用于治疗结肠炎症的微厌氧细菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物学、医学技术领域，具体涉及用于治疗结肠炎症的微厌氧细菌及其应用。

背景技术：

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，统计资料显示男性结肠癌的发病率在恶性肿瘤中排第4位，女性中为第3位。但是现阶段一直缺乏有效的治疗和预防结直肠癌的方法和药物。最近有研究表明给与患者益生菌治疗维持其肠道菌群稳态，是改善肠道炎症以及预防结肠癌发生的有效手段之一。但是现阶段对肠道益生菌的种类、最佳浓度、治疗途径和疗程的研究还较为欠缺。

肝螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus，H.hepaticus)是一种革兰染色阴性杆菌，镜下观察弯曲呈螺旋状，有1-3个不等的螺旋。电镜下可见其表面光滑。典型的特征是菌体两端各有一根带鞘的鞭毛，使细菌具有运动功能。H.hepaticus的培养要求高营养，且需要在微厌氧的条件下生长。

随着对螺杆菌属的深入研究，目前已发现20余种在动物和人类胃肠道中寄生，并且具有致病性的螺杆菌，包括H.bilis、H.hepaticus、H.rodentium、H.mastomyrinus、H.typhlonius、H.cinaedi、H.muridarum等。例如H.typhlonius可以引起免疫缺陷小鼠感染结肠炎；H.rodentium可以和其他螺杆菌一起在免疫缺陷小鼠中起到致病作用，从而引起腹泻和结肠炎。Ward等人将A/J Cr小鼠作为实验动物，将分离出的肝螺旋杆菌通过腹腔注射和灌胃进入小鼠体内，4-32周以后，将小鼠处死，发现小鼠体内均出现灶性非化脓性炎症等肝脏疾病。FOX等人将无菌小鼠作为实验动物，给小鼠口服肝螺旋杆菌，2周后小鼠出现肝细胞凝固性坏死症状，嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润现象，此实验诱发无菌鼠患肝炎同时，也发现一只小鼠出现肝癌。Li等人将SCID/N Cr小鼠作为实验动物，自然感染的小鼠出现肝炎、盲肠炎和结肠炎现象。

但是，目前尚未发现有利用肝螺旋杆菌(H.hepaticus)治疗结肠炎，预防结肠癌的研究报道及专利。以往关于肝螺旋菌株的研究多集中在菌株ATCC 51449上，而且均认为ATCC 51449菌是一种致病菌，会导致慢性肝炎和结肠炎。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微厌氧细菌可作为益生菌制剂，用于治疗结肠炎及预防结肠癌的发生。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于治疗结肠炎症的微厌氧细菌，所述微厌氧细菌为肝螺旋杆菌。

所述肝螺旋杆菌为肝螺旋杆菌菌株ATCC 51448，本发明中简称肝螺旋杆菌51448或51448菌。

优选的，所述微厌氧细菌为肝螺旋杆菌菌株ATCC 51448。

进一步地，本发明还提供了所述微厌氧细菌在制备预防和/或治疗结肠炎症药物中的应用。

进一步地，本发明还提供了所述微厌氧细菌在制备预防结肠癌发生药物中的应用。

优选的，所述微厌氧细菌为肝螺旋杆菌菌株ATCC 51448。所述肝螺旋杆菌51448是通过减少DNA损伤，减轻肠道炎症因子表达，从而缓解和改善结肠炎症的症状。

进一步地，本发明还证明所述肝螺旋杆菌51448是通过保护肝脏损伤，减轻肠道炎症的机制，来抑制结肠癌的发生发展，起到治疗结肠癌的作用。

更进一步地，本发明还提供了一种药用组合物，所述要用组合物含有有效剂量的肝螺旋杆菌51448。

优选的，所述药物组合物给药至少3周，可选地至少12周。

优选的，所述药物组合物为口腔给药、直肠给药或腹腔给药。

更进一步地，本发明还提供了肝螺旋杆菌51448的培养方法，培养中所用培养基是在布鲁氏琼脂或布鲁氏肉汤的基础上添加总培养基体积5％的优级胎牛血清；所述培养条件为微需氧：5％O2，10％CO2，85％N2，37℃，85％的湿度。

有益效果

本发明中发明人首次明确提出肝螺旋菌(ATCC 51448菌株)具有治疗炎症肠炎和预防结肠癌发生的作用。为肠道菌群对诊断和治疗结直肠癌提供了重要的临床价值和参考意义。

附图说明

图1：结肠癌动物模型建立方法示意图。结肠癌动物模型建立方法：腹腔注射AOM 5天后，换饮2％的DSS水，7天后换饮正常水，14天后换饮2％的DSS水，每21天为一个循环，总共4个循环，84天，然后小鼠在正常饮水饮食条件下，饲养至100天。

图2：结肠癌动物模型造模后小鼠体重变化图。DSS对照组每天灌胃生理盐水，51448组每天灌胃肝螺旋杆菌51448。每周记录小鼠的体重情况。(注：*：P<0.05，n＝12)

图3：结肠癌动物模型建立后，DSS对照组、DSS+51448实验组小鼠生存曲线。100天建模期间，对照组每天喂生理盐水，51448组每天灌胃肝螺旋杆菌51448。

图4：结肠癌动物模型建立后，各组小鼠的代表性结肠形态A：DSS对照组，B：DSS+51448组。

图5：造模喂菌后100天后DSS组小鼠与DSS+51448组小鼠结肠长度和肿瘤数量统计结果。A:小鼠结肠长度统计；B:小鼠结肠肿瘤数量统计。(注：**：P<0.01，n＝12)

图6：结肠癌动物模型建立后，各组小鼠结肠病理结果图。A：HE染色和IFN-γ、IL-1β免疫组化染色代表性图；B：病理打分统计结果。(注：**：P<0.01，n＝12)

图7：急性肝功能损伤模型小鼠的生存曲线。NS：生理盐水组；51448：灌胃肝螺旋杆菌51448组。

图8：所用肝螺旋杆菌ATCC 51448，16S rDN序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

试剂、材料的准备

肝螺旋杆菌ATCC 51448购自美国模式菌种保藏公司(American Type Culture Collection，ATCC)。

其它化学试剂均为市售分析纯。

实施例1肝螺旋杆菌51448的培养

1.1肝螺旋杆菌51448液体培养基的制备(1L)

用BD公司的布鲁氏肉汤制备。在锥形瓶中每升双蒸水加28g布鲁氏肉汤固体粉末，在磁力搅拌器上室温助溶至完全溶解，121℃，20分钟进行高压灭菌。待培养基降到55℃左右，加入5％优级胎牛血清，混合后倾注平板，即为培养51448的液体培养基。也可以在培养基中加入适量的抗生素，来抑制杂菌的生长。例如：万古霉素：终浓度10μg/mL，多粘菌素：终浓度0.38μg/mL，两性霉素：终浓度2μg/mL。

1.2肝螺旋杆菌51448琼脂平板的制备(1L)

用BD公司的布鲁氏琼脂制备。在锥形瓶中每升双蒸水加43g布鲁氏琼脂固体粉末，在磁力搅拌器上室温助溶至完全溶解，121℃，20分钟进行高压灭菌。待培养基降到55℃左右，加入5％优级血清，混匀后倾注平板，即为培养51448的血清平板。也可以在培养基中加入适量的抗生素，来抑制杂菌的生长。例如：万古霉素：终浓度10μg/mL，多粘菌素：终浓度0.38μg/mL，两性霉素：终浓度2μg/mL。

1.3肝螺旋杆菌51448冻存液的制备(50mL)

用托盘天平称取布鲁氏肉汤固体粉末5-6g，加入30mL双蒸水溶解，再加入20mL甘油，在磁力搅拌器上室温助溶至完全溶解，用双蒸水定容至50mL，121℃，20分钟高压灭菌。再加入50mL无菌分装的优级胎牛血清，混匀后分装冻存。

1.4肝螺旋杆菌51448的冻存

培养好的平板中加入1.5mL冻存液，用无菌刮刀轻轻刮下51448菌体，与冻存液充分混合。再将菌体冻存液混合物转入冻存管中，负80℃冻存。

1.5肝螺旋杆菌51448的复苏

在琼脂平板上放入100μL的冻存菌液，用涂棒涂抹均匀，微需氧(5％O2，10％CO2，85％N2)、37℃、85％的湿度条件下培养2天，在显微镜下观察复苏的状态，必要的时候可以延长到4-5天。

1.6肝螺旋杆菌51448的扩增

复苏好的菌种如果经过镜检确认状态良好，就可以进行扩增，用布鲁氏肉汤培养基清洗菌体，以1：3传代培养(若状态好，可以按1：5传代培养)转涂到新鲜血清平板上，在微需氧条件下培养24-48小时，通过随时镜检来确定细菌的生长状态。

1.7肝螺旋杆菌51448的培养方法

(1)洁净工作台提前紫外线照射半小时，将接种环过火杀菌，放在一边晾凉，将接种环蘸取51448菌液，在固体平板上划线，放入5％O2，10％CO2，85％N2，85％湿度，37℃的厌氧培养箱中。

(2)一周后长出菌落，用高压过的枪尖挑取平板外侧体积较大的单菌落，接种在装有5mL液体培养基的螺旋管中，将螺旋管放置在厌氧箱中，以350rpm的速度震荡培养。两天后液体培养基长出细菌，用紫外分光光度计测量浓度，大约在0.38OD左右备用。

(3)根据实验设计，需要给每只小鼠灌肝螺旋杆菌51448的剂量为1×10⁸cfu(colony forming units，菌落形成单位)，计算所需的菌液体积，吸入1.5mL EP管中，6000rpm，离心1分钟，吸弃上清。

(4)每只小鼠灌胃200μL菌液，计算总量后，用生理盐水重悬，放置冰上，备用。

(5)按照实验设计方案，需要每天灌胃，所以51448菌每天按照1：25的比例接种于25mL螺旋管中，事先放入5mL液体培养基，准备两管。

实施例2肝螺旋杆菌51448测序验证

2.1检测项目

检测材料：实施例1中培养的51448菌液样品；

检测：检测样品的菌种信息。

2.2检测方法

通过基因组快速提取法，提取菌种基因组DNA用于PCR扩增。

PCR扩增真菌16S rDNA区，引物序列如下

F：AgAgTTTgATCCTggCTCAg(SEQ ID NO:1)

R：CTACggCTACCTTgTTACgA(SEQ ID NO:2)

2.3检测结果

扩增产物长度在1500bp左右，得到16S rDNA区序列信息。经在线序列比对软件BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，与ATCC5144816S rRNA，Sequence ID:NR_114584.1，的匹配度为99％以上，比对结果如图8所示，说明本发明实施例1所培养的肝螺旋杆菌51448的确是目的菌。

实施例3肝螺旋杆菌51448对结肠癌的影响

3.1结肠癌小鼠模型的构建

我们将C57/B6雄性6-8周龄小鼠随机分成两组，每组12只，分别为生理盐水对照组和肝螺旋杆菌51448实验组。首先利用氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)和葡聚糖硫酸(Dextran Sulfate Sodium，DSS)对两组动物模型联合诱导建立结直肠癌的小鼠模型，提前5天(记为时间点-5天)按照12.5mg/kg的剂量给小鼠腹腔注射AOM。5天过后(记为时间点0天)换饮含有2％DSS的三蒸水一周(记为时间点7天)，然后换饮正常水两周(记为时间点21天)，按照每21天作为一个循环，总共循环4次，总计84天，然后将小鼠在正常饮水条件下饲养至100天。根据实验设计，腹腔注射AOM 5天后，换饮DSS水，同时每天给小鼠灌胃喂食生理盐水或肝螺旋杆菌51448。流程示意图见图1。

3.2小鼠粪便隐血以及体重等表型的变化

两组小鼠在腹腔注射12.5mg/kg剂量的AOM后，饮用2％的DSS水，一周后60％小鼠出现便血症状，换回正常饮用水后，便血症状随之消失。在接下来的三个循环中都出现了这种现象。在100天建模期间，每周称C57/B6小鼠体重，记录换成DSS水时小鼠体重的变化情况，如图2所示，两组小鼠腹腔注射AOM后，C57/B6小鼠的对照组和实验组小鼠体重在前11周均没有明显的区别，换成DSS水的一周内体重显著下降，再换回正常水后的两周内体重又缓慢回升，四轮建模过程中，每轮对照组和实验组的小鼠体重变化趋势明显而且一致。11周以后，喂51448菌实验组小鼠体重对比DSS对照组有明显增加，说明长期灌胃肝螺旋杆菌51448后可显著改善结肠癌模型小鼠的体重。

3.3小鼠存活率

在100天构建结肠癌小鼠模型期间，分别记录各组小鼠的存活率，绘制生存曲线。如图3所示，DSS对照组在100天内共有10只死亡(10/12)，51448组小鼠仅有3只死亡(3/12)。经过统计学分析可得，对照组和51448组小鼠之间P<0.05，有统计学意义。结果显示51448菌能显著延长小鼠存活时间。

3.4小鼠结肠长度和肿瘤数量

100天小鼠模型建成以后，颈椎脱臼处死小鼠，取出DSS对照组和51448实验组小鼠结肠。将结肠依次排开，用尺子测量长短，并记录瘤子数量。

如图4所示，虽然DSS对照组小鼠结肠长度与51448实验组并没有明显差异，但是发现DSS对照组结直肠末端肿大，纵向剪开后肉眼可以观察到明显诱发的肿瘤，呈典型的腺癌状结构，且体积较大，数量较多，同时由于肿瘤占位导致了结肠末端肿大，结肠肠壁也明显变厚。51448组小鼠结肠肿瘤比较分散，体积较小，数量较少。定量测量两组小鼠结肠长度后，可以看出两组小鼠长度基本一致，无统计学差异(如图5A所示)。但是两组小鼠的肿瘤数量来看，51448实验组小鼠肿瘤明显减少(如图5B所示)，P<0.05，有统计学差异。

3.5小鼠结肠病理切片HE染色和IFN-γ、IL-1β组化

颈椎脱臼处死小鼠，取出小鼠结肠肿瘤部分，并使用10％福尔马林溶液固定。用固定后的结肠样本做石蜡切片，并对切片进行HE染色和IFN-γ、IL-1β免疫组化染色，以评估结肠损伤情况。(图6)HE染色结果显示，DSS对照组小鼠结肠肿瘤部分可以清楚的看腺体组织结构紊乱，被严重破坏，几乎肉眼不可见，取而代之的是明显可见的占位性肿瘤，而51448实验组小鼠的结肠组织病理改变得到明显的缓解。同时免疫组化结果显示，DSS对照组小鼠肠道肿瘤组织中浸润着大量分泌IFN-γ的细胞，而51448实验组小鼠肠道中产生的IFN-γ明显减少。IL-1β的染色也呈现类似的现象，表明螺旋杆菌51448能够明显减轻结肠炎症微环境，改善结肠癌病理症状。

综上所述，喂养肝螺旋杆菌51448小鼠与DSS对照组小鼠相比，能显著延长DSS结肠癌造模小鼠存活时间。减少结肠肿瘤数量。减轻肠道炎症细胞因子，改善结肠癌病理症状。

实施例4杆螺旋杆菌51448对肝功能损伤的影响

选择6-8周的C57/B6雄性小鼠24只，随机分成实验组12只，对照组12只。用51448菌按照1×10⁸cfu的量给12只实验组小鼠灌胃，生理盐水作对照给对照组(NS)12只小鼠灌胃，一周后，腹腔注射脂多糖(LPS)/D-氨基半乳糖(GalN)，按照LPS：35μL/kg，GalN：800μg/kg，每只小鼠6μl/g的剂量给药。

LPS是一种免疫活化的有效激动剂，是一种通过外周组织的巨噬细胞激动全身免疫系统活化的细菌内毒素，所以我们利用LPS+D-氨基半乳糖(LPS+D-GalN)来构建小鼠急性肝功能损伤模型。我们按照每只小鼠体重不同均匀分成实验组和对照组，实验组每只小鼠每天灌51448细菌的量为5×10⁸，对照组每天灌等体积的生理盐水，一周后按照LPS：35μl/kg GalN:800μg/kg，每只小鼠6μLg的剂量对小鼠进行腹腔注射，观测小鼠死亡时间。

如图7所示，对照组(NS)和实验组(51448)相比，对照组小鼠12小时内，死亡率达到80％左右，51448组小鼠12小时内死亡率仅有50％左右，经统计学分析，P<0.05,有统计学意义。结果显示对照组小鼠死亡率高于实验组，表明肝螺旋杆菌51448能明显延长小鼠的存活时间。实验结果表明51448菌对LPS诱导的小鼠急性肝功能损伤也有显著的保护作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 用于治疗结肠炎症的微厌氧细菌及其应用

<130> p17138

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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