本发明涉及农业生物技术领域，尤其是涉及用于一种微生物复合菌剂的制备方法。
背景技术：
植物病害生物防治就是利用有益生物拮抗、破坏病原物和（或）利用有益的生物促进植物生长、诱导植物产生抗病性，从而达到控制病害目的的一项措施。换而言之，通过调节寄主植物的微生物生长环境，通过微生态作用的调控而实现防病控病的目的。植物病害生物防治的广义概念是指利用有益生物的活体及其代谢产物，植物病害生物防治的狭义概念的则指利用有益生物的活体植物病害生物防治的研究内容：选用有拮抗作用的微生物抑制病原微生物；利用微生物、动植物等自身产生的一系列天然拮抗物质来抑制病原微生物；利用微生物或拮抗物质诱导植物身产生抗病性而达到防治病原菌的目的。最主要的一个防治植物病害的生防细菌类型是细菌，无论自然界自身存在的生物防治菌株，还是人们釆用技术手段筛选获得的生物防治菌株，生防菌主要特点是类观多、繁殖速度快、逆性强、对生态环境友好、定殖能力强、产生抑菌物质、促进植物生长。目前应用较多的植物病害生防微生物主要有芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、土壤菌属以及其它一些细菌。生物防治的机制是利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过微生物次级代谢产物诱导植物产生抗病性等，来抑制某些病原物的存活和活动。它是一种对环境生态友好，可持续的田间植物病害防治方法，愈来愈得到各国植病工作者的承认和重视，已获得了长足的发展。
现有技术如授权公告号为CN103651582 B的中国发明专利，公开了一种广谱复合微生物杀菌剂及其制备方法，它由以下3种微生物组成原复合孢子粉：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)GSICC 32807、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GSICC 32826和寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)GSICC 61615。将两种细菌孢子粉和一种真菌孢子粉按照1:1:1的重量比混合，从而制成广谱复合微生物杀菌剂产品。该广谱复合微生物杀菌剂产品能迅速定植到植物根围，通过与病原菌竞争侵染位点、重寄生作用、分泌生长素和促进植物营养吸收等作用，显著预防、拮抗并杀灭多种作物微生物病害；同时具有促进生作物长、提高产量和改善品质的功效。但是该微生物杀菌剂使用寿命短。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种微生物复合菌剂的制备方法，该制备方法生产成本低，能耗低，能够提高吸附载体的吸附量和吸附力，制得的微生物复合菌剂中各微生物种类搭配合理，能够相互增益，具有高效、广谱病虫害防治的作用，促进作物生长、提高作物产量和品质。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种微生物复合菌剂的制备方法，包括菌种活化、孢子粉制备、真菌孢子粉的制备、微生物复合菌剂制备，其具体步骤为：
菌种活化：将菌种分别接种到固体培养基上，在25-30℃的条件下活性培养20-30h，即得到活化菌种，备用，由于菌种长时间保藏于温度较低的菌种库中，因此在使用前要进行活化；
孢子粉制备：按接种量为5-10%将活化好的解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种到液体培养基中，在温度为25-30℃、转速为150-200r/min的条件下摇床培养20-30h得种子液，然后按接种量为1.8-2.4%将种子液接种于液体培养液中，然后在温度为25-30℃、转速为150-200r/min的条件下摇床培养2-3d，得到液体细菌悬浮液，三种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，含有效活菌数≥100亿个/g；
真菌孢子粉的制备：按接种量为5-10%将活化好的寡雄腐霉接种到液体培养基中，在温度为25-30℃、转速为150-200r/min的条件下摇床培养20-30h得种子液，然后按接种量为1.8-2.4%将种子液接种于液体培养液中，然后在温度为25-30℃、转速为150-200r/min的条件下摇床培养2-3d，得到液体细菌悬浮液，三种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备真菌成孢子粉，含有效活菌数≥100亿个/g；
微生物复合菌剂制备：先将菌剂载体灭菌，再与孢子粉、真菌孢子粉混合均匀，然后再加入无菌水，并在转速为90-130r/min、温度为25-30℃的无菌环境下振荡培养40-60min，再加入海藻酸钠和聚乙烯醇，在120-180r/min下磁力搅拌均匀得混合液，将混合液在30-40min内恒速滴加到无菌氯化钙和无菌硼酸混合溶液中，在30-35℃的温度条件下交联固化15-25h得到凝胶球，再于-4至0℃下冻干至水分含量≤5％，即得微生物复合菌剂，备用，上述海藻酸钠为微生物菌剂重量的0.4-0.5倍，聚乙烯醇为微生物菌剂重量的2-3倍，上述无菌水中含有0-0.05mM全氟辛酸和0-0.02mM 1,12-十二烷二醇，该全氟辛酸和1,12-十二烷二醇的加入能够使淀粉链长变短而发生受到破坏、断裂、降解，改变微孔淀粉的链长，提高微孔淀粉的比表面积和孔容积，进而提高其吸附菌剂的性能，同时能够使得微孔淀粉和菌剂间存在一定的化学键作用力，进而加固微孔淀粉对菌剂的吸附力，提高微孔淀粉的缓释性能，最终提高微生物复合菌剂的使用期限，通过海藻酸钠和壳聚糖的交联固化，形成胶囊载体的基础多孔结构，不仅能够延长微生物复合菌剂的微生物存活时间长，产品稳定，而且使得膜内包埋的复合菌剂及开放条件下外界的微生物能利用膜体释放的碳源进行一定的增殖及维持正常生理生化活性，使得胶囊中的微生物在释放环境中后进行了增殖。
优选的，孢子粉和真菌孢子粉的重量比为1:0.4-0.6，孢子粉中解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的重量比为1:0.7-1.1:0.3-0.6，该微生物复合菌剂中各微生物种类搭配合理，能够相互增益，不仅能防止鳞翅目虫害，减少害虫咬噬为病原菌入侵提供的“便利通道”，而且能预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害，此外还能分泌耐高温抗菌物质、蛋白酶和生长素等，具有高效、广谱病虫害防治的作用，同时具有促根催芽作用，能促进作物生长、提高作物产量和品质。
优选的，菌剂载体和菌剂的重量比为1:4-5，菌剂载体为微孔淀粉或膨润土或海泡石粉或竹炭粉或沸石粉，更优选为微孔淀粉，该菌剂载体菌吸附性能良好，有利于获得较佳的微生物复合菌剂胶囊硬度、粘聚性和弹性回复，能够提高微生物复合菌剂的包封率，淀粉的吸附能力使微生物复合菌剂即使在溶胀时也无法迅速的释放出来，从而达到了更好的缓释效果。
优选的，无菌氯化钙溶液和无菌硼酸溶液的浓度均为3-5%，其体积比为1:0.67-0.82，海藻酸钠上的α-L-古罗糖醛酸和氯化钙的交联反应迅速，有利于成囊壁材成型，且易形成硬度较高的凝胶，聚乙烯醇与硼酸反应会形成牢固的化学键，在水环境中稳定性好，同时竹炭或微孔淀粉上的-OH参与了聚乙烯醇与硼酸间的配位聚合反应，使得聚乙烯醇链得以固定于竹炭或微孔淀粉颗粒表面从而获得支撑力，增加胶囊硬度。
优选的，微生物复合菌剂的使用方法为：沟施、穴施、毒土、浸种、蘸根、喷施、灌根。该微生物复合菌剂能迅速在植物根围定植生长并形成“保护罩”，以防止根部病原真菌的侵染，同时在与病原菌互作和重寄生过程中产生抗菌物质、蛋白酶和生长素等物质，能显著预防、拮抗或直接杀死农作物多种病害，使用该微生物复合菌剂可以避免和减少化学杀菌剂的用量，减少化学药剂对环境的污染，降低病原菌的抗药性，进而降低病害的投入成本，经济环保，该微生物复合菌剂使用寿命长，在根部使用可以持续3个月以上，在叶部喷施可以持续7-15天，减少用药次数和劳动投入，持效期长。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明微生物复合菌剂的制备方法生产成本低，能耗低，易于操作，易于工业化生产，具有较大的发展潜力；2）该制备方法能够提高吸附载体的吸附量和吸附力，提高微生物复合菌剂的缓释性能，最终提高微生物复合菌剂的使用期限，且能使得胶囊中的微生物在释放环境中后进行了增殖；3）该微生物复合菌剂中各微生物种类搭配合理，能够相互增益，具有高效、广谱病虫害防治的作用，同时具有促根催芽作用，能促进作物生长、提高作物产量和品质；4）使用该微生物复合菌剂可以避免和减少化学杀菌剂的用量，减少化学药剂对环境的污染，降低病原菌的抗药性，进而降低病害的投入成本，经济环保。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：
一种微生物复合菌剂的制备方法，包括菌种活化、孢子粉制备、真菌孢子粉的制备、微生物复合菌剂制备，其具体步骤为：
1）菌种活化：将菌种分别接种到固体培养基上，在30℃的条件下活性培养20h，即得到活化菌种，备用，由于菌种长时间保藏于温度较低的菌种库中，因此在使用前要进行活化；
2）孢子粉制备：按接种量为10%将活化好的解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种到液体培养基中，在温度为25℃、转速为200r/min的条件下摇床培养20h得种子液，然后按接种量为2.4%将种子液接种于液体培养液中，然后在温度为25℃、转速为200r/min的条件下摇床培养2d，得到液体细菌悬浮液，三种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，含有效活菌数≥100亿个/g；
3）真菌孢子粉的制备：按接种量为10%将活化好的寡雄腐霉接种到液体培养基中，在温度为25℃、转速为200r/min的条件下摇床培养20h得种子液，然后按接种量为2.4%将种子液接种于液体培养液中，然后在温度为25℃、转速为200r/min的条件下摇床培养2d，得到液体细菌悬浮液，三种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备真菌成孢子粉，含有效活菌数≥100亿个/g；
4）微生物复合菌剂制备：先将菌剂载体灭菌，再与孢子粉、真菌孢子粉混合均匀，然后再加入无菌水，并在转速为130r/min、温度为25℃的无菌环境下振荡培养60min，再加入海藻酸钠和聚乙烯醇，在120r/min下磁力搅拌均匀得混合液，将混合液在40min内恒速滴加到无菌氯化钙和无菌硼酸混合溶液中，在30℃的温度条件下交联固化25h得到凝胶球，再于-4℃下冻干至水分含量≤5％，即得微生物复合菌剂，备用，上述海藻酸钠为微生物菌剂重量的0.5倍，聚乙烯醇为微生物菌剂重量的2倍，通过海藻酸钠和壳聚糖的交联固化，形成胶囊载体的基础多孔结构，不仅能够延长微生物复合菌剂的微生物存活时间长，产品稳定，而且使得膜内包埋的复合菌剂及开放条件下外界的微生物能利用膜体释放的碳源进行一定的增殖及维持正常生理生化活性，使得胶囊中的微生物在释放环境中后进行了增殖。
上述孢子粉和真菌孢子粉的重量比为1:0.6，孢子粉中解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的重量比为1:0.7:0.6，该微生物复合菌剂中各微生物种类搭配合理，能够相互增益，不仅能防止鳞翅目虫害，减少害虫咬噬为病原菌入侵提供的“便利通道”，而且能预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害，此外还能分泌耐高温抗菌物质、蛋白酶和生长素等，具有高效、广谱病虫害防治的作用，同时具有促根催芽作用，能促进作物生长、提高作物产量和品质。
上述菌剂载体和菌剂的重量比为1:4，菌剂载体为微孔淀粉或膨润土或海泡石粉或竹炭粉或沸石粉，更优选为微孔淀粉，该菌剂载体菌吸附性能良好，有利于获得较佳的微生物复合菌剂胶囊硬度、粘聚性和弹性回复，能够提高微生物复合菌剂的包封率，淀粉的吸附能力使微生物复合菌剂即使在溶胀时也无法迅速的释放出来，从而达到了更好的缓释效果。
上述无菌氯化钙溶液和无菌硼酸溶液的浓度均为5%，其体积比为1:0.67，海藻酸钠上的α-L-古罗糖醛酸和氯化钙的交联反应迅速，有利于成囊壁材成型，且易形成硬度较高的凝胶，聚乙烯醇与硼酸反应会形成牢固的化学键，在水环境中稳定性好，同时竹炭或微孔淀粉上的-OH参与了聚乙烯醇与硼酸间的配位聚合反应，使得聚乙烯醇链得以固定于竹炭或微孔淀粉颗粒表面从而获得支撑力，增加胶囊硬度。
上述微生物复合菌剂的使用方法为：沟施、穴施、毒土、浸种、蘸根、喷施、灌根。该微生物复合菌剂能迅速在植物根围定植生长并形成“保护罩”，以防止根部病原真菌的侵染，同时在与病原菌互作和重寄生过程中产生抗菌物质、蛋白酶和生长素等物质，能显著预防、拮抗或直接杀死农作物多种病害，使用该微生物复合菌剂可以避免和减少化学杀菌剂的用量，减少化学药剂对环境的污染，降低病原菌的抗药性，进而降低病害的投入成本，经济环保，该微生物复合菌剂使用寿命长，在根部使用可以持续3个月以上，在叶部喷施可以持续7-15天，减少用药次数和劳动投入，持效期长。
实施例2：
一种微生物复合菌剂的制备方法，包括菌种活化、孢子粉制备、真菌孢子粉的制备、微生物复合菌剂制备，其具体步骤为：
1）菌种活化：将菌种分别接种到固体培养基上，在25℃的条件下活性培养30h，即得到活化菌种，备用；
2）孢子粉制备：按接种量为5%将活化好的解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种到液体培养基中，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下摇床培养30h得种子液，然后按接种量为1.8%将种子液接种于液体培养液中，然后在温度为30℃、转速为150r/min的条件下摇床培养3d，得到液体细菌悬浮液，三种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，含有效活菌数≥100亿个/g；
3）真菌孢子粉的制备：按接种量为5%将活化好的寡雄腐霉接种到液体培养基中，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下摇床培养30h得种子液，然后按接种量为1.8%将种子液接种于液体培养液中，然后在温度为30℃、转速为150r/min的条件下摇床培养3d，得到液体细菌悬浮液，三种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备真菌成孢子粉，含有效活菌数≥100亿个/g；
4）微生物复合菌剂制备：先将菌剂载体灭菌，再与孢子粉、真菌孢子粉混合均匀，然后再加入无菌水，并在转速为90r/min、温度为30℃的无菌环境下振荡培养40min，再加入海藻酸钠和聚乙烯醇，在180r/min下磁力搅拌均匀得混合液，将混合液在30min内恒速滴加到无菌氯化钙和无菌硼酸混合溶液中，在35℃的温度条件下交联固化15h得到凝胶球，再于0℃下冻干至水分含量≤5％，即得微生物复合菌剂，备用，上述海藻酸钠为微生物菌剂重量的0.4倍，聚乙烯醇为微生物菌剂重量的3倍，无菌水中含有0.02mM 1,12-十二烷二醇；上述孢子粉和真菌孢子粉的重量比为1:0.4，孢子粉中解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的重量比为1:1.1:0.3；菌剂载体和菌剂的重量比为1:5，菌剂载体为微孔淀粉；无菌氯化钙溶液和无菌硼酸溶液的浓度均为5%，其体积比为1:0.67。
上述微生物复合菌剂的使用方法为：沟施。
实施例3：
一种微生物复合菌剂的制备方法，包括菌种活化、孢子粉制备、真菌孢子粉的制备、微生物复合菌剂制备，其具体步骤为：
1）菌种活化：将菌种分别接种到固体培养基上，在28℃的条件下活性培养25h，即得到活化菌种，备用；
2）孢子粉制备：按接种量为8%将活化好的解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种到液体培养基中，在温度为28℃、转速为180r/min的条件下摇床培养25h得种子液，然后按接种量为2.0%将种子液接种于液体培养液中，然后在温度为28℃、转速为180r/min的条件下摇床培养2.5d，得到液体细菌悬浮液，三种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，含有效活菌数≥100亿个/g；
3）真菌孢子粉的制备：按接种量为8%将活化好的寡雄腐霉接种到液体培养基中，在温度为28℃、转速为180r/min的条件下摇床培养25h得种子液，然后按接种量为2.0%将种子液接种于液体培养液中，然后在温度为28℃、转速为180r/min的条件下摇床培养2.5d，得到液体细菌悬浮液，三种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备真菌成孢子粉，含有效活菌数≥100亿个/g；
4）微生物复合菌剂制备：先将菌剂载体灭菌，再与孢子粉、真菌孢子粉混合均匀，然后再加入无菌水，并在转速为110r/min、温度为28℃的无菌环境下振荡培养50min，再加入海藻酸钠和聚乙烯醇，在150r/min下磁力搅拌均匀得混合液，将混合液在35min内恒速滴加到无菌氯化钙和无菌硼酸混合溶液中，在32℃的温度条件下交联固化20h得到凝胶球，再于-2℃下冻干至水分含量≤5％，即得微生物复合菌剂，备用，上述海藻酸钠为微生物菌剂重量的0.45倍，聚乙烯醇为微生物菌剂重量的2.5倍，无菌水中含有0.02mM全氟辛酸和0.01mM 1,12-十二烷二醇；上述孢子粉和真菌孢子粉的重量比为1:0.5，孢子粉中解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的重量比为1:0.9:0.5；菌剂载体和菌剂的重量比为1:4.5，菌剂载体为微孔淀粉；无菌氯化钙溶液和无菌硼酸溶液的浓度均为4%，其体积比为1:0.75。
上述微生物复合菌剂的使用方法为：浸种。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。