本发明涉及一种与鸡屠体性状相关的snp标记及其应用、检测引物、检测试剂盒，属于生物育种技术领域。
背景技术：
在家禽生产中，鸡的屠体性状是重要的经济性状，其能够反映鸡生长速度和产肉性能，因此，研究鸡的屠体性状具有重要的经济价值。
在相同的饲养环境条件下，影响鸡个体间12周龄体重和屠体性状差异的主要原因是遗传因素。目前，发现共计有分布在18条染色体上的41个数量性状基因座与12周龄体重相关，分布在22条染色体上的67个数量性状基因座与屠体重相关。但是大部分报道中这些数量性状基因座的置信区间比较大，很难通过图谱鉴定到影响12周龄体重和屠体性状的致因突变。因此，探讨影响12周龄体重和屠体性状的遗传结构具有重要的经济价值和生物学意义。
因此，为了鉴定表型和基因型之间的遗传联系，准确测定后备种鸡的基因型，以方便对12周龄体重和屠体性状进行早期选择，进而能更好地服务于家禽育种，节省生产成本，有必要研究开发新的遗传标记。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鸡屠体性状相关的snp标记，该标记与鸡的生长性能及屠体性状相关性高。
本发明还提供了上述snp标记的应用。
本发明还提供了一种用于检测鸡屠体性状的检测引物及检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种与鸡屠体性状相关的snp标记，其核苷酸序列如seqidno.1所示，5’端起第427位为g或a。
本发明首次发现上述的snp位点，该分子标记位点对应于ncbi公布的鸡参考基因组gallus_gallus-5.0版本序列信息十六号染色体正义链第350006位脱氧核苷酸，该snp位点在之前没有被报道过，是一新发现的遗传分子标记，该标记与鸡的屠体性状相关性高。该标记可以作为分子探针，用于分子杂交，以判断待测样品的基因型。
上述的snp标记在鸡生长性能或屠体性状选育中的应用。具体的，在鸡屠体性状选育种中的应用。更为具体的在鸡体重、屠体重、屠宰率、全净膛重、全净膛率、半净膛重、头重、爪重或双翅重性状选育中的应用。
本发明的新发现的snp标记可以应用于12周龄体重和产肉性能的早期选择，辅助于鸡的育种，有助于节省生产成本并加快遗传选育进展，具有很大的经济应用价值和科研价值。
一种用于检测鸡屠体性状的检测引物，依据如seqidno.1所示的序列设计，所述检测引物的扩增片段包含该序列5’端起的第427位。该引物采用现有技术中常用的设计方法，也可以根据检测方法的不同进行设计。
具体的，所述引物序列如下所示：
snp-f：5‘-agggagccttgttcagttgg-3’；
snp-r：5‘-agcaaggaaatccacagcga-3’。
包含上述检测引物的检测试剂盒。具体的，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶、saui内切酶中的一种或几种。优选的，包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶和saui内切酶。
上述的snp标记的应用是通过检测如seqidno.1所示序列5’端起第427位的核苷酸种类，选择该位点为aa纯合型的鸡个体，弃去该位点为gg或ga基因型的鸡个体实现的。本发明中发现所述的第427位为aa纯合型鸡个体的生长后期体重和产肉性能极显著高于gg和ga基因型个体，因此选择该位点为aa纯合型的鸡个体。
具体的，通过pcr扩增检测第427位的核苷酸种类，所述pcr扩增时使用的引物如下所示：snp-f：5‘-agggagccttgttcagttgg-3’；
snp-r：5‘-agcaaggaaatccacagcga-3’。在pcr扩增后，可以使用测序或酶切的方法检测所述pcr扩增的产物的snp位点基因型，进而确定所测样本snp位点的基因型。
通过saui内切酶酶切所述pcr扩增的产物进行检测所述第427位核苷酸的种类。如saui消化pcr产物后只有一个509bp的片段，则待测样本为aa基因型；如产生423bp和86bp的2个片段，则待测样本为gg基因型；如产生509bp、423bp和86bp的3个片段，则待测样本为aa基因型ga基因型。因为当pcr产物中该位点为g碱基时，saui可以对其进行消化，消化后产生长度为423bp和86bp的2个片段，而当pcr产物中该位点为a碱基时，则saui不能对其消化，仍为原长509bp。
本发明的检测引物及试剂盒，检测结果准确可靠，可操作性强，为本领域提供了一种快速高效选育高产肉性能鸡的方法。本发明的关键技术在于鉴定了与鸡生长和产肉性能显著相关的优势等位基因，通过检测个体基因组上该位点的等位基因的基因型，即可判断该个体是否为高产肉性能的优势个体，利用该方法即可快速纯合优势等位基因。
附图说明
图1为不同基因型pcr产物saui酶切后条带图；
图2为不同基因型pcr产物的测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1
本实施例中鸡屠体性状相关的snp标记如seqidno.1所示，该序列5’端起427位为g或a，该snp位点对应于ncbi公布的鸡参考基因组gallus_gallus-5.0版本序列信息十六号染色体正义链第350006位脱氧核苷酸。
在对20周和30周鸡肝脏组织转录组数据比较中发现，nonggat003016显著性差异表达，推测该基因可能与鸡的生长发育相关。对该基因序列分析发现，存在一个snp位点，即如seqidno.1所示，该序列5’端起第427位为g或a，故通过相关性分析研究该位点对鸡生长发育等性状的影响。
试验例1
本试验例中的待测鸡群体来自于河南农业大学鸡种质资源场，将安卡鸡和固始鸡进行正反交，产生的f2代群体用于后续表型记录和snp关联分析。即实验材料：650只河南农业大学鸡种质资源场安卡鸡与固始鸡杂交f2代个体。
本实施例中检测鸡屠体性状的方法，包括如下步骤：
一、12周龄体重和屠体性状的测定
分别测定每个鸡个体12周龄体重和屠体性状。
二、snp位点检测
1、基因组dna提取
对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组，以灭菌双蒸水溶解后备用。
具体的，鸡翅静脉采血，acd抗凝剂(1.32％(m/v)柠檬酸钠、0.48％(m/v)柠檬酸、1.47％(m/v)葡萄糖)抗凝后经裂解，蛋白酶(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)消化处理，采用酚仿法提取dna，灭菌双蒸水溶解。
2、snp位点的pcr扩增
用pcr引物对鸡的基因组dna进行pcr扩增，pcr反应体系均为20μl，其中包括2×easytaqpcrsupermix10μl，上下游引物snp-f(如seqidno.2)和snp-r(seqidno.3)各1μl(10umol·l-1)，基因组dna(30-50ng·μl-1)1μl，用纯蒸水补至20μl。
pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增片段长度为509bp。
3、基因分型
1)采用酶切法检测待测鸡的基因型：利用限制性内切酶saui消化扩增的pcr产物(saui酶切的位点为cctnagg，对应酶切seqidno.1的第422-428位)。
取pcr产物10μl，加入0.1μl限制性内切酶saui，1.5μl反应缓冲液(10×)，用超纯水补至15μl；37℃水浴消化6小时。saui为日本takara公司产品，其产品货号为1131b。
2)使用2.0％的琼脂糖凝胶对消化后的pcr产物进行电泳分离，如果只有一个509bp片段，即为aa基因型，如果有423bp和86bp两个片段，即为gg基因型，如果有509bp、423bp和86bp三个片段，即为ga基因型(如图1所示)。
分别选取酶切鉴定为gg、ga、aa的pcr产物进行测序，结果如图2所示，a为gg基因型，b为aa基因型，测序基因型检测结果与酶切检测基因型结果一致，表明酶切检测结果准确。
3)对f2资源群体中如seqidno.1中所述的第427处发生的g>a突变位点的基因及基因型频率统计分析结果见表1所示。
表1目的等位基因的基因及基因型频率统计分析
从表1结果可以看出，ga基因型为实验群体优势基因型。
三、每个鸡个体snp基因型与12周龄体重和屠体性状关联分析
采用(spss)统计分析软件的混合线性模型进行统计分析。
统计分析模型为：
yijklm＝u+gi+sj+hk+fl+eijklm
其中，yijklm代表个体性状的表型值；u代表性状总体均值；gi代表基因型的固定效应(1,3)；sj代表性别的固定效应(1,2)；hk代表批次的固定效应(1,2)；fl代表家系的随机效应(1,7)；b为屠宰重的回归系数；wijklm为个体屠宰重；
关联分析结果表明：如seqidno.1中所述的第427处发生的g>a突变与12周龄体重、屠体重、屠宰率、全净膛重、全净膛率、半净膛重、头重、爪重和双翅重均存在显著相关性(如表2所示)。
表212周龄体重和屠体性状与不同基因型的关联分析
注：同一行数据中含有相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著；*表示差异显著。
从表2可以看出，在所分析的9个性状中，aa基因型个体均高于gg基因型和ga基因型个体。
结果表明，如seqidno.1中所述的第427处发生的g>a突变位点aa纯合型个体在生长后期体重和产肉性能方面具有优势。因此g>a位点可以作为体重和产肉性能的遗传标记，应用于产肉性能的早期分子标记辅助选择。
实施例2
本实施例中用于检测鸡屠体性状的检测引物如下所示：
snp-f：5‘-agggagccttgttcagttgg-3’；
snp-r：5‘-agcaaggaaatccacagcga-3’。
实施例3
本实施例中用于检测鸡屠体性状的检测试剂盒包括如实施例2所示的引物，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶和saui内切酶。
实施例4
本实施例中snp标记的应用，包括以下步骤：
1)鸡的基因组提取(同常规的提取方法或者试验例1的提取方法)。
2)pcr扩增(同试验例1的pcr扩增方法)。
pcr反应体系均为20μl，其中包括2×easytaqpcrsupermix10μl，上下游引物snp-f(如seqidno.2)和snp-r(seqidno.3)各1μl(10umol·l-1)，基因组dna(30-50ng·μl-1)1μl，用纯蒸水补至20μl。
pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增片段长度为509bp。
3)利用限制性内切酶saui消化扩增的pcr产物。
取pcr产物10μl，加入0.1μl限制性内切酶saui，1.5μl反应缓冲液(10×)，用超纯水补至15μl；37℃水浴消化6小时。
使用2.0％的琼脂糖凝胶对消化后的pcr产物进行电泳分离，如果只有一个509bp片段，即为aa基因型，如果有423bp和86bp两个片段，即为gg基因型，如果有509bp、423bp和86bp三个片段，即为ga基因型。
4)选择aa基因型个体进行培育，弃去其他基因型的鸡个体，即可快速纯合优势等位基因，得到生长性能及屠体性状较好的鸡群。
<110>河南农业大学
<120>一种与鸡屠体性状相关的snp标记及其应用、检测引物、检测试剂盒
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<211>509
<212>dna
<213>鸡
<400>1
agggagccttgttcagttggaaacgccacgcatggtgagaagggtcggcttcttatccga60
cagccagagcccctttggttccgggatgaagactcagcctgttccaaggaaccaaacccc120
aataactgatcacaatcaatgatccattgccatcagcaggtattctttattatataggga180
cagagaacagtgctaacacccaaagcagttttctacctttgtttctgcgtgcatgcttgt240
atttacaaaaacatgacatattcgttagatgtccacaaagcctgatacatggtcacacta300
tttccccaaatgcccatatctcttccaggatctctgtcttcctcctctttccttcctttc360
tatggtttctttcttccaattggctttgagttggaggtcgcacaccctcaatttggcagt420
ccctcaggcagctttggctgacagaactgcagtgttctcactcaacacaaacactggctc480
ctcttgttctcgctgtggatttccttgct509
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>snp-f
<400>2
agggagccttgttcagttgg20
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>snp-r
<400>3
agcaaggaaatccacagcga20