本发明属于生物技术、基因工程和发酵工程领域，具体涉及利用乙酸和丙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
基于农业与种植业的可再生生物质资源，包括葡萄糖、木糖、淀粉和纤维素等，是发酵工业中微生物普遍利用的碳源和能源物质。2014年，我国生物发酵行业主要产品的总产量为2420万吨(我国生物发酵产业发展现状及发展趋势，工业微生物，2015，45：62-66)，生产过程中消耗了大量的淀粉等农副产品，存在“与人争粮、与粮争地”的难题。随着粮食短缺和农产品价格的上涨，原料问题逐渐成为制约生物发酵产业健康发展的重要因素，迫切需要开发新的微生物能够利用的大宗生物质资源。一些非传统碳源，例如甲醇、乙酸和合成气等，逐渐成为工业生物技术领域中的研究热点。
乙酸又名醋酸，是一种简单的二碳羧酸。工业制备乙酸的方法包括乙醛氧化法、液态烃液相氧化法、甲醇羰基合成法等。近年来，合成气直接制乙酸工艺等新技术也在开发之中。目前，乙酸市场存在产能严重过剩、市场持续低迷的困境。如果能开发市场前景广阔的下游产品，延伸产业链，将能推动乙酸产业可持续发展。
大肠杆菌、产油酵母、梭菌和盐单胞菌等可以利用乙酸作为碳源生长。产油酵母可以利用乙酸废液作为主要碳源积累油脂。虽然乙酸是一种臭名昭著的细胞生长抑制剂，但代谢工程改造的大肠杆菌已经被用来转化乙酸获得脂肪酸
(engineeringescherichiacolitoconvertaceticacidtofreefattyacids.biochem.eng.j.76，60–69)和琥珀酸
(productionofsuccinatefromacetatebymetabolicallyengineeredescherichiacoli.acs.synth.biol.5，1299–1307)。
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，pha)是一类广泛存在于微生物细胞内的高分子化合物，一般作为碳源和能量的贮藏物质，在微生物生长代谢不平衡的条件下，由葡萄糖或者脂肪酸等合成。迄今为止，一些pha产品已经进行了商业化的试生产，包括聚-3-羟基丁酸酯(p3hb)、3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(p3hb4hb)和3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯(phbv)等。pha具有与石油来源的塑料类似的材料学性质，可以作为包装材料和组织工程材料，但其较高的生产成本是限制pha大规模工业化生产和应用的主要因素。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用乙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌。
本发明所提供的制备用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌的方法，可包括如下步骤：提高受体菌中乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、聚羟基脂肪酸酯合成酶、β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶a还原酶、琥珀酸半缩醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶、丙酰辅酶a转移酶的表达和/或活性，且降低所述受体菌中非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的表达和/或活性，从而获得所述用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌；所述受体菌为能够以乙酸作为碳源生长的菌。
所述乙酸激酶，可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列8所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有乙酸激酶活性的蛋白质。
所述磷酸转乙酰酶，可为如下b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列9所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列9所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白质。
所述聚羟基脂肪酸酯合成酶，可为如下c1)或c2)或c3)：
c1)氨基酸序列是序列表中序列10所示的蛋白质；
c2)在序列表中序列10所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
c3)将c1)或c2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有聚羟基脂肪酸酯合成酶活性的蛋白质。
所述β-酮硫解酶，可为如下d1)或d2)或d3)：
d1)氨基酸序列是序列表中序列11所示的蛋白质；
d2)在序列表中序列11所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
d3)将d1)或d2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有β-酮硫解酶活性的蛋白质。
所述乙酰乙酰辅酶a还原酶，可为如下e1)或e2)或e3)：
e1)氨基酸序列是序列表中序列12所示的蛋白质；
e2)在序列表中序列12所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
e3)将e1)或e2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有乙酰乙酰辅酶a还原酶活性的蛋白质。
所述琥珀酸半缩醛脱氢酶，可为如下f1)或f2)或f3)：
f1)氨基酸序列是序列表中序列13所示的蛋白质；
f2)在序列表中序列13所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
f3)将f1)或f2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有琥珀酸半缩醛脱氢酶活性的蛋白质。
所述4-羟基丁酸脱氢酶，可为如下g1)或g2)或g3)：
g1)氨基酸序列是序列表中序列14所示的蛋白质；
g2)在序列表中序列14所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
g3)将g1)或g2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的蛋白质。
所述4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶，可为如下h1)或h2)或h3)：
h1)氨基酸序列是序列表中序列15所示的蛋白质；
h2)在序列表中序列15所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
h3)将h1)或h2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶活性的蛋白质。
所述丙酰辅酶a转移酶，可为如下i1)或i2)或i3)：
i1)氨基酸序列是序列表中序列16所示的蛋白质；
i2)在序列表中序列16所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
i3)将i1)或i2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有丙酰辅酶a转移酶活性的蛋白质。
所述非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶可为如下j1)或j2)或j3)：
j1)氨基酸序列是序列表中序列17和/或序列19所示的蛋白质；
j2)在序列表中序列17和/或序列19所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
j3)将j1)或j2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶活性的蛋白质。
上述方法中，所述“提高受体菌中乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、聚羟基脂肪酸酯合成酶、β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶a还原酶、琥珀酸半缩醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶、丙酰辅酶a转移酶的表达和/或活性”具体是通过向所述受体菌中导入乙酸激酶的编码基因(acka基因)、磷酸转乙酰酶的编码基因(pta基因)、聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因(phac基因)、β-酮硫解酶的编码基因(phaa基因)、乙酰乙酰辅酶a还原酶的编码基因(phab基因)、琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sucd基因)、4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因(4hbd基因)、4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶的编码基因(orfz基因)和丙酰辅酶a转移酶的编码基因(pct基因)来实现的。所述“降低所述受体菌中非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的表达和/或活性”是通过敲除所述受体菌中非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sad基因和gabd基因)来实现的。
所述乙酸激酶的编码基因(acka基因)可为如下a1)或a2)或a3)或a4)所示的dna分子：a1)编码区是序列表中序列1自5’末端起第70-1272位所示的dna分子；a2)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第70-1272位所示的dna分子；a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述乙酸激酶的dna分子；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述乙酸激酶的dna分子。
所述磷酸转乙酰酶的编码基因(pta基因)可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)编码区是序列表中序列1自5’末端起第1347-3491位所示的dna分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第1347-3491位所示的dna分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述磷酸转乙酰酶的dna分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述磷酸转乙酰酶的dna分子。
所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因(phac基因)可为如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的dna分子：c1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第70-1839位所示的dna分子；c2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第70-1839位所示的dna分子；c3)与c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的dna分子；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的dna分子。
所述β-酮硫解酶的编码基因(phaa基因)可为如下d1)或d2)或d3)或d4)所示的dna分子：d1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第1924-3105位所示的dna分子；d2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第1924-3105位所示的dna分子；d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述β-酮硫解酶的dna分子；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述β-酮硫解酶的dna分子。
所述乙酰乙酰辅酶a还原酶的编码基因(phab基因)为如下e1)或e2)或e3)或e4)所示的dna分子：e1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第3180-3920位所示的dna分子；e2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第3180-3920位所示的dna分子；e3)与e1)或e2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述乙酰乙酰辅酶a还原酶的dna分子；e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述乙酰乙酰辅酶a还原酶的dna分子。
所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sucd基因)可为如下f1)或f2)或f3)或f4)所示的dna分子：f1)编码区是序列表中序列3自5’末端起第70-1431位所示的dna分子；f2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第70-1431位所示的dna分子；f3)与f1)或f2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的dna分子；f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的dna分子。
所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因(4hbd基因)可为如下g1)或g2)或g3)或g4)所示的dna分子：g1)编码区是序列表中序列3自5’末端起第1468-2583位所示的dna分子；g2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第1468-2583位所示的dna分子；g3)与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述4-羟基丁酸脱氢酶的dna分子；g4)在严格条件下与g1)或g2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述4-羟基丁酸脱氢酶的dna分子。
所述4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶的编码基因(orfz基因)可为如下h1)或h2)或h3)或h4)所示的dna分子：h1)编码区是序列表中序列4自5’末端起第70-1359位所示的dna分子；h2)核苷酸序列是序列表中序列4自5’末端起第70-1359位所示的dna分子；h3)与h1)或h2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶的dna分子；h4)在严格条件下与h1)或h2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶的dna分子。
所述丙酰辅酶a转移酶的编码基因(pct基因)可为如下i1)或i2)或i3)或i4)所示的dna分子：i1)编码区是序列表中序列5自5’末端起第70-1623位所示的dna分子；i2)核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第70-1623位所示的dna分子；i3)与i1)或i2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述丙酰辅酶a转移酶的dna分子；i4)在严格条件下与i1)或i2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述丙酰辅酶a转移酶的dna分子。
所述非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sad基因和/或gabd基因)可为如下j1)或j2)或j3)或j4)所示的dna分子：j1)编码区是序列表中序列18和/或序列20所示的dna分子；j2)核苷酸序列是序列表中序列18和/或序列20所示的dna分子；j3)与j1)或j2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的dna分子；j4)在严格条件下与j1)或j2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的dna分子。
sad基因的核苷酸序列如序列表中序列18所示，编码序列表中序列17所示的蛋白质。gabd基因的核苷酸序列如序列表中序列20所示，编码序列表中序列19所示的蛋白质。
上述方法中，所述乙酸激酶的编码基因(acka基因)和磷酸转乙酰酶的编码基因(pta基因)是通过序列表中序列1所示的dna分子导入所述受体菌中的。所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因(phac基因)、所述β-酮硫解酶的编码基因(phaa基因)和所述乙酰乙酰辅酶a还原酶的编码基因(phab基因)是通过序列表中序列2所示的dna分子导入所述受体菌中的。所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sucd基因)和所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因(4hbd基因)是通过序列表中序列3所示的dna分子导入所述受体菌中的。所述4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶的编码基因(orfz基因)是通过序列表中序列4所示的dna分子导入所述受体菌中的。所述丙酰辅酶a转移酶的编码基因(pct基因)是通过序列表中序列5所示的dna分子导入所述受体菌中的。
上述方法中，所述非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sad基因和gabd基因)是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列6和序列7。
更加具体的，在本发明中，所述乙酸激酶的编码基因(acka基因)、所述磷酸转乙酰酶的编码基因(pta基因)、所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sucd基因)和所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因(4hbd基因)是通过重组表达载体1导入到所述受体菌中的；所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因(phac基因)、所述β-酮硫解酶的编码基因(phaa基因)、所述乙酰乙酰辅酶a还原酶的编码基因(phab基因)和所述4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶的编码基因(orfz基因)是通过重组表达载体2导入到所述受体菌中的；所述丙酰辅酶a转移酶的编码基因(pct基因)是通过重组表达载体3导入到所述受体菌中的。所述重组表达载体1为将质粒pbbr1mcs-2的ecori识别序列和xbai识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第9至3491位所示的dna分子，xbai识别序列和saci识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第9至2583位所示的dna分子。所述重组表达载体2为将质粒puc19的hindiii识别序列和bamhi识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第9至3920位所示的dna分子，bamhi识别序列和ecori识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列4自5’末端起第9至1359位所示的dna分子。所述重组表达载体3为将质粒puc19的hindiii识别序列和bamhi识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第9至3920位所示的dna分子，bamhi识别序列和ecori识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第9至1623位所示的dna分子。
上述方法中，所述受体菌可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌e.colijm109。
由上述任一所述的方法制备得到的用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌也属于本发明的保护范围。
上述任一所述用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌在生产聚羟基脂肪酸酯中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述生产聚羟基脂肪酸酯(如p3hb、p3hb4hb)以乙酸作为底物。
上述应用中，所述生产聚羟基脂肪酸酯(如phbv)以乙酸和丙酸作为底物。
本发明还保护一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤：以乙酸作为碳源，发酵培养所述工程菌，收集发酵产物，从中获得聚羟基脂肪酸酯。
上述方法中，根据生产聚羟基脂肪酸酯的种类(如phbv)，还可以在发酵体系中同时加入丙酸作为底物。
其中，所述发酵培养的条件可为：37℃摇瓶震荡培养24-72h(如48h)。摇瓶的转速具体可为200rpm。所采用的培养基可为mmye液体培养基。
所述mmye液体培养基的组成可如下：每升培养基含6g乙酸、2gnh4cl、5.0g(nh4)2so4、6.0gkh2po4、8.214gmops、0.5gnacl、1ml微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素、0.05g卡那霉素和10g酵母粉，余量为水。所述微量元素溶液的组成可如下：每升微量元素溶液含3.6gfecl2·4h2o、5gcacl2·2h2o、1.3gmncl2·2h2o、0.38gcucl2·2h2o、0.5gcocl2·6h2o、0.94gzncl2、0.0311gh3bo3、0.4gna2edta·2h2o、1.01gthiamine-hcl，其余为0.5mhcl。
上述任一所述聚羟基脂肪酸酯具体可为p3hb、p3hb4hb或phbv。
本发明通过在大肠杆菌中表达9个代谢途径相关的基因和敲除2个内源基因，获得以乙酸为主要碳源生产pha的工程菌(中phbv的合成还需要添加丙酸作为辅助碳源)，并且该工程菌生产pha的产量达到较高的水平，具有较好的工业化应用前景。本发明提供了一种将乙酸转变为高附加值生物可降解材料(即pha)的方法，对拓展乙酸应用和降低pha的发酵成本具有重要意义。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶，均购于neb(newenglandbiolabs，http://www.neb-china.com/)公司；质粒提取和dna片段回收所用的试剂盒购自北京博迈德生物技术公司；e.colijm109为宝生物工程(大连)有限公司的产品；实施例中涉及的dna合成和测序工作由北京博迈德生物技术公司完成。质粒puc19为neb(newenglandbiolabs)公司的产品，货号n3041s。
质粒pkd13、质粒pkd46和质粒pcp20公众均可以从e.coligeneticresourcesatyalecgsc，thecoligeneticstockcenter(http://cgsc2.biology.yale.edu/)获得，编号依次为cgsc#7633、cgsc#7739和cgsc#7637。
质粒pbbr1mcs-2：公众可根据ncbiaccessionnumberu23751.1的序列自行提交基因合成公司获得，该质粒记载在如下文献中：
fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpbbr1mcs，
carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes，1995，gene，166:175-176。
mmye液体培养基的组成如下：每升培养基含6g乙酸、2gnh4cl、5.0g(nh4)2so4、6.0gkh2po4、8.214gmops、0.5gnacl、1ml微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素、0.05g卡那霉素和10g酵母粉，余量为水。其中，微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6gfecl2·4h2o、5gcacl2·2h2o、1.3gmncl2·2h2o、0.38gcucl2·2h2o、0.5gcocl2·6h2o、0.94gzncl2、0.0311gh3bo3、0.4gna2edta·2h2o、1.01gthiamine-hcl，其余为0.5mhcl。
实施例1、重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)的构建
一、重组质粒pmcs-pta-acka的构建
1、人工合成序列表中序列1所示的dna，含有pta-acka表达盒，上游为ecori位点，下游为xbai位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1272位核苷酸为acka基因序列，第1347-3491位核苷酸为pta基因序列。
2、用ecori和xbai双酶切步骤1中合成的dna序列，回收大小为3489bp的dna片段；用ecori和xbai双酶切质粒pbbr1mcs-2，回收大小为5114bp的dna片段；将上述3489bp和5114bp的两个dna片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到e.colijm109中，并涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用ecori和xbai进行酶切验证，酶切产物大小为3489bp和5114bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pmcs-pta-acka或pmcs-pta-acka。将重组质粒pmcs-pta-acka进行测序。根据测序结果，对重组质粒pmcs-pta-acka进行结构描述如下：将质粒pbbr1mcs-2的ecori识别序列和xbai识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第9至3491位所示的dna分子。
重组质粒pmcs-pta-acka表达序列表的序列8所示的乙酸激酶(由acka基因编码)和序列表的序列9所示的磷酸转乙酰酶(由pta基因编码)。
二、重组质粒puc19-phacab的构建
1、人工合成序列表中序列2所示的dna，含有phacab表达盒，上游为hindiii位点，下游为bamhi位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1839位核苷酸为phac基因序列，第1924-3105位核苷酸为phaa基因序列，第3180-3920位核苷酸为phab基因序列。
2、用hindiii和bamhi双酶切步骤1中合成的dna序列，回收大小为3918bp的dna片段；用hindiii和bamhi双酶切质粒puc19，回收大小为2656bp的dna片段；将上述3918bp和2656bp的两个dna片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到e.colijm109中，并涂布于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用hindiii和bamhi进行酶切验证，酶切产物大小为3918bp和2656bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒puc19-phacab或puc19-phacab。将重组质粒puc19-phacab进行测序。根据测序结果，对重组质粒puc19-phacab进行结构描述如下：将质粒puc19的hindiii识别序列和bamhi识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第9至3920位所示的dna分子。
重组质粒puc19-phacab表达序列表的序列10所示的聚羟基脂肪酸酯合成酶合成酶(由phac基因编码)、序列表的序列11所示的β-酮硫解酶(由phaa基因编码)和序列表的序列12所示的乙酰乙酰辅酶a还原酶(由phab基因编码)。
三、重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pmcs-pta-acka和上述二得到的重组质粒puc19-phacab通过化学转化的方法转化到大肠杆菌e.colijm109，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个重组质粒的重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)。
e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)为将pta基因、acka基因、phac基因、phab基因和phaa基因转入大肠杆菌e.colijm109中得到的重组菌。
四、对照菌株e.colijm109(puc19-phacab+pbbr1mcs-2)的构建
1、将质粒pbbr1mcs-2和上述二得到的重组质粒puc19-phacab通过化学转化的方法转化到大肠杆菌e.colijm109，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pbbr1mcs-2)。
e.colijm109(puc19-phacab+pbbr1mcs-2)为将phac基因、phab基因和phaa基因转入大肠杆菌e.colijm109中得到的重组菌。
实施例2、重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-sucd-4hbd)的构建
一、重组质粒pmcs-pta-acka-sucd-4hbd的构建
1、人工合成序列表中序列3所示的dna，含有sucd-4hbd表达盒，上游为xbai位点，下游为saci位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1431位核苷酸为sucd基因序列，第1468-2583位核苷酸为4hbd基因序列。
2、用xbai和saci双酶切步骤1中合成的dna序列，回收大小为2585bp的dna片段；用xbai和saci双酶切质粒pbbr1mcs-2，回收大小为5116bp的dna片段；将上述2585bp和5116bp的两个dna片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到e.colijm109中，并涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用xbai和saci进行酶切验证，酶切产物大小为2585bp和5116bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pmcs-sucd-4hbd。将重组质粒pmcs-sucd-4hbd进行测序。根据测序结果，对重组质粒pmcs-sucd-4hbd进行结构描述如下：将质粒pbbr1mcs-2的xbai识别序列和saci识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第9至2583位所示的dna分子。
重组质粒pmcs-sucd-4hbd表达序列表的序列13所示的琥珀酸半缩醛脱氢酶(由sucd基因编码)和序列表的序列14所示的4-羟基丁酸脱氢酶(由4hbd基因编码)。
3、用xbai和saci双酶切步骤1中合成的dna序列，回收大小为2585bp的dna片段；用xbai和saci双酶切重组质粒pmcs-pta-acka，回收大小为8575bp的dna片段；将上述2585bp和8575bp的两个dna片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到e.colijm109中，并涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用xbai和saci进行酶切验证，酶切产物大小为2585bp和8575bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pmcs-pta-acka-sucd-4hbd。将重组质粒pmcs-pta-acka-sucd-4hbd进行测序。根据测序结果，对重组质粒pmcs-pta-acka-sucd-4hbd进行结构描述如下：将重组质粒pmcs-pta-acka的xbai识别序列和saci识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第9至2583位所示的dna分子。重组质粒pmcs-pta-acka-sucd-4hbd表达序列表的序列8所示的乙酸激酶(由acka基因编码)、序列表的序列9所示的磷酸转乙酰酶(由pta基因编码)、序列表的序列13所示的琥珀酸半缩醛脱氢酶(由sucd基因编码)和序列表的序列14所示的4-羟基丁酸脱氢酶(由4hbd基因编码)。
二、重组质粒puc19-phacab-orfz的构建
1、人工合成序列表中序列4所示的dna，含有orfz表达盒，上游为bamhi位点，下游为ecori位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1359位核苷酸为orfz基因序列。
2、用bamhi和ecori双酶切步骤1中合成的dna序列，回收大小为1357bp的dna片段；用bamhi和ecori双酶切重组质粒puc19-phacab，回收大小为6553bp的dna片段；将上述1357bp和6553bp的两个dna片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到e.colijm109中，并涂布于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用bamhi和ecori进行酶切验证，酶切产物大小为1357bp和6553bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒puc19-phacab-orfz。将重组质粒puc19-phacab-orfz进行测序。根据测序结果，对重组质粒puc19-phacab-orfz进行结构描述如下：将重组质粒puc19-phacab的bamhi识别序列和ecori识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列4自5’末端起第9至1359位所示的dna分子。
重组质粒puc19-phacab-orfz表达序列表的序列15所示的4-羟基丁酰辅酶a：辅酶a转移酶(由orfz基因编码)。
三、大肠杆菌e.colijm109sg的构建
1、敲除sad基因
1)合成sad基因敲除所用的引物sadf和引物sadr。
引物sadf(从5’到3’)：
atgaccattactccggcaactcatgcaatttcgataaatcctgccacgggtgaacaacttgtgtaggctggagctgcttcg引物sadr(从5’到3’)：
tcttttccccgcccagtaacaaacgcgcaccctgcgccagggttttctccacctgatgatattccggggatccgtcgacc。
2)以质粒pkd13为模板，采用引物sadf和引物sadr，pcr扩增得到1500bp左右的dna片段，命名为sad同源重组片段，琼脂糖凝胶电泳对得到的dna片段进行纯化。
经过测序，sad同源重组片段的核苷酸序列为序列6，其中，第1-60位为sad基因上游同源臂，第61-1364位为frt序列和kan抗性基因，第1365-1424位为sad基因下游同源臂。
3)利用电转化的方法将质粒pkd46转化至受体菌株e.colijm109中，并涂布于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，30℃培养24h，得到转化子，提质粒验证，获得e.colijm109(pkd46)。
4)将e.colijm109(pkd46)接种到含有氨苄青霉素的lb液体培养基中，30℃培养1h，加入阿拉伯糖至终浓度5g/l，继续培养1.5h，接下来制备e.colijm109(pkd46)的感受态细胞，将步骤2)中获得的dna片段转入e.colijm109(pkd46)的感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养24h，得到转化子。
5)利用菌落pcr的方法，以引物sadf和引物sadr为引物，将pcr产物纯化之后测序，筛选正确的sad基因已经被替换为kan抗性基因的克隆，得到e.colijm109sad-k(pkd46)。
6)将e.colijm109sad-k(pkd46)接种于lb液体培养基中，42℃培养传代三次，除去质粒pkd46，得到e.colijm109sad-k；e.colijm109sad-k是sad基因被kan基因替换了的e.colijm109。
7)将e.colijm109sad-k接种到含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养24h，转接到含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养3h，制备e.colijm109sad-k感受态细胞。
8)利用电转化的方法将质粒pcp20转化到e.colijm109sad-k感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，30℃培养48h，得到转化子。
利用菌落pcr的方法验证转化子，以引物sadf引物和sadr为引物，得到202bp片段的为阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除e.colijm109基因组上的sad基因得到的菌，将该菌接种到lb液体培养基中，42℃传代三次，除去质粒pcp20，命名为突变体e.colijm109s。
2、敲除gabd基因
与上述1的方法基本相同，不同的是如下：
gabd敲除引物为引物gabdf和引物gabdr。
引物gabdf(从5’到3’)：
atgaaacttaacgacagtaacttattccgccagcaggcgttgattaacggggaatggctggtgtaggctggagctgcttcg；引物gabdr(从5’到3’)：
tgctcttccacttttgctaccgctttttcatcgatcagcggcccgatggtgacgccgttaattccggggatccgtcgacc。
gabd同源重组片段的核苷酸序列为序列7，其中，第1-60位为gabd基因上游同源臂，第61-1364位为frt序列和kan抗性基因，第1365-1424位为gabd基因下游同源臂。
转化受体菌株为上述1得到的突变体e.colijm109s。
利用菌落pcr的方法验证转化子，以引物gabdf和引物gabdr为引物，得到202bp的片段阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除e.colijm109s基因组上的gabd基因得到的菌，将该菌接种到lb液体培养基中，42℃传代三次，除去质粒pcp20,命名为突变体e.colijm109sg。突变体e.colijm109sg敲除了非辅酶a循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(即sad基因和gabd基因)。
四、重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-4hbd-sucd)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pmcs-pta-acka-sucd-4hbd和上述二得到的重组质粒puc19-phacab-orfz通过电转化的方法转化到大肠杆菌e.colijm109sg，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-4hbd-sucd)。
e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-4hbd-sucd)为将pta基因、acka基因、phac基因、phab基因、phaa基因、orfz基因、4hbd基因和sucd基因转入大肠杆菌e.colijm109sg中得到的重组菌。
五、对照菌株e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-4hbd-sucd)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pmcs-4hbd-sucd和上述二得到的重组质粒puc19-phacab-orfz通过电转的方法转化到大肠杆菌e.colijm109sg，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有质粒的重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-4hbd-sucd)。
e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-4hbd-sucd)为将phac基因、phab基因、phaa基因、orfz基因、4hbd基因和sucd基因转入大肠杆菌e.colijm109sg中得到的重组菌。
实施例3、重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)的构建
一、重组质粒puc19-phacab-pct的构建
1、人工合成序列表中序列5所示的dna，含有pct表达盒，上游为bamhi位点，下游为ecori位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1623位核苷酸为pct基因序列。
2、用bamhi和ecori双酶切步骤1中合成的dna序列，回收大小为1621bp的dna片段；用bamhi和ecori双酶切重组质粒puc19-phacab，回收大小为6553bp的dna片段；将上述1621bp和6553bp的两个dna片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到e.colijm109中，并涂布于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用bamhi和ecori进行酶切验证，酶切产物大小为1621bp和6553bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒puc19-phacab-pct。将重组质粒puc19-phacab-pct进行测序。根据测序结果，对重组质粒puc19-phacab-pct进行结构描述如下：将重组质粒puc19-phacab的bamhi识别序列和ecori识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第9至1623位所示的dna分子。
重组质粒puc19-phacab-pct表达序列表的序列16所示的丙酰辅酶a转移酶(由pct基因编码)。
二、重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)的构建
1、将实施例1中一构建的重组质粒pmcs-pta-acka和上述二得到的重组质粒puc19-phacab-pct通过化学转化的方法转化到大肠杆菌e.colijm109，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)。
e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)为将pta基因、acka基因、phac基因、phab基因、phaa基因和pct基因转入大肠杆菌e.colijm109中得到的重组菌。
三、对照菌株e.colijm109(puc19-phacab-pct)的构建
1、把上述二得到的重组质粒puc19-phacab-pct通过化学转化的方法转化到大肠杆菌e.colijm109，并涂布于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有一个质粒的重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct)。
e.colijm109(puc19-phacab-pct)为将phac基因、phab基因、phaa基因和pct基因转入大肠杆菌e.colijm109中得到的重组菌。
四、对照菌株e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)的构建
如实施例1中三所述。
实施例4、重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)在生产p3hb中的应用
一、重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)摇瓶培养生产p3hb
1、将实施例1中三构建的重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到mmye液体培养基中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养48h，收集菌体，冷冻干燥，酯化。
3、通过气相色谱对基因工程菌产生的p3hb进行定量检测。具体条件如下：
使用福立公司gc-9790ii型气相色谱仪，色谱柱为db-5毛细管柱，非极性。用氮气作为载气，氢气作为燃气，空气为助燃气。进样量为1μl。进样口：温度为200℃，使用分流模式，分流比为30。检测器：温度为220℃，氢气流量40ml/min，空气流量400ml/min。升温程序如下：第一步，温度80℃，维持时间为2min；第二步，温度变化由80℃到140℃，升温速率30℃/min，然后维持0.5min；第三步，温度变化由140℃到220℃，升温速率40℃/min，然后维持3min。
重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)在摇瓶培养中获得的细胞干重为3.02g/l，其中p3hb含量为42.02％，p3hb产量为1.27g/l。结果表明，该重组菌具有较好的将乙酸转化为p3hb的能力。
二、对照菌株e.colijm109(puc19-phacab+pbbr1mcs-2)摇瓶培养生产p3hb
按照一的方法，将“重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)”替换为实施例1中四构建的重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pbbr1mcs-2)，其它步骤均不变。
重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pbbr1mcs-2)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.22g/l，其中p3hb含量为13.80％，p3hb产量为0.31g/l。
上述结果表明，pta基因和acka基因的表达能够明显提高在乙酸为碳源时p3hb的产量，由0.31g/l提高到1.27g/l。由此可见，含有pta基因和acka基因的重组菌在乙酸为碳源合成p3hb时具有明显的优势。
三、重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)在无乙酸条件下的摇瓶培养
按照一的方法，将mmye液体培养基替换为不含乙酸的mmye培养基(与mmye液体培养基的区别仅在于组分中不含有乙酸)，其它步骤均不变。
结果如下：重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pbbr1mcs-2)在摇瓶培养中获得的细胞干重为1.15g/l，其中p3hb含量为3.23％，p3hb产量为0.04g/l。结果表明，虽然重组菌能够在不含乙酸的mmye培养基中生长，但p3hb的产量很低。由此可见，在不添加乙酸的条件下，重组菌能够在培养基中生长，但酵母粉等所含的碳源不足以支撑有效的p3hb合成。上述一中所积累的p3hb主要由乙酸产生，乙酸是该培养条件下用于合成p3hb的主要碳源。
实施例5、e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-4hbd-sucd)在生产p3hb4hb中的应用
一、重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-4hbd-sucd)摇瓶培养生产p3hb4hb
1、将实施例2中四构建的重组菌e.colijm109sg
(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-4hbd-sucd)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到mmye液体培养基中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养48h，收集菌体，冷冻干燥，酯化。
3、通过气相色谱对基因工程菌产生的p3hb4hb进行定量检测。
重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-4hbd-sucd)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.96g/l，其中p3hb4hb含量为58.00％，p3hb4hb产量为1.71g/l，4hb单体含量为5.79mol％。结果表明，该重组菌具有较好的将乙酸转化为p3hb4hb的能力。
二、对照菌株e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-4hbd-sucd)摇瓶培养生产p3hb4hb
按照一的方法，将“重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-pta-acka-4hbd-sucd)”替换为实施例2中五构建的重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-4hbd-sucd)，其它步骤均不变。
重组菌e.colijm109sg(puc19-phacab-orfz+pmcs-4hbd-sucd)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.37g/l，其中p3hb4hb含量为35.79％，p3hb4hb产量为0.85g/l，4hb单体含量为9.48mol％。
上述结果表明，pta基因和acka基因的表达能够明显提高在乙酸为碳源时p3hb4hb的产量，由0.85g/l提高到1.71g/l。由此可见，含有pta基因和acka基因的重组菌在乙酸为碳源合成p3hb4hb时具有明显的优势。
实施例6、e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)在生产phbv中的应用
一、重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)摇瓶培养生产phbv
1、将实施例3中二构建的重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到mmye液体培养基中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养6h；然后加入丙酸并使丙酸在体系中的浓度为1.5g/l，继续培养42h，收集菌体，冷冻干燥，酯化。
3、通过气相色谱对基因工程菌产生的phbv进行定量检测。
重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.42g/l，其中phbv含量为13.43％，phbv产量为0.33g/l，3hv单体含量为13.71mol％。结果表明，该重组菌具有较好的将乙酸和丙酸转化为phbv的能力。
二、对照菌株e.colijm109(puc19-phacab-pct)摇瓶培养生产phbv
按照一的方法，将“重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)”替换为实施例3中三构建的重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct)，其它步骤均不变。
重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.21g/l，其中phbv含量为9.43％，phbv产量为0.19g/l，3hv单体含量为10.11mol％。
根据一和二的结果，pta基因和acka基因的表达能够明显提高在乙酸和丙酸为碳源时phbv的产量，由0.19g/l提高到0.33g/l。由此可见，含有pta基因和acka基因的重组菌在乙酸和丙酸为碳源合成phbv时具有明显的优势。
三、对照菌株e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)摇瓶培养生产phbv
按照一的方法，将“重组菌e.colijm109(puc19-phacab-pct+pmcs-pta-acka)”替换为实施例3中四构建的重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)，其它步骤均不变。
重组菌e.colijm109(puc19-phacab+pmcs-pta-acka)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.40g/l，其中phbv含量为39.37％，phbv产量为0.959g/l，3hv单体含量仅为2.43mol％。
根据一和三的结果，pct基因的表达能够明显提高在乙酸和丙酸为碳源时phbv中3hv单体的含量，其丙酰辅酶a转移酶活性有助于提供更多的丙酰辅酶a前体，用于3hv的聚合。
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<120>利用乙酸和丙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用
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<211>3499
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
aagaattcttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagctactagagaaagaggag60
aaatataccatgtcgagtaagttagtactggttctgaactgcggtagttcttcactgaaa120
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ctgactgcctgatttcacaccgccagctcagctggcggtgctgttttgtaacccgccaaa1320
tcggcggtaacgaaagaggataaaccatgtcccgtattattatgctgatccctaccggaa1380
ccagcgtcggtctgaccagcgtcagccttggcgtgatccgtgcaatggaacgcaaaggcg1440
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