一种基于芘的比率型荧光探针及其制备方法和生物应用与流程

本发明属于荧光探针的合成技术领域，具体涉及一种基于芘的比率型荧光探针及其制备方法和生物应用，该探针应用于生物体内亚硫酸氢根的检测。

背景技术：

现代人类活动如矿物质燃烧和加工会产生大量的二氧化硫（SO2）,对生态环境和人体健康造成了威胁。人体吸入SO2就会在体内生成HSO3^-和SO3^2-。亚硫酸盐因为能够抑制氧化、微生物生长和酶促反应等特性被广泛应用于食品、饮料和医药等行业。但是亚硫酸过量会引起一些疾病，如过敏反应、哮喘及心血管和神经系统疾病等。WHO规定每人每日亚硫酸盐的允许摄入量为0-0.7mg/Kg(以SO2计)。因此发展一种方便快速检测亚硫酸盐的方法是十分必要的。

目前已经存在的亚硫酸盐检测方法有色谱法、传感器法、电化学法、毛细血管电泳和酶技术联用等。但这些方法有很大的局限性，如仪器昂贵、处理复杂、费事等，不利于检测。相反荧光光谱检测技术具有快速实时响应、分辨率高、灵敏度高、操作简便等优点，且比率型荧光探针可以克服一些环境因素如pH的变化，荧光自淬灭和背景信号的干扰。芘由于可以在准分子和单体之间转变经常被用来设计比率荧光探针，而且其具有优良的光学性质，如荧光量子产率高，单重态寿命长，吸收系数大，化学稳定性好等。通过激光共聚焦显微镜进行荧光成像，可实现生物体内亚硫酸盐的检测。因此，这就迫切需要合成具有简单、灵敏度高、选择性好、检出限低、光稳定性好的荧光探针用于检测生物样品的HSO3^-。

技术实现要素：

本发明为了解决现有荧光探针检出限高、光稳定性差等问题，提供了一种基于芘的比率型荧光探针及其制备方法和生物应用，用于生物体内HSO3^-检测及成像。该探针具有响应快、灵敏度高、选择性高、检出限低和光稳定性好等优点。并且成功应用于细胞、线虫和斑马鱼内的HSO3^-的检测。

本发明由如下技术方案实现的：一种基于芘的比率型荧光探针，该荧光探针为1-（芘-1-基）-3-（4,5-二溴噻吩-2-基）丙烯酮，其化学结构式如下：。

一种制备所述基于芘的比率型荧光探针的方法，以芘为起始原料，与无水三氯化铝、乙酰氯按照摩尔比为4:5:7的比例反应获得1-乙酰基芘，将获得的1-乙酰基芘与4,5-二溴噻吩-2-甲醛按摩尔比为3:4的比例混合溶解，然后加入10%的NaOH溶液室温搅拌反应，获得1-（芘-1-基）-3-（4,5-二溴噻吩-2-基）丙烯酮。

具体步骤如下：

（1）制备1-乙酰基芘：干燥条件下将芘与二氯甲烷按照1mmol:10ml混合，搅拌溶解，干燥条件下加入无水三氯化铝；冰水浴下将乙酰氯滴加入二氯甲烷中，滴加速度控制为3-5秒一滴，乙酰氯与二氯甲烷的比例为7mmol:10ml；然后将乙酰氯溶液滴加入芘与无水三氯化铝溶液中，撤掉冰水浴，室温下搅拌反应12h，TLC跟踪反应，展开剂为二氯甲烷与石油醚体积比为1:2，溶液颜色由墨绿色变为深绿色反应结束，将反应液倒入冰水中搅拌分液，水相采用二氯甲烷萃取2次，合并有机相，再用水萃取2次，无水硫酸镁干燥，静置过夜，过滤，水浴蒸发去除溶剂，硅胶柱层析分离产物，得到淡黄色1-乙酰基芘；

（2）制备荧光探针：干燥条件下将步骤(1)制备的1-乙酰基芘与4,5-二溴噻吩-2-甲醛混合，按照1-乙酰基芘与乙醇的比例为3mmol:50ml加入无水乙醇搅拌至完全溶解，溶液为浅黄色，再加入10%的NaOH溶液，NaOH溶液与1-乙酰基芘的比例为1ml：1mmol，室温搅拌反应9-12h，反应过程中补加无水乙醇，补加量为初始加入无水乙醇量的1.5-2倍，反应完成后析出黄色沉淀，抽滤，无水乙醇洗涤滤饼3次，真空干燥后无水乙醇重结晶得到荧光探针。

步骤（1）中硅胶柱层析时先用体积比为二氯甲烷：石油醚=1：3作为洗脱剂洗脱将芘分离除去，然后用体积比为二氯甲烷：石油醚=1：1作为洗脱剂分离获得1-乙酰基芘。步骤（2）中TLC跟踪检测反应，体积比为乙酸乙酯：石油醚=1:15的溶液作展开剂。

本发明还提供了所述的基于芘的比率型荧光探针在HSO3^-的定量检测过程中的应用。该荧光探针在生物体内HSO3^-的检测中的应用。

本发明所述荧光探针的合成路线如下：

。

本发明提供定量荧光检测HSO3^-的方法，其步骤为：

（1）用DMSO配制1 mM的荧光探针储备液；

（2）将2.0 mL水/无水乙醇（9/1,v/v）体系以及20.0 µL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上进行滴定实验，随着HSO3^-的加入，420处的荧光强度逐渐增强，530 nm处的荧光强度逐渐减弱；

(3) 以HSO3^-浓度为横坐标，以荧光比值I420/I530为纵坐标绘制图，得到HSO3^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：I420/I530 = 0.18*[HSO3^-]+0.77，HSO3^-浓度的单位为10^-6 mol/L；线性相关系数为R² = 0.9881，最佳线性响应范围为0 µM - 35 µM，检出限（LOD）为0.77µM。

时间响应实验证明荧光探针具有良好的光稳定性，且对HSO3^-响应时间短，经实验验证，常见阴离子不干扰体系对HSO3^-的测定。本发明的荧光探针通过结合荧光共聚焦显微镜成像技术，证明了可用于检测细胞、线虫和斑马鱼内的HSO3^-。

与现有荧光探针相比，本发明合成的荧光探针具有以下优点：本发明的荧光探针合成步骤简单，成本低廉且光稳定性好。检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现。荧光对HSO3^-响应具有时间短、选择性好、灵敏度高、检出限低等优点。比率型荧光探针有效的消除了环境因素的干扰。该探针可用于细胞、线虫及斑马鱼体内亚硫酸盐的检测。

附图说明

图1为实施例2荧光探针随HSO3^-变化的紫外吸收光谱图；图2为实施例3 荧光探针随HSO3^-变化的荧光滴定图；图3为实施例3荧光探针对HSO3^-响应的工作曲线；图4为实施例4 荧光探针对常见阴离子的响应情况；图5为实施例5人肺腺癌细胞（A549）成像图，图中：A1和B1为明场成像图，A2和B2为蓝色通道成像图，A3和B3为黄色通道成像图；图6为实施例6线虫成像图，图中：A1、B1、C1和D1为明场成像图，A2、B2、C2和D2为蓝色通道成像图，A3、B3、C3和D3为黄色通道成像图；图7为实施例7斑马鱼成像图，图中：A1、B1和C1为明场成像图，A2、B2和C2为蓝色通道成像图，A3、B3和C3为黄色通道成像图。

具体实施方式

实施例1：一种基于芘的比率型荧光探针，该荧光探针为1-（芘-1-基）-3-（4,5-二溴噻吩-2-基）丙烯酮，其化学结构式如下：。

制备所述基于芘的比率型荧光探针的方法，以芘为起始原料，与无水三氯化铝、乙酰氯按照摩尔比为4:5:7的比例反应获得1-乙酰基芘，将获得的1-乙酰基芘与4,5-二溴噻吩-2-甲醛按摩尔比为3:4的比例混合溶解，然后加入10%的NaOH溶液室温搅拌反应，获得1-（芘-1-基）-3-（4,5-二溴噻吩-2-基）丙烯酮。

具体步骤如下：

（1）1-乙酰基芘的合成：向配有磁力搅拌的干燥的100mL单口圆底烧瓶中，加入1.00g（4mmol）芘和40mL二氯甲烷，搅拌溶解（溶液变为淡黄色），然后迅速加入约0.67g（5mmol）无水三氯化铝并加装干燥管，冰水浴下，缓慢滴加0.5 mL（7mmol）乙酰氯溶于10 mL二氯甲烷溶液（滴加速度最好控制在3-5秒一滴），约1h滴完，然后撤掉冰水浴，室温下继续搅拌反应12h，TLC跟踪（V二氯甲烷：V石油醚=1：2），溶液颜色由墨绿色变为深绿色，反应结束后倒入100mL冰水中，充分搅拌，分液，水相用50 mL二氯甲烷萃取两次，合并有机相，用50mL水萃取两次，无水硫酸镁干燥，静置过夜，过滤，水浴蒸发绝大多数溶剂，梯度洗脱法进行柱层析分离。先用二氯甲烷：石油醚（1 : 3, V/V），将芘分离出去，然后换用二氯甲烷：石油醚（1:1, V/V），分离可得淡黄色1-乙酰基芘0.86 g，产率88.02%，经熔点测定为86-87 ℃。I.R.νmax/cm-1(KBr压片)：2982.7（C-H），1677.7（C=O），1461.9（C-H），848.6（苯环），682.8（Ar-H）。

（2）荧光探针1-（芘-1-基）-3-（4,5-二溴噻吩-2-基）丙烯酮的制备：在一个干燥的100mL的单口烧瓶中加入0.7325g（3mmol）1-乙酰基芘和1.0897g（4mmol）4,5-二溴噻吩-2-甲醛,用50mL无水乙醇搅拌40分钟完全溶解（隔空加热）为浅黄色溶液，加入3mL NaOH（10%）溶液，室温下搅拌反应约10h(析出大量黄色沉淀)，反应过程中共补加乙醇约90mL，TLC跟踪（V乙酸乙酯：V石油醚=1：15），反应结束后抽滤，用无水乙醇洗涤滤饼三次，真空干燥得粗产物1.4108g；无水乙醇重结晶得黄色粉末状产物0.9919g，产率66.63%。

荧光探针用¹H NMR表征，结果如下：¹H NMR (600MHz, DMSO-d6, δ/ppm): 8.64 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.46 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.44~8.40 (m, 3H), 8.36~8.34 (m, 2H), 8.30 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.19~8.16 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.75~7.72 (t, J = 7.8 Hz, 2H)，7.51(d, J =15.7 Hz, 1H).

¹³C NMR (150MHz, DMSO-d6, δ/ppm): 194.04, 141.49, 136.16, 134.62, 133.55, 133.14, 131.15, 130.54, 129.89, 129.75, 129.20, 127.74, 127.39, 127.33, 127.00, 126.65, 124.96, 124.78, 124.67, 124.47, 123.99, 115.70, 115.65.

实施例2 荧光探针的HSO3^-变化的紫外吸收光谱图

在2.0 mL水/无水乙醇（9/1,v/v）的体系中加入20.0 µL荧光探针储备液进行HSO3^-紫外滴定实验，并记录其紫外吸收光谱(图1)。随着HSO3^-量的增加，在332 nm和411 nm处的紫外吸收均下降。

实施例3荧光探针随HSO3^-变化的荧光滴定图

在2.0 mL水/无水乙醇（9/1,v/v）的体系中加入20.0 µL荧光探针储备液进行HSO3^-荧光滴定实验，在荧光分光光度仪上检测，随着HSO3^-的增加，530nm处的荧光强度逐渐减弱，在420nm处出现一个新峰并逐渐增强（图2）。仪器参数: 激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0 nm、10 nm，电压为600 V，荧光探针溶液的最大激发波长为：λex为366nm和最大发射波长为λem530nm。以荧光比值I420/I530为纵坐标绘制图，得到HSO3^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：I420/I530 = 0.18*[HSO3^-]+0.77，HSO3^-浓度的单位为10^-6 mol/L；线性相关系数为R² = 0.9881，最佳线性响应范围为0 µM-35 µM，检出限（LOD）为0.77µM（图3）。

实施例4 荧光探针对常见阴离子的响应情况

在2.0 mL水/无水乙醇（9/1,v/v）的体系中加入20.0 µL荧光探针储备液，再分别加入其它阴离子（F^-、Cl^-、Br^-、I^-、CO3^2--、NO3^-、SO4^2-、AcO^-、SCN^-、CN^-、SO3^2-、S2O3^2-、S^2-、HS^-），使其最终浓度为100 µM, 再加入HSO3^2-，使其最终浓度为10.0 µM，分别测其荧光光谱，绘制不同阴离子对应荧光强度比值I420/I530的柱状图。经试验验证，其它阴离子不干扰体系对HSO3^-的检测（图4）。

实施例5人肺腺癌细胞（A549）成像图

A549细胞培养在含有12%胎牛血清和1%抗生素的DEME培养基中，置于5%的CO2培养箱里，使用前把它置于6孔板中，贴壁生长24小时。将两个孔板中的培养液抽出，并用pH =7.40的PBS缓冲液洗涤，然后向两个孔板中加入含有20.0μL探针（1mM，用DMSO溶解）的2.0 mLPBS（pH 7.40）缓冲溶液孵育15min左右，后抽出，在用pH =7.40的PBS缓冲液洗涤三次。向其中一个孔板中加入含有20.0µL（1×10^-2M）HSO3^- 的2.0 mL pH = 7.4的PBS缓冲溶液孵育30 min 左右，后抽出，再用pH = 7.40的PBS缓冲溶液进行洗涤。最后将只孵过探针和孵过探针又孵过亚硫酸盐的细胞分别置于培养皿中加入 2.0 mL pH = 7.40的PBS溶液在激光共聚焦显微镜下观察。固定激发波长为405nm,收集发射波段为蓝色通道（405-490nm）和黄色通道（500-600nm）。从图5可看出，在只加入探针时，细胞内呈现较强黄色荧光和微弱的蓝色荧光（A1-A3），加入HSO3^-后黄色减弱，而蓝色荧光增强（B1-B3）。

实施例6秀丽隐杆线虫成像图

在50℃将NGM倒入3个培养皿中，并分别添加探针（10µM）、硫代硫酸钠/谷胱甘肽（1mM/0.5mM）和亚硫酸氢根（100µM）。待冷却凝固后接种大肠杆菌孵育两小时。取3-5条线虫在含有硫代硫酸钠和谷胱甘肽的培养基中孵育过夜，然后转移至含有探针的培养基中继续孵育2小时，用NGM缓冲液清洗三次后成像。取4-8条线虫在探针的培养基孵育2小时后一半用NGM缓冲清洗后于成像，另一半转移至含HSO3^-的培养基上继续孵育两2小时后成像。固定激发波长为405nm，收集发射波段为蓝色通道（405-490nm）和黄色通道（500-600nm）。如图6，线虫本身无荧光（A1-A3），然而，孵过探针后，黄色通道荧光较强，蓝色通道荧光较弱（B1-B3）。当进一步用亚硫酸盐（C1-C3）或硫代硫酸钠/谷胱甘肽（D1-D3）孵过后，黄色荧光减弱，蓝色荧光增强。

实施例7 斑马鱼成像图

斑马鱼在E3培养基中培养并保持在28℃，5天龄的斑马鱼在含20µM探针的培养液中孵育1h后，部分用于成像，另一部分在含HSO3^-（200µm）的培养液中进一步孵育1h，斑马鱼在成像前用PBS缓冲液漂洗三次。固定激发波长为405nm，收集发射波段为蓝色通道（405-490nm）和黄色通道（500-600nm）。如图7，斑马鱼本身无荧光（A1-A3）；孵过探针后，在黄色通道荧光较强，在蓝色通道荧光较弱（B1-B3）。当进一步用HSO3^-孵过后，黄色荧光减弱，蓝色荧光增强（C1-C3）。