本发明属于棉花分子育种技术领域，涉及一个与陆地棉第15染色体衣分主效qtl紧密连锁的indel分子标记及其应用。
背景技术：
棉花是世界上重要的经济作物，是纺织工业的主要原材料。长期以来，棉花产量和纤维品质一直是棉花育种改良的两个重要目标。随着纺织工业的快速发展，对纤维品质的要求越来越高，育种家在提高纤维产量的基础上也开始注重纤维品质的同步改良。由于纤维品质和产量性状之间存在连锁累赘，在改良品质的过程中产量尤其是衣分显著降低，因此，如何在改良纤维品质同时提高产量是目前棉花育种研究中的一个重要课题。
衣分是棉纤维产量构成的重要因素之一。遗传研究表明，衣分性状是一个由多基因控制的数量性状，主要受遗传因素控制，受环境影响较小。因此提高衣分对改良棉花产量有着重要影响。近年来，随着分子标记技术的飞速发展，利用分子标记辅助选择聚合育种为棉花纤维品质和产量改良提供了新的育种方法，棉花纤维品质性状qtl定位已经取得了较大的进展，关于棉花衣分qtl定位研究也有一定的开展，例如：利用tm-1与t586构建的f2群体，检测到3个与衣分相关的qtl，解释7.2-9.0％的表型变异率，分别定位到a03连锁群和chr.6(guo,w.z.,ma,g.j.,zhu,y.c.,etal.moleculartaggingandmappingofquantitativetraitlociforlintpercentageandmorphologicalmarkergenesinuplandcotton.journalofintegrativeplantbiology,2006,48(3),320-326)；又如李成奇(棉花衣分等产量性状的遗传,qtl定位及不同衣分材料纤维初始发育的比较研究[d].南京农业大学,2007.)选用陆地棉品种泗棉3号与石短5号构建的f2群体，检测到2个与衣分相关的qtl，解释表型变异分别为6.9％和16.9％，分别位于a3和a4染色体上；马军(用csils系进行棉花衣分和品质性状qtl定位及衣分形成的研究[d].山东农业大学,2012.)利用高衣分染色体片段导入系il-08-7与tm-1构建的f2群体，检测到一个衣分互作的qtl，位于第15染色上；刘芳(陆地棉高密度遗传图谱构建及衣分qtl定位[d].西南大学,2014.)利用tm-1与t586构建的重组自交系群体，共检测到7个衣分qtl，解释表型变异3.5％-52.7％，分别位于第5、7、9、12、17、21、26等7条染色体上，其中3个qtl与前人定位的位置一致；liu(2015)利用渝棉1号与t586构建的f2:7重组自交系群体，在10个环境条件下检测到8个与衣分相关的qtl，分别位于第1、6、7、9、12、17、19、26等8条染色体上，解释3.4-63.4％的表型变异率；shi(2015)利用陆地棉与海岛棉构建的bc1f1，bc1s1,bc2f1和bc2f1-ny群体，检测到26个与衣分相关的qtl，分别位于第5、9、10、12、14、15、16、17、21等9条染色体上，解释4.73-27.51％的表型变异率。
但是目前有关棉花第15号染色体上衣分qtl定位研究的报道较少，而且报道的qtl定位稳定性差，不适合现代快速的分子标记辅助选择(mas)育种和分子聚合育种。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一个与陆地棉第15染色体衣分主效qtl紧密连锁的indel分子标记及其应用；所述indel分子标记定位稳定性好，能够应用于分子标记辅助选择(mas)育种和分子聚合育种。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一个与陆地棉第15染色体衣分主效qtl紧密连锁的indel分子标记sdcc15，所述indel分子标记sdcc15通过如seqidno.1所示的正向引物序列和如seqidno.2所示的反向引物序列扩增获得。
本发明提供了所述的分子标记sdcc15在棉花衣分主效qtl定位和/或基因的图位克隆中的应用。
本发明还提供了所述的分子标记sdcc15在棉花衣分分子标记辅助选择育种和棉花分子聚合育种中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的indel分子标记sdcc15，能够与陆地棉第15染色体衣分主效qtl紧密连锁，能够稳定定位棉花衣分主效qtl，存在所述indel分子标记sdcc15，衣分低；为棉花衣分主效qtl定位/基因的图位克隆奠定基础，能够应用于棉花衣分分子标记辅助选择育种和分子聚合育种，提高选择和聚合效率。
附图说明
图1为重组自交系(ril)群体第15染色体的连锁图谱以及qtl定位结果。
具体实施方式
本发明提供了一个与陆地棉第15染色体衣分主效qtl紧密连锁的indel分子标记sdcc15，所述indel分子标记sdcc15通过如seqidno.1所示的正向引物序列和如seqidno.2所示的反向引物序列扩增获得；所述正向引物序列具体为taatcaatgggcagataacc；所述反向引物序列具体为aaccttttaagggagcaagt。在本发明中，利用所述indel分子标记sdcc15的正向引物和反向引物对所述indel分子标记sdcc15进行pcr扩增获得扩增片段的长度为200bp。
在本发明中，所述indel分子标记sdcc15的获得方法包括以下步骤：1)以高衣分的陆地棉为母本与低衣分的优异纤维种质品系为父本杂交，得到杂种f1代；2)由杂种f1代自交获得f2代；3)选择f2代单株由单粒传连续自交，得到f8重组自交系群体(ril)；4)提取亲本及重组自交系各个家系单株的基因组dna；5)利用多态性引物，以步骤4)提取的重组自交系各个家系的基因组dna为模板进行pcr扩增，构建连锁图谱，结合连锁图谱和各个家系衣分考种的结果，对衣分性状进行qtl定位，获得与第15染色体衣分主效qtl紧密连锁indel分子标记。
在本发明中，所述母本优选的为高衣分(>43％)的抗虫转基因陆地棉，更优选的为鲁棉研22号，所述鲁棉研22号是山东棉花研究中心培育的综合性状优良、适应性广的转基因抗虫棉品种，衣分高；所述父本优选的为鲁原343；所述鲁原343是渐渗海岛棉优异纤维种质的陆地型长绒棉新品系，衣分低。
在本发明中，将所述母本鲁棉研22号与所述父本鲁原343杂交获得杂种f1代，在本发明对所述杂交的方法无其他特殊要求，采用本领域常规的杂交方法即可。
本发明在获得杂种f1代后，由f1代自交获得f2代，本发明中所述f1代自交的方法采用本领域常规的自交方法即可。
本发明在获得f2代后，由f2代单株单粒传连续自交得到f8重组自交系群体(ril)。在本发明中，所述单粒传即为本领域常规的单粒传的重组方法，在本发明具体的实施过程中，从f2代开始每株收一粒种子，混合种植，自交至f8代，获得f8重组自交系群体(ril)。
本发明在获得f8重组自交系群体(ril)后，利用多态性引物，以步骤4)提取的重组自交系各个家系的基因组dna为模板分别进行pcr标记扩增。在本发明中所述多态性引物优选的包括网络数据库中公开的棉花微卫星引物序列。在本发明中，所述网络数据库优选的包括cottonmarkerdatabase(http://www.cottonmarker.org)和cottondatabase(http://www.cottondb.org)在本发明中，所述多态性引物还包括两个亲本的鲁棉研22号和鲁原343的indel位点标记引物；所述indel位点标记引物优选的通过以下方法获得：a)将鲁棉研22号和鲁原343两个亲本的基因组dna分别进行重测序，比对两者重测序获得的重测序数据，分析获得indel位点，b)根据所述indel位点的差异设计引物，将设计的引物在两个亲本中进行多态性的筛选，筛选的具有多态性的标记的引物即为indel位点标记引物。在本发明中所述多态性筛选的方法采用本领域常规的引物多态性筛选的方法即可。
在本发明中，所述pcr标记扩增的反应体系优选的为10μl，具体如下：超纯水(ddh2o)4.7μl，模板dna1.0μl，10×buffer1.0μl，2.5mmmgcl21.0μl，10mmdntps0.2μl，浓度为10μm的正向引物(forwardprimer)1.0μl，反向引物(reverseprimer)1.0μl，taqdna聚合酶0.1μl。所述pcr标记扩增反应程序：预热95℃5min，变性94℃45s，退火52～57℃45s，延伸72℃1min；循环30次，延伸72℃10min；保存4℃至取出；
所述pcr标记扩增后，本发明利用9％非变性聚丙烯酰胺(page)凝胶电泳，记录标记pcr扩增的结果。
本发明在获得所述标记pcr扩增结果后，利用所述标记pcr扩增结果构建连锁图谱。在本发明中，所述构建连锁图谱的方法采用本领域常规的构建连锁图谱的方法即可，优选的利用常规的能够构建连锁图谱的软件来实现，所述软件优选的为joinmap4.0软件；具体的构建连锁图谱的方法参见文献constructing_a_high-density_linkage_map_for_gossypium_hirsutum×gossypium_barbadense_and_identifyingqtlsforlintpercentage【journalofintegrativeplantbiology；(2015)，57-5：450–467】或constructionofahigh-densitygeneticmapandlintpercentageandcottonseednutrienttraitqtlidentificationinuplandcotton(gossypiumhirsutuml.)【molgenetgenomics(2015)290:1683–1700；doi10.1007/s00438-015-1027-5】。
本发明在获得连锁图谱后，结合连锁图谱和各个家系衣分考种衣分率的结果，对衣分性状进行qtl定位，根据所述衣分性状qtl定位的结果确定与第15染色体衣分主效qtl紧密连锁indel分子标记。在本发明中所述qtl定位优选的采用windowsqtlcartographer2.5(voorripsetal.2002)软件来实现。
本发明提供了所述的分子标记sdcc15在棉花衣分主效qtl定位和/或基因的图位克隆中的应用。
本发明还提供了所述的分子标记sdcc15在棉花衣分分子标记辅助选择育种中的应用。在本发明中，所述分子标记辅助选择育种和分子聚合育种应用优选的为利用所述indel分子标记的上游引物和下游引物对育种过程中获得的中间植株的基因组dna进行扩增，确定分子标记sdcc15是否存在于中间植株，从而判断所述中间植株的衣分性状，如果扩增获得正确大小的片段，则说明衣分性状优良，能够提高育种过程中的选择效率和基因聚合的效率。
下面结合实施例对本发明提供的一个与陆地棉第15染色体衣分主效qtl紧密连锁的indel分子标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以高衣分的鲁棉研22号(母)和优异纤维种质低衣分的鲁原343(父)为亲本，构建358个家系的重组自交系f8，其中重组自交系种植于三个不同生态环境(2012年山东临清、2013年山东临清、2013年河南安阳)。
利用18467对ssr引物和26对indel标记首先对鲁棉研22号和鲁原343亲本的dna多态性进行初步分析。ssr标记引物来源于网站cottonmarkerdatabase(http://www.cottonmarker.org)和cottondatabase(http://www.cottondb.org)上已经公布的棉花微卫星引物序列；所述26对indel标记的获得方法包括以下步骤：a)将鲁棉研22号和鲁原343两个亲本的基因组dna进行重测序，比对分析获得indel位点，b)根据indel位点的差异设计引物，将设计的引物在两个亲本中进行多态性的筛选，筛选的具有多态性的标记的引物即为indel位点标记引物。上述引物均由上海生工生物技术公司合成。
pcr反应体系为10μl，其中超纯水(ddh2o)4.7μl，模板dna1.0μl，10×buffer1.0μl，2.5mmmgcl21.0μl，10mmdntps0.2μl，浓度为10μm的正向引物(forwardprimer)1.0μl，反向引物(reverseprimer)1.0μl，taqdna聚合酶0.1μl。ssr扩增反应程序：预热95℃5min，变性94℃45s，退火52～57℃45s，延伸72℃1min；循环30次，延伸72℃10min；保存4℃至取出，利用9％非变性聚丙烯酰胺(page)凝胶电泳，银染显色，银染显色过程为：0.1％agno3银染12-15min，2％naoh+1％甲醛显色5-10min，蒸馏水漂洗2-3次，记录结果。
分子标记初步筛选结果表明，有307对ssr引物在双亲上有差异。将这307对引物分析358个重组自交系分离单株。用joinmap4.0软件构建(鲁棉研22×鲁原343)ril群体的连锁图谱，覆盖1943.5cm的遗传距离，标记间的平均遗传距离为6.33cm，包含38个连锁群，其中37个连锁群对应于棉花26条染色体上。
利用windowsqtlcartographer2.5(voorripsetal.2002)软件进行棉花衣分性状qtl检测，筛选到1个与棉花衣分相关的主效qtl，该qtl位于第15(d1)染色体上，与sdcc15/ssr/lp1紧密，解释8.70-14.16％的表型变异率，如表1和图1所示。图1中重组自交系(ril)群体第15染色体的连锁图谱以及qtl定位结果。图中，右边矩形代表2012年临清(12lq)环境，中间矩形代表2013年临清(13lq)环境，左边矩形代表2013年安阳(13ay)环境。qtl定位的结果，qlp-c15-1在2012年临清(12lq)、2013年临清(13lq)和2013年安阳(13ay)等3个环境下检测到，位于15号染色体的sdcc15和hau1058标记区间内，增效基因来自于亲本鲁棉研22号，解释8.70-14.16％的表型变异率，与qlp-c15-1紧密连锁的标记为sdcc15。
表1利用ril群体检测到的与衣分性状连锁的qtl
获得1对与衣分qtl紧密连锁的特征引物序列和扩增片段大小，如表2所示。
表2与衣分主效qtl紧密连锁的indel标记序列
由上述实施例可知，本发明提供的indel分子标记sdcc15，能够与陆地棉第15染色体衣分主效qtl紧密连锁，能够应用于棉花衣分分子标记辅助选择育种和分子聚合育种，提高选择和聚合效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>山东棉花研究中心
<120>一个与陆地棉第15染色体衣分主效qtl紧密连锁的indel分子标记及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
taatcaatgggcagataacc20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aaccttttaagggagcaagt20