本发明属于动物育种领域，具体地说，涉及一种利用荧光微卫星标记技术对和牛三元杂交牛杂交后代进行亲权鉴定的方法及专用引物组合。
背景技术：
：我国是牛肉消费大国，但本国牛肉产量和品质都不能满足我国消费者的需求，完全从国外引进优良的肉用牛也不现实。以国外优良的肉用牛做父本，以我国地方优良黄牛为母本，繁育杂交肉用牛是既经济又实用的一条有利途径。成海建等.日本黑毛和牛三元杂交阉牛育肥试验初报(中国牛业科学2016，42(3)：1-3；21)一文中，记载：“日本黑毛和牛是日本特有的肉牛品种，大理石纹丰富、脂肪熔点低，在生产口感优良、健康安全的肉质产品方面，日本黑毛和牛拥有更多遗传优势。山东省黑毛和牛杂交牛的育肥生产方兴未艾；加之以山东省一些牛经纪人与辽宁某企业合作，在山东省利用日本黑毛和牛做终端父本繁育犊牛，山东省黑毛和牛杂交生产逐步发展起来，而山东省的母牛群体主要以利杂牛(利木赞与鲁西牛杂交)、西杂牛(西门塔尔与鲁西牛杂交)为主，少数地区也有夏杂牛(夏洛莱与鲁西牛杂交)。”可见，和牛三元杂交牛既保留了母牛群体易饲养，适应性强的特长，又继承了父本和牛的肉大理石花纹明显、肉质好的特点。由于我国地方黄牛品种繁育体系不健全，改良过程中，谱系记录不完整是制约选种选配的主要瓶颈。系谱记录是杂交牛群体选种选配的基础，用于制定配种计划、种畜选留、控制畜牧场内近交率，以及估计种群遗传参数等。据文献报道，英国奶牛群的系谱记录错误率约为10％，世界上奶牛父亲记录平均错误率为11％。系谱记录错误，会降低遗传评估的准确性，进而减缓遗传进展。随着各种标记检测方法和推算方法的发展，基于遗传标记的信息对牛进行亲子鉴定已成为可能，且逐步成为奶牛育种与管理工作的重要补充。目前，还没有针对和牛三元杂交牛群体亲权关系鉴定方法的相关报道。技术实现要素：本发明针对现有商业化试剂盒价格昂贵，且对和牛三元杂交牛群体的适用性低等不足之处进行改进，特异性选取高通量、准确高效的9个牛微卫星标记进行扩增和分型，这些标记多态性高、标记间不连锁并且片段大小间隔适当，易于同时检测。本发明提供的鉴定方法简单、快捷、费用低廉，准确度高(可达99.96％)，并可实现自动化的直接检测。本发明将在和牛三元杂交牛群体亲权鉴定及优良牛的分子选育中发挥重要作用，应用前景广阔。为实现上述发明目的，本发明一方面，提供用于鉴定和牛三元杂交牛群体亲权关系的引物组合；所述引物为微卫星引物；所述引物组合包括以下引物对：由表1中seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列组成的微卫星引物eth225；由表1中seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列组成的微卫星引物tgla122；由表1中seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列组成的微卫星引物cssm033；由表1中seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列组成的微卫星引物tgla53；由表1中seqidno.9和seqidno.10所示的核苷酸序列组成的微卫星引物bm1824；由表1中seqidno.11和seqidno.12所示的核苷酸序列组成的微卫星引物bm711；由表1中seqidno.13和seqidno.14所示的核苷酸序列组成的微卫星引物inra023；由表1中seqidno.15和seqidno.16所示的核苷酸序列组成的微卫星引物eth10；由表1中seqidno.17和seqidno.18所示的核苷酸序列组成的微卫星引物sps115；所述引物对eth225、cssm033、bm1824、inra023、sps115的5'端用fam荧光修饰；所述引物对tgla122、tgla53、bm711、eth10的5'端用vic荧光修饰；表1微卫星引物序列信息本发明，另一方面提供一种鉴定和牛三元杂交牛群体亲权关系的方法，包括以下步骤：(1)表1多态性丰富的微卫星引物合成及荧光修饰；(2)以待检和牛三元杂交牛群体基因组dna为模板，用上述微卫星引物进行荧光pcr扩增；(3)对荧光pcr扩增片段进行毛细管电泳检测；(4)根据电泳检测结果判断每个个体的基因型，根据基因型计算单亲亲权指数pi值、累积非父排除率cpe、父权相对机会rcp，当rcp值大于或等于99.5％时，则认定假设亲代与子代个体有亲生关系，当rcp值小于99.5％时，则可以认为假设亲代与子代个体不具有亲生关系。所述步骤(2)荧光pcr扩增的反应体系为：反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，tm℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。所述步骤(3)毛细管电泳检测过程是：将扩增后的待检测样品用灭菌的去离子水稀释10-20倍，取稀释后样品1.5μl，加入genescan-500lizsizestandard0.25μl，去离子甲酰胺9μl，混匀后瞬时离心，95℃变性4min，立刻放于冰盒中冷却3min，将变性后样品转入96孔样品板，进行毛细管电泳。本发明还提供一种用于鉴定和牛三元杂交牛群体亲权关系的试剂盒，包括所述引物组合；还含有荧光探针及pcr体系构建所需试剂：包括10×pcr扩增缓冲液、mgcl2(25mmol/l)、dntps(2.5mmol/l)、dna聚合酶(5u/μl)等用于pcr扩增的相关试剂。本发明具有如下有益效果：(1)快速准确、标记稳定。本发明针对和牛三元杂交牛群体的母本遗传背景比较复杂的情况下，经过创造性劳动筛选得到9个微卫星标记。经检测，所有标记均表现出扩增稳定性和较好的多态性。所选9个标记的扩增片段长度介于134-258bp之间，所选各标记长度间隔差异适当，利用所修饰荧光颜色的差异，易于同时检测，实现高通量分型。不仅如此，本发明根据扩增产物大小选择引物所标记荧光素，特别对于片段长度有重叠的标记，用不同的荧光染料修饰，这样可以使不同颜色的微卫星在一板胶上同时检测，提高试验效率。(2)实验操作可以批量化、自动化、标准化，特别适用于大量群体的检测。附图说明图1为9个微卫星位点pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；m为markeri。图2为9个微卫星位点毛细管电泳荧光检测信号。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是用于详细描述本
发明内容，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，第三版，科学出版社)或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。所用酶制剂购自takara宝生物工程(大连)有限公司，血液基因组dna提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。实施例1微卫星标记引物的筛选本发明人参考联合国粮农组织(fao)与国际动物遗传学会(isag)联合推荐的用于动物遗传多样性研究的微卫星标记组合(http://dad.fao.org/)，经过筛选得出本发明引物组。实施例2鉴定和牛三元杂交牛亲权关系1.牛血液采集本发明的样品来源于和牛以及和牛三元杂交牛，共17份样品，其中和牛父本冻精2份，n1，n2；和牛三元杂交牛血液样品14份，来自3个家系，其中a1-a4是n2公牛的后代，b1-b3是n1公牛的后代，c1-c4是其他家系后代。所有个体都缺乏母本信息。采取牛尾静脉采血方式：将牛绑定，在离牛尾根10厘米左右，第四至第五尾椎骨交界中点凹陷处，对采血部位消毒，然后持一次性采血器垂直刺入牛尾腹侧中心线位置约0.5厘米深处进行采血，采血完成后用酒精棉球压针孔止血。采集的血液可直接进行检测或者置于抗凝管(edta)-20℃冷冻保存。2.pcr扩增20μlpcr扩增的反应体系为：pcr扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，tm℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。3.基因分型将扩增后的待检测样品用灭菌的去离子水稀释10-20倍，取稀释后样品1.5μl，加入genescan-500lizsizestandard0.25μl，去离子甲酰胺9μl，混匀后瞬时离心，95℃变性4min，立刻放于冰盒中冷却3min，将变性后样品转入96孔样品板，进行毛细管电泳。4.微卫星标记的遗传多态性及非父排除率等参数统计非父排除率(pe)是指通过检测遗传标记，能将随机父亲排除的机率，用它来衡量各个遗传标记系统在亲子鉴定中的实用价值大小。pe的大小取决于各系统的遗传方式、等位基因数和等位基因频率，与被检测对象无关。非父排除率，按文献计算，计算公式为：pi，pj：为等位基因频率，n：等位基因数。通过cervus3.0软件的父系分析模型(paternityanalysis)计算各位点的等位基因频率，杂合度(h)及多态信息含量(pic)及非父排除率(ne)等，结果见表2。表29个微卫星位点非父排除率及遗传参数等locuskhobshexppicne-1pne-2pne-ppne-ine-sieth22540.6470.5150.4600.8680.7150.5500.2900.572tgla12260.9410.7700.7060.6580.4810.2990.1050.403cssm03350.8820.7090.6370.7290.5590.3790.1480.443tgla5380.7060.7400.6810.6750.4960.2990.1160.420bm182450.8820.6920.6280.7390.5640.3760.1510.452bm71160.9410.8130.7560.5950.4160.2350.0770.375inra02350.7650.6670.5930.7660.6030.4240.1790.471eth1070.8820.7700.7150.6420.4600.2670.0960.400sps11570.9410.7970.7460.6010.4200.2270.0790.383注：locus：位点的名称；k：等位基因数；hobs：观测杂合度；pic：多态信息含量；ne-1p：只有一个候选亲本时单个位点的非父排除率；ne-2p：已知一个亲本基因型，推测另一个亲本单个位点的非父排除率；ne-pp：父母均未知时单个位点的非父排除率；ne-i：两个不相关个体单个位点的个体识别率；ne-si：两个有亲缘关系个体间单个位点的个体识别率。累积非父排除率(cpe)计算公式如下：cpe＝1-(1-pe1)(1-pe2)···(1-pen)经过计算，9个str位点的累积非父排除率为：在只有一个候选亲本的情况下为99.99％；在父母一方已知的情况下为99.89％；在父母双方未知的情况下为97.86％。5.亲子鉴定结果3个家系14个后代和2父本的亲子鉴定结果见表3。lod若是正数则可确信为成功匹配，且数值越大越可信，若是负数则说明匹配不可信，如表3中c1、c3、c4和n2、c2和n1无亲缘关系，有明显的碱基错配，切匹配lod值是负数，其他正确匹配的lod都是正数。表3亲子鉴定结果最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所<120>用于鉴定和牛三元杂交牛亲权关系的引物组合及鉴定方法<130><160>18<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1gatcaccttgccactatttcct22<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2acatgacagccagctgctact21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3ccctcctccaggtaaatcagc21<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4aatcacatggcaaataagtacatac25<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<400>5cactgtgaatgcatgtgtgtgagc24<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<400>6cccatgataagagtgcagatgact24<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<400>7gctttcagaaatagtttgcattca24<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<400>8atcttcacatgatattacagcaga24<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9gagcaaggtgtttttccaatc21<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10cattctccaactgcttccttg21<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11cagcatcagcaactaacatagg22<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12tggaccatgagggaagtctc20<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<400>13gagtagagctacaagataaacttc24<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14taactacagggtgttagatgaactc25<210>15<211>23<212>dna<213>人工序列<400>15gttcaggactggccctgctaaca23<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列<400>16cctccagcccactttctcttctc23<210>17<211>24<212>dna<213>人工序列<400>17aaagtgacacaacagcttctccag24<210>18<211>24<212>dna<213>人工序列<400>18aacgagtgtcctagtttggctgtg24当前第1页12