本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种辅助检测猪100kg背膘厚的方法。
背景技术：
：鉴于猪100kg背膘厚性状是影响猪生长速度、瘦肉率及胴体分级的重要因素之一，一直以来，100kg背膘厚性状是世界范围内种猪育种的重点经济性状之一。因此，针对这种性状，研究者们开展了大量的分子研究工作。其中，qtl定位研究表明，猪7号染色体上存在一个猪100kg背膘厚性状qtl区间，次区间的范围为50.3-120.7mb(malekm,dekkersjc,leehk,baastj,rothschildmf.amoleculargenomescananalysistoidentifychromosomalregionsinfluencingeconomictraitsinthepig.i.growthandbodycomposition.mammgenome2001,12(8):630-636.)。因此，研究此区间内影响100kg背膘厚性状的分子标记单倍型成为了研究重点工作之一。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种与猪100kg背膘厚相关的方法及其应用。本发明所提供的应用具体可为如下：猪基因组中由如下3个snp位点组成的单倍型多态性在辅助检测待测猪的100kg背膘厚中的应用。本发明所提供的应用具体可为如下中的任一种：(1)猪基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚中的应用；(2)用于检测猪基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚中的应用。所述snp位点为：以猪基因组dna为模板，采用由序列表中序列1所示的单链dna和序列表中序列2所示的单链dna组成的引物对进行pcr扩增所得扩增产物的自5’末端起第214位核苷酸；所述snp位点处的核苷酸为a或g。该snp位点位于gpx2基因内的国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第95392358个核苷酸位点a>g突变(记为g.95392358a>g)。本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚的试剂。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚的试剂，是用于检测猪基因组中snp位点(g.95392358a>g)的单核苷酸多态性的物质；所述“用于检测猪基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质”可以能够鉴定snp位点(g.95392358a>g)的单核苷酸多态性的任何物质，如为如下(a)或(b)所示的引物对：(a)由序列表中序列1所示的单链dna和序列表中序列2所示的单链dna组成的引物对；(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链dna分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚的试剂盒。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚的试剂盒，含有所述试剂。所述试剂或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测猪的100kg背膘厚的方法，具体可包括如下步骤：检测待测猪的基因组中snp位点(g.95392358a>g)处的核苷酸为a还是g还是a和g，以确定所述待测猪的基因型是aa还是gg还是ag，根据所述待测猪的基因型按照如下确定待测猪的100kg背膘厚：gg基因型或者ag基因型待测猪的100kg背膘厚多于或候选多于aa基因型的待测猪；所述gg基因型为以猪基因组dna为模板，采用由序列表中序列1所示的单链dna和序列表中序列2所示的单链dna组成的引物对进行pcr扩增所得的扩增产物的自5’末端起第214位核苷酸为g的纯合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第95392358个核苷酸为g的纯合型)；所述aa基因型为以猪基因组dna为模板，采用由序列表中序列1所示的单链dna和序列表中序列2所示的单链dna组成的引物对进行pcr扩增所得扩增产物的自5’末端起第214位核苷酸为a的纯合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第95392358个核苷酸为a的纯合型)；所述ag基因型为以猪基因组dna为模板，采用由序列表中序列1所示的单链dna和序列表中序列2所示的单链dna组成的引物对进行pcr扩增所得扩增产物的自5’末端起第214位核苷酸为a和g的杂合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第95392358个核苷酸为a和g的杂合型)。在所述方法中，所述“检测待测猪的基因组中如下snp位点处的核苷酸为a还是g还是a和g”的方法可为测序分析；所述测序分析可包括pcr扩增和对所述pcr扩增所得产物进行测序两个步骤；所述pcr扩增所用的引物对满足如下条件：以待测猪的基因组dna为模板进行pcr扩增所得扩增产物含有所述snp位点处的核苷酸；具体的，所述引物对可为如上所述(a)或所述(b)所示的引物对。当采用所述引物对(序列1和序列2)进行pcr扩增时，根据待测猪的基因组dna的不同，扩增得到的dna片段如序列表中序列3所示或如序列表中序列4所示。其中，序列3的第214位核苷酸为a；序列4的第214位核苷酸为g。所述试剂或所述试剂盒或所述方法在猪育种中的应用也属于本发明的保护范围。在所述方法中，进行所述pcr扩增时采用的退火温度为58-60℃。进一步，进行所述pcr扩增时采用的扩增程序具体为：95℃预变性5min；95℃变性20s，58.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。进一步，所述pcr反应体系具体为：模板dna200ng，10×pcr扩增缓冲液5μl，dntps终浓度为10mm，上、下游引物各50ng，taqdna聚合酶0.75u，mg2+2.5mmol/l，用ddh2o补足体系至50μl。本发明的第五个目的是提供如下(a)或(b)的方法：(a)培育100kg背膘厚较大的猪的方法，包括选择gg基因型的猪进行育种的步骤；所述gg基因型为以猪基因组dna为模板，采用由序列表中序列1所示的单链dna和序列表中序列2所示的单链dna组成的引物对进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第214位核苷酸为g的纯合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第95392358个核苷酸为g的纯合型)；(b)培育100kg背膘厚较小的猪的方法，包括选择aa基因型的猪进行育种的步骤；所述aa基因型为以猪基因组dna为模板，采用由序列表中序列1所示的单链dna和序列表中序列2所示的单链dna组成的引物对进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第214位核苷酸为a的纯合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第95392358个核苷酸为a的纯合型)。在本发明中，所述猪为杜洛克猪；实验证明，gg基因型和ag基因型的猪的100kg背膘厚显著大于aa基因型的猪的100kg背膘厚；gg基因型猪的100kg背膘厚比aa基因型猪的100kg背膘厚大约0.54mm(p<0.05)。所以snp位点(g.95392358a>g)可作为猪100kg背膘厚性状分子育种标记。本发明提供的方法可对待选猪进行早期筛选，有效地解决实际生产中的选取优良种猪时间长的问题，降低了育种花费，有效减少或增加实际生产中的猪的100kg背膘厚，该方法准确度高，检测费用低，并可实现自动化检测，在猪的育种方面具有很高的实践应用价值。附图说明图1为aa基因型个体(对应序列3)和gg基因型个体(对应序列4)猪gpx2基因g.95392358a>g多态性位点附近序列的测序结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的杜洛克猪(susscrofa)，购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所实验猪场。实施例1、鉴定猪的100kg背膘厚大小一、猪gpx2基因g.95392358a>g多态性位点的确定(一)以两头杜洛克猪为实验材料，分别提取其耳缘组织的基因组dna。(二)引物的设计与合成根据猪gpx2基因的国际猪基因组10.2版本参考序列(http://asia.ensembl.org/sus_scrofa/info/index)，设计并合成如下引物：u(上游引物)：5’-ataccagggacctctcacct-3’(序列1)；d(下游引物)：5’-agtcaatcctgcatccctcc-3’(序列2)。(三)pcr扩增分别以步骤(一)得到的杜洛克猪的基因组dna为模板，以u和d为引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，分别命名为产物1和产物2。pcr扩增体系：基因组dna200ng，10×pcr扩增缓冲液5μl，dntps终浓度为10mm，上、下游引物各50ng，taqdna聚合酶0.75u，mg2+2.5mmol/l，用ddh2o补足体系至50μl。pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。(四)测序及序列分析将产物1和产物2进行测序，得到产物1的序列(如序列表中序列3所示)和产物2的序列(如序列表中序列4所示)。序列3和序列4只存在一个碱基的差异，均为序列3和序列4中自5’末端起第214位，该处的碱基为在序列3中为a，在序列4中为g，如图1中箭头所示，该位点为国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上的自5′末端起第95392358位，因此将该位点命名为g.95392358a>g。将在国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上的自5′末端起第95392358位的碱基(即步骤(三)得到的pcr扩增产物自5’末端起第214位的碱基)为a的纯合型个体的基因型命名为aa；将在国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上的自5′末端起第95392358位的碱基(即步骤(三)得到的pcr扩增产物自5’末端起第214位的碱基)为g纯合型个体的基因型命名为gg；将在国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上的自5′末端起第95392358位的碱基(即步骤(三)得到的pcr扩增产物自5’末端起第214位的碱基)为a和g的杂合型个体的基因型命名为ga。二、猪gpx2基因g.95392358a>g多态性位点与猪的100kg背膘厚的关联性分析为确定g.95392358a>g多态性位点与猪的100kg背膘厚是否相关，以376头杜洛克猪为实验材料，进行如下试验：(一)提取每头猪的耳缘组织的基因组dna，分别按照步骤一中(三)的方法进行pcr扩增，得到各pcr扩增产物，按照步骤一中(四)的方法确定每头猪的基因型是aa、ga还是gg。(二)在杜洛克猪达180日龄时，每头猪称量体重后，用b超仪测定的每头猪10-11肋骨处的背膘厚作为原始数据，后公式校正为100kg体重背膘厚，校正公式如下：y＝实测背膘厚×(a÷(a+(b×(实测体重-100))))其中，y表示100kg背膘厚估计值，如果为公猪则a为13.468、b为0.111528，如果为母猪则a为15.654、b为0.156646。(三)对猪的基因型与100kg背膘厚开展关联分析，所用模型如下：y＝s+g+e其中，y为100kg背膘厚，s为性别效应，g为基因型效应，e为残差效应。结果如表1所示。表1猪的基因型与猪的100kg背膘厚的关联性分析基因型数量100kg背膘厚±标准误gg707.59±1.42aga2017.54±1.35aaa1057.05±1.25b注：同列上标不同字母表示差异显著(p<0.05)。从表1可见，在猪的100kg背膘厚中，gg基因型和ga基因型的猪的100kg背膘厚显著大于aa基因型的猪的100kg背膘厚，gg基因型猪的100kg背膘厚比aa基因型猪的100kg背膘厚大约0.54mm(p<0.05)。结果表明，用gpx2基因内的国际猪基因组10.2版本参考序列自5’末端起第95392358位单核苷酸多态性可用于鉴定猪的100kg背膘厚相关性状。在实际的猪育种中，为获得更大100kg背膘厚的猪，最好选择gg基因型的猪进行育种；为获得更小100kg背膘厚的猪，最好选择aa基因型的猪进行育种。序列表<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所<120>一种辅助检测猪100kg背膘厚的方法<130>iasbf01<160>4<211>201<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1ataccagggacctctcacct20<211>202<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2agtcaatcctgcatccctcc20<211>5903<212>dna<213>猪（susscrofa）<400>3ataccagggacctctcacctgatgtccaaattggttgcaagggaagccaagaaccaccag60gcgcctgggaaagcggcattgcagctcgttgagttgggtgaagtcccgggtggttgtgcc120tcagagcgaggccacattctcaatcagcactgccctgcctcggaatgtgttgaaatctac180cttctccccgtccaggctgatagcactgaggtcatagaaggacttggcaatgtaagccat240ggtggaagtgcagagtgagtggcagagtggtgtgagcgtacctgagggtctattaaagtg300ggaatgaggaaggaggagccaggaagaatttcacagtggggctttgagcatccccaggat360gacttagcaaaagcagccacccacctgtaagtgctgtttgagcaaggttgctcctcctat420ttacagactcaacaaagccacctccctgccccaccttgctggcaacctaggaagggccaa480tgtgatatcgctgggcagacgtgaacatgaataattcactgcttgcaggaaaccagagcc540ccaaaggtctgcagggaggaaaaaagggagggagggatgcaggattgact590<211>5904<212>dna<213>猪（susscrofa）<400>4ataccagggacctctcacctgatgtccaaattggttgcaagggaagccaagaaccaccag60gcgcctgggaaagcggcattgcagctcgttgagttgggtgaagtcccgggtggttgtgcc120tcagagcgaggccacattctcaatcagcactgccctgcctcggaatgtgttgaaatctac180cttctccccgtccaggctgatagcactgaggtcgtagaaggacttggcaatgtaagccat240ggtggaagtgcagagtgagtggcagagtggtgtgagcgtacctgagggtctattaaagtg300ggaatgaggaaggaggagccaggaagaatttcacagtggggctttgagcatccccaggat360gacttagcaaaagcagccacccacctgtaagtgctgtttgagcaaggttgctcctcctat420ttacagactcaacaaagccacctccctgccccaccttgctggcaacctaggaagggccaa480tgtgatatcgctgggcagacgtgaacatgaataattcactgcttgcaggaaaccagagcc540ccaaaggtctgcagggaggaaaaaagggagggagggatgcaggattgact590当前第1页12