5mm，然后将挤压后的小麦面筋蛋白与水按4∶10(m/m)的比例加水混合，均质，得到小麦面筋蛋白料液；

(2)小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋蛋白料液加热至50℃，调节体系pH值至9.0，加入胰蛋白酶(以小麦面筋蛋白质量为计算基准，胰蛋白酶添加量为2％)，恒温搅拌酶解36h，然后100℃加热10min灭酶，冷却至常温，5000rpm离心5min，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；

(3)小麦面筋蛋白酶解液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解过滤，滤液于50℃、真空度0.1MPa条件下，浓缩2h，浓缩液加入无水乙醇醇沉(浓缩液与无水乙醇混合成的混合液中，乙醇浓度为90wt％)去除大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉；

(4)柱层析：将小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉溶解于水，通过质量20倍于小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉的XAD-16大孔树脂进行柱层析吸附，用水洗脱，洗脱液为层析柱体积的4倍，洗脱液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白肽，记为XAD-16。

实施例1～3制备过程中，酶解清液和醇沉清液的肽分子量分布如表1所示。

表1酶解清液与醇沉清液肽分子量分布测定结果

由表1可知，实施例1～3中酶解清液分子量存在显著差异，实施例1分子量显著集中在＞5KDa部分，而实施例2和实施例3主要集中在＜5KDa部分，说明实施例2和实施例3酶解更彻底；实施例1与实施例2～3主要区别在于酶解时间长短，说明酶解时间越长酶解越彻底。

同时，实施例1～3中酶解清液与醇沉清液分子量存在较大差异，醇沉清液大分子部分明显降低，并且醇沉酒精度越高去除大分子物质效果越好，说明通过高浓度乙醇醇沉可以有效去除酶解液中的大分子物质。

实施例1～3制备的小麦面筋蛋白肽的得率如图1所示，由图1可知，实施例1～3之间的主要区别在于大孔树脂不同，实施例1中的大孔树脂AB-8是弱极性，实施例2中的大孔树脂DA-201E是极性，实施例3中的大孔树脂XAD-16是非极性，说明不同极性的大孔树脂对小麦面筋蛋白肽的吸附解析能力具有差异，其中非极性大孔树脂XAD-16的解析能力最优。

耐受性实验

实施例1～3制备得到的小麦面筋蛋白肽提高酵母细胞渗透压耐受性、提高高渗透压培养基中酵母细胞活性及维持酵母细胞表观形态及发芽率的试验如下：

(1)酿酒酵母细胞渗透压耐受性测定：

将培养好的酿酒酵母细胞分别接种在添加0.3wt％小麦面筋蛋白肽和未添加小麦面筋蛋白肽的含1.5M山梨醇的无氨基酵母氮源培养基(YNB培养基)中，通过紫外分光光度计在OD600检测不同时间酵母生长曲线。

添加了和未添加实施例1～3制备的小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨醇YNB培养基的细胞生长随时间变化的曲线图如图2所示，由图2可知，未添加组和实施例1～3得到的小麦面筋蛋白肽添加对酵母渗透压耐受性的提高具有显著差异；其中，结合表1可知，实施例1～3得到的小麦面筋蛋白肽的主要区别在于肽分子量分布不同，实施例1中的大分子量小麦面筋蛋白肽含量远高于实施例2～3，且实施例2和实施例3中分子量分布差别不大，但添加实施例1～3制备的小麦面筋蛋白肽均能提高酵母细胞渗透压耐受性，这说明在高渗透压培养基中加入小麦面筋蛋白肽可以提高酵母细胞渗透压耐受性。

(2)高渗透压下酿酒酵母细胞活性测定：

将培养好的酿酒酵母细胞分别接种在添加0.3wt％小麦面筋蛋白肽和未添加小麦面筋蛋白肽的含1.5M山梨醇的无氨基酵母氮源培养基中，通过次甲基蓝检测不同时间下酵母的细胞活性。

添加了与未添加实施例1～3制备的小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨糖醇培养基中酵母细胞活性随时间变化的曲线图如图3所示，由图3可知，未添加组的细胞活性明显低于添加组的细胞活性，并且实施例3中细胞活性最好，这表明采用制得的小麦面筋蛋白肽添加到高渗透压培养基中可以提高酿酒酵母的细胞活力。

(3)酵母细胞表观形态的测定：

将培养好的酿酒酵母细胞分别接种在添加0.3wt％小麦面筋蛋白肽和未添加小麦面筋蛋白肽的含1.5M山梨醇的无氨基酵母氮源培养基中，通过扫描电镜观察培养24h酵母细胞的表观形态及出芽率。

添加了与未添加实施例1～3制备的小麦面筋蛋白肽的1.5M山梨糖醇培养基中24h酵母细胞表观形态如图4a～图4d(其中，白色箭头指示出芽细胞)所示，由图4a～图4d可知，未添加组(如图4a)的细胞受损程度明显高于添加组的细胞受损程度，并且实施例3(如图4d)中细胞表观形态维持最好；同时，从图4a～图4d可知，未添加组出芽率最低，其次依次是添加实施例1(如图4b)和实施例2(如图4c)肽组，出芽率最高的是实施例3肽添加组，这表明采用制得的小麦面筋蛋白肽添加到高渗透压培养基中不仅可以维持酵母的表观形态，还能提高酵母出芽率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。