专利名称：一种植物耐逆相关蛋白及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物耐逆相关蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
干旱和盐胁迫是影响植物生长最严重的逆境胁迫因子，是我国农作物产量和播种面积的首要限制因素。脯氨酸是植物在逆境胁迫下积累的渗透胁迫物质，起到调节细胞渗透压、保护蛋白质分子、作为活性氧的清除剂等作用，以维持植物的正常生长。植物积累脯氨酸能力的高低，决定了植物抗逆性的强弱。在植物体内，脯氨酸的合成通过鸟氨酸/精氨酸和谷氨酸两个途径，在逆境胁迫下，谷氨酸途径是合成脯氨酸的主要途径。Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CQ是谷氨酸途径中的限速酶，它是一个双功能酶，具有谷氨酸激酶和谷氨酶-Y -半醛脱氨酶活性，催化脯氨酸合成的前2步反应，同时它又可以被产物脯氨酸反馈抑制。羊草又名碱草，是欧亚大陆草原区东部草甸草原重要建群种之一。羊草是一种高产、适口性好的牧草，耐盐碱，但不耐涝或严重干旱，培育高抗逆性羊草，无疑会带来巨大的经济效益和生态效益。植物的抗旱、耐盐碱性状是多基因控制的数量性状，给通过杂交育种提高作物的抗逆性带来很大困难，因此可通过基因工程来改良作物的抗逆性。通过转基因增加植物P5CS基因的表达量，从而提高植物积累脯氨酸的能力，是培育抗旱、耐盐碱植物的一条有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐逆(抗旱、耐盐)相关蛋白Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶及其编码基因和应用。本发明提供的植物耐逆相关蛋白(LcP5CSl)，是一种Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶， 来源于羊草(Leymus chinensis (Trin. ) Tzvel.)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且参与脯氨酸合成的由序列1衍生的蛋白质。序列表中序列1由730个氨基酸残基组成，自氨基末端第21位-第295位氨基酸残基为AAK_super family的保守结构域，自氨基末端310位-710位为ALDH-SF super family的保守结构域，自氨基末端第22位-第730位氨基酸残基为P5CS Multi-domain序列。为了便于LcP5CSl的纯化，可在由序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基端或羧基端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的LcP5CSl可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的LcP5CSl的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5' 端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码上植物耐逆相关蛋白的基因(LcP5CSl)也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5'末端第3-2195位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中的序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下可与1)或2、限定的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。序列表中的序列2由2197个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第 3-2195位核苷酸。上述严格条件可为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗膜。含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体(如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、 PCAMBIA3301、pCAMBIA1301_UbiN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子⑴biquitin)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。含有以上任一所述基因(LcP5CSl)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。扩增上述基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种均可应用于培育耐逆植物。本发明的另一个目的是提供一种培育抗盐、耐旱转基因植物的方法。本发明所提供的培育抗盐、耐旱转基因植物的方法，可将编码上述Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶的基因(LcP5CSl)导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得抗盐、耐旱性增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如烟草、苜宿、拟南芥、水稻、小麦、 玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草等。本发明提供的蛋白及其编码基因，是植物在逆境胁迫下合成脯氨酸的限速酶。将本发明的基因导入植物，提高植物的脯氨酸的积累量从而提高植物的抗逆性，特别是干旱和高盐胁迫可强烈诱导该基因的表达，通过转基因手段提高作物△ L吡咯琳-5-羧酸合成酶表达量，可提高作物和草类的抗逆性，有助于提高作物产量、扩大播种面积和实现草原生态系统的健康持续发展。本发明提供的蛋白及其编码基因对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要实用价值。本发明有助于了解植物在渗透胁迫下积累脯氨酸的作用机理，为揭示脯氨酸积累机制对植物维持正常生长发育和抗逆性的调节功能、为提高作物产量与改良品质的基因工程研究提供遗传学依据。
图1为羊草幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；图2为PCR扩增LcP5CSl全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；图3为LcP5CSl的系统进化树；图4为LcP5CSl基因在盐胁迫处理条件下的响应模式(半定量RT-PCR)；图5为LcP5CSl基因在干旱处理条件下的响应模式(半定量RT-PCR)；图6为羊草在盐胁迫下脯氨酸的积累量；图7为羊草在干旱胁迫下的脯氨酸的积累量；图8为重组载体pSm301_LcP5CSl的PCR鉴定；
图9为重组载体PSm301-LcP5CSl的双酶切鉴定；图10为转化农杆菌后农杆菌阳性转化子PCR鉴定结果；图11为转基因拟南芥PCR鉴定结果；图12为高盐Q50mM NaCl)处理3天后转化LcP5CSl的拟南芥和野生型拟南芥的
表型；
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。羊草(吉生一号)2005年9月购自吉林省吉生羊草良种站实施例1、羊草植物耐逆相关蛋白(Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶)及其编码基因的获得一、羊草植物耐逆相关基因LcP5CSl的克隆1、植物材料处理及总RNA的提取以250mM NaCl处理12h羊草(吉生一号)幼苗，具体方法为将正常生长8周的羊草(吉生一号)幼苗进行盐胁迫处理。用250mM NaCl水溶液浸根，室温培养，取处理12h羊草(吉生一号)幼苗为材料， 提取总RNA，进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为^S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。2、植物耐逆相关基因的克隆根据本实验室高通量测序结果，结合已公开的植物Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶的氨基酸残基序列寻找保守区域，根据保守区域序列设计引物，具体的引物序列如下Sl 5' -GAATGGGCAGGGGTGGCAT-3‘；S2 5' -CCTCATTGCAAAGGAAGATCC-3‘。以步骤1提取羊草幼苗的总RNA为模板，用Primekript 1st Strand cDNASynthesized Kit试剂盒(Takara公司)并参照试剂盒说明书，反转合成第一链 cDNAo 反应体系及反应条件如下:01igo-dT(10pmol/y 1)1.0 μ 1、dNTP Mixture (IOmmo 1/ leach) L 0μ 1、Total RNA ( ^ 1 μ g) L 0μ 1、RNase-free water7. 0 μ 1,65 °C 5min ；然后力口 5 X Buffer 4·0μ1、RNase Inhibitor (40U/μ 1) 0· 5 μ 1、PrimeScript RTase (200U/ μ 1)0. 5μ 1，42°C 45min,70°C 15min，将合成的第一链 cDNA 贮存于 _20°C备用。以获得的第一链cDNA为模板，用Sl和S2组成的引物对进行PCR扩增；PCR反应体系为:cDNA 模板、Sl 与 S2 各 1 μ l(10umol/l)，IOXBuffer 2. 5 μ l，dNTP Mixture (IOmmo 1/ leach) 2 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，ddH20 12. 25 μ 1 ；反应条件为先 94 °C 预变性 5min ；然后 940C 30s, 550C 30s, 72°C 2min 30s，共；35 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。反应结束后，对PCR扩增产物进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。 图2中，泳道M为DL2000P1US DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)，泳道1 为PCR扩增产物。结果表明，经PCR扩增获得了长度约为2200bp的目的片段。回收并纯化 PCR产物，将其连接到PMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，对测序结果进行BLAST分析。测序结果如序列2所示，经分析表明，该片段长2197bp，编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列1所示的蛋白质命名为LcP5CSl (由730个氨基酸残基组成)，将LcP5CSl 的编码基因命名为LcP5CSl，其全长cDNA如序列表的序列2所示。实施例2、LcP5CSl和LcP5CSl的生物信息学分析一、LcP5CSl基因的序列分析及其编码蛋白的结构功能预测利用DNAMAN和OMIGA软件对LcP5CSl的全长cDNA序列进行生物信息学分析，该序列全长2197bp，自5'端第3位-第2195位为0RF。推测其分子量为78. 887kDa，等电点pi 值 6. 69。用在线 BlAST 工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析 LcP5CSl 的结构域，结果表明，该蛋白属于P5CS Multi-domain，表明该蛋白是P5CS家族中的一员。二、LcP5CSl与其它P5CS类蛋白序列的同源性及系统进化树分析利用在线Blast工具对LcP5CSl与植物中其它已克隆的P5CS氨基酸序列 (GeneBank 登陆号为TaP5CS 分另Ij 为 AAX!35536，SbP5CSlACU65226, SbP5CS2ACU65227, 0sP5CSl BAA19916, ZmP5CS ABI21839, AtP5CSlNP181510, AtP5CS2NP191120， BnP5CSAAAK01360, BnP5CSB AAKO1361, TomPROl AAB67877, TomPR02 Q96480, EcGPK YP539318进行同源性分析比对，见图3。结果如图3，表明LcP5CSl与单子叶植物高粱SbP5CSl的同源性分别为87%;而与其它单子叶P5CS双子叶的P5CS同源性较低。进化树分析表明，P5CS类蛋白在进化过程中出现了较大的差异，单子叶的P5CS聚为一类，双子叶植物中除番茄的TomPROl与原核生物大肠杆菌的EcGPK同源性较近外，其它的双子叶P5CS也聚为一类。实施例3、LcP5CSl在干旱和盐胁迫条件下的表达模式分析将正常生长8周的羊草(吉生一号)幼苗进行不同处理。第一组(盐胁迫处理)用250mM NaCl水溶液浸根，室温培养；分别取处理0，l，2，4，8，12，24，48h的处理材料叶片，迅速保存于液氮中。第二组(干旱胁迫处理)停止供水，室温培养；分别取断水处理0，1，2，3，4，5，6d的羊草幼苗叶片，迅速冻于液氮中。提取上述两组处理过的羊草幼苗的总RNA，进行RT-PCR。LcP5CSl 引物1 :5' -GTCGGCACCGCTATTGTC-3‘；2:5' -GCCAAACTGTCGTTATCCC-3 ‘；内参 Actin 引物1 :5' -TGGACTCTGGTGATGGTGTGAG-3‘；2:5' -GTGCTAAGGGAGGCAAGGATG-3‘。内参反应条件-MV 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 26 个循环。LcP5CSl 反应条件94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 30 个循环。结果见图4、图5。结果表明，LcP5CSl转录水平明显受干旱和盐胁迫诱导，在诱导条件下，LcP5CSl基因的相对表达量迅速增加。实施例4、LcP5CSl的功能验证(测定其产物脯氨酸的含量)干旱、盐胁迫下脯氨酸含量测定，以确定在干旱和盐胁迫下LcP5CSl表达量的增高和脯氨酸含量的关系，从而验证脯氨酸的含量是否与LcP5CSl的表达量相关。干旱、盐胁迫的具体方法同实施例3。1.脯氨酸提取取0.05-0. 5g胁迫处理后不同时间点羊草叶片，用3%磺基水杨酸溶液研磨提取，磺基水杨酸的最终体积为5ml。勻浆液转入玻璃离心管中，在沸水浴中提取 IOmin0冷却后，以3000r/min离心lOmin，取上清液待测。2.含量测定1)标准曲线制作在l-10ug/ml脯氨酸浓度范围呢制作标准曲线.取标准溶液各anl，加入aiil 3%磺基水杨酸，2ml冰乙酸和細1 2. 5%茚三酮溶液，置沸水浴中显色 60min.冷却后，加入細1甲苯萃取红色物质.静置后，取甲苯相测定520nm波长处的吸收值，依据脯氨酸量和相应吸收值绘制标准曲线。2)样品测定取2ml上清液，加入2ml水，再加入冰乙酸等显色试剂，同标准曲线程序进行显色，萃取和比色。结果如图6、7表明，在胁迫处理后，植物体内脯氨酸含量升高，并且脯氨酸含量的增高在P5CS表达量增高之后，证明提高LcP5CSl表达量可增加植物体内脯氨酸含量，说明 LcP5CSl是逆境胁迫下脯氨酸合成的关键酶。实施例5、LcP5CSl转基因拟南芥的获得将上述实施例1扩增得到的LcP5CSl基因以含有KpnI和BamHI的引物LcP5CSSN 1301-s (5，-CGGGATCCATGGGCAGGGGTGGCAT-3 ’)和 LcP5CSSNl30 l_r (5 ’ -GGGGTACCTCATTGCAAA GGAAGATCCT-3，)扩增后克隆入载体PMD18-T (TaKaRa公司)，PCR扩增条件为94°C预变性 5min ；然后 94°C 30s，58°C 30s，72°C 2min 30s，共；35 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。鉴定后阳性菌液提质粒，用KpnI和BamHI双酶切，插入到经同样酶切的植物表达载体pSm301 (购自CAMBIA公司)的KpnI和BamHI酶切位点间，将得到的重组载体命名为pSm301_LcP5CSl。 用引物 LcP5CSSm301-s 和 LcP5CSSN1301_r 对pSm301_LcP5CSl 进行 PCR鉴定，反应条件同上，结果如图8所示，泳道M为为DL2000P1US DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)，泳道1、3、4、5、7、8、9、10为鉴定正确的重组质粒。用恥111和BamHI对pSN1301_LcP5CSl 进行双酶切鉴定，结果如图9所示，其中，泳道M为DL2000Plus DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)，经酶切获得一条2000bp左右的条带，证明目的片段已正确连接入植物表达载体中。重组载体pSm301_LcP5CSl导入到农杆菌EHA105株系(购自美国Clontech公司， 商品目录号K1612-1)中，PCR筛选阳性重组子，引物与反应条件同上，结果如图10所示，图 10中，泳道M为DL2000P1US DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)，泳道1、2、 3、5为阳性重组子PCR结果。拟南芥种子(Columbia生态型，来源于法国农科院凡耳赛研究中心世界拟南芥种子库)用75%乙醇消毒aiiin，〗1^ NaClO灭菌15min后，播种于MS培养基，光照培养3天后，将小苗移至营养土 蛭石=1 1的土壤中，待大部分植株都抽苔之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约1周后在腋芽部位长出4-6个新生侧苔， 待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成1-2个角果时，便可用于转化。IOmL管添加YEB液体培养基2mL，并添加筛选抗生素利福平和卡那霉素各50mg/L。挑取农杆菌单菌落接种于管中，28°C 200rpm摇菌。当天晚间转接于含同样浓度抗生素的YEB液体培养基50ml的三角瓶中，28°C摇菌过夜。第二天转入250ml含有抗生素的YEB液体培养基中摇菌至OD 600 在1. 2左右，转入离心管中，室温5000rmp离心5min。弃上清，将沉淀转入含3 %的蔗糖和0. 1% Selwert (Sigma公司)的蒸馏水中，使其0D600在0. 8左右。将野生型植株花序浸泡于转化菌液中20秒，保鲜膜包裹，避光保存过夜后揭膜，正常养护。得到种子后灭菌，播种于含有20mg/L的潮霉素的MS筛选培养基上，筛选阳性转基因苗，将这些苗移至土壤中，生长10天后对转基因植株进行PCR检测，反应条件与引物同上，结果如图11所示，泳道M为 DL2000Plus DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)，泳道2、5、6、7、8、9、10、12 为获得的8个阳性转基因植物株系PCR鉴定结果。获得的阳性转基因植物自交得到T2代种子。实施例6、LcP5CS转基因拟南芥的抗逆性实验将野生型拟南芥种子(对照(Columbia生态型，来源于法国农科院凡耳赛研究中心世界拟南芥种子库))和实施例5获得的LcP5CSl转基因拟南芥T2代种子分别播种于MS 培养基中，三天后将小苗移至土中，在温室培养一周后进行盐胁迫处理Q50mM NaCl)，三天后观察表型。结果转基因拟南芥经盐处理三天后没有死亡，结果如图12左图；而野生型已经完全萎蔫死亡，结果如图12右图。上述实验结果表明本发明的LcP5CSl可以增强植物的抗逆能力，从而可以作为植物基因工程的候选基因加以应用，用来改良植物的抗逆性状。
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)所述蛋白相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的 DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码ΔL吡咯琳-5-羧酸合成酶的DNA 分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码ΔL吡咯琳-5-羧酸合成酶的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在培育耐逆植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述耐逆为耐旱和/或耐盐。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物；所述目的植物为拟南芥、烟草、百脉根、水稻、小麦、 玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿、大豆、棉花或羊草。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。
全文摘要
本发明公开了一种植物Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且参与脯氨酸合成的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供的蛋白及其编码基因，可以调控植物脯氨酸的合成，受盐和干旱胁迫诱导，参与羊草对盐和干旱胁迫的响应。将本发明的基因导入植物，可以提高植物的抗逆性。本发明提供的蛋白及其编码基因对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要实用价值。
文档编号C12N15/11GK102373187SQ20111002555
公开日2012年3月14日 申请日期2011年1月24日 优先权日2010年8月11日
发明者刘公社, 李晓峰, 苏蔓, 陈双燕, 齐冬梅 申请人:中国科学院植物研究所