本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种沉默基因或蛋白质表达的sirna序列及其应用。
背景技术：
：小干扰rna（sirna）可特异性沉默靶标mrna表达水平（2006年诺贝尔生理医学奖），因此sirna分子可以通过特异性沉默引起或促进疾病发生或发展的基因，具有治疗基因过表达及基因突变引起的疾病的应用前景（science,2016,352(6292):1417-1420；natchembiol,2006,2(12):689-700.）。自2004年始美国fda已批准20多种sirna分子药物制剂进入了临床试验，其中有近10项iii期临床试验方案在进行。2017年9月，美国alnylam公司（www.alnylam.com）率先宣布其针对甲状腺素运载蛋白(transthyretin，ttr)的sirna药物patisiran在一个家族性淀粉样多发性神经病变（fap）三期临床达到一级、二级终点，这是sirna药物首次在三期临床达到主要临床终点，这意味着sirna药物即将上市进入临床应用。在基因dna双链中，转录时作为mrna（信使rna，携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的rna）合成模板的那条单链叫做模板链或反义链，而转录时不能作为mrna合成模板的那条单链叫有义链或正义链。在sirna双链中，能与argonaute蛋白（ago蛋白）组成rna干扰沉默复合物（risc）的那条单链称为反义链（antisensestrand）或向导链（guidestrand），该链形成的risc复合物能与靶mrna结合，切割并沉默靶mrna。而另外一条无功能的单链称之为正义链（sensestrand）或过客链（passengerstrand）。利用sirna分子的特征，可以设计多条沉默靶基因的sirna序列（naturereviewsgenetics,2015,16(9):543-552.）。pd-l1/cd274全称为程序性死亡受体-配体1（programmedcelldeath-ligand1），是大小为40kda的跨膜蛋白，在大多数肿瘤中存在表达。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的t细胞增生。而t细胞表面的程序性死亡受体-1（pd-1）与程序性死亡受体-配体1（pd-l1）结合，可以传导抑制性的信号，减低t细胞的增生。在肿瘤发生时，肿瘤细胞表面的pd-l1/cd274表达上调，与t细胞表面的pd-1受体相互作用，抑制t细胞的活化与增殖，从而产生肿瘤免疫逃逸（immunotherapy，2016(8),479-488.）。因此，设计小分子抑制剂或抗体抑制pd-1或pd-l1通路，从而利用机体t细胞直接杀灭肿瘤细胞，已成为肿瘤免疫疗法的热点。截止到2017年10月底，针对pd-1靶点的药物分别是百时美施贵宝（bms）公司的nivolumab（商品名opdivo）；由默沙东公司的pembrolizumab（商品名keytruda）。针对pd-1靶点的药物分别是罗氏公司的atezolizumab（商品名tecentriq）；德国默克公司与辉瑞公司共同研发的bavencio（商品名avelumab）；阿斯利康公司的durvalumab，（商品名imfinzi）。国际公布号为wo2017190695a1公布的一种抑制egfr基因表达的sirna，仅仅能够抑制egfr基因表达，不能抑制程序性死亡受体-配体的表达。专利申请号为2015800670256的具有人源化分化族274基因的非人动物，提供了非人动物、用于制备和使用所述非人动物的方法和组合物，其中所述非人动物包含分化簇274(cd274)基因的人源化。此类非人动物在一些实施例中可被描述为具有对内源cd274基因的遗传修饰，以使得所述非人动物表达程序性细胞死亡配体1(pd-l1)多肽。该发明对能够高效沉默人源pd-l1的表达的sirna序列未有公开。技术实现要素：发明目的：提供一种能有效降低肿瘤细胞表面的pd-l1/cd274蛋白的表达水平，促进t淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤力的沉默程序性死亡受体-配体表达的sirna序列及其应用。技术方案：本发明的沉默程序性死亡受体-配体表达的sirna序列，所述的程序性死亡受体-配体是存在于多种肿瘤细胞表面的人程序性死亡受体-配体1（简称pd-l1/cd274），所述的sirna序列为具有下列靶序列、正义链和反义链的核苷酸序列中任意一种：sipd-l1-1靶序列：cagaaagatgaggatattt正义链：5'-cagaaagaugaggauauuunn-3'反义链：5'-aaauauccucaucuuucugnn-3'；sipd-l1-2靶序列：gtatgagtttttcctattt正义链：5'-guaugaguuuuuccuauuunn-3'反义链：5'-aaauaggaaaaacucauacnn-3'；sipd-l1-3靶序列：gtagtagatgttacaattt正义链：5'-guaguagauguuacaauuunn-3'反义链：5'-aaauuguaacaucuacuacnn-3'；sipd-l1-4靶序列：gtagatgttacaattttgt正义链：5'-guagauguuacaauuuugunn-3'反义链：5'-acaaaauuguaacaucuacnn-3；sipd-l1-5靶序列：gtagagtatggtagcaata正义链：5'-guagaguaugguagcaauann-3'反义链：5'-uauugcuaccauacucuacnn-3'；sipd-l1-8靶序列：ggataagaacattattcaa正义链：5'-ggauaagaacauuauucaann-3'反义链：5'-uugaauaauguucuuauccnn-3'；其中，n为a、g、c、u、da、dc、dg、dt中的一种，两个n可以相同也可以不相同；或者两个n中缺一；或者两个n均缺失。上述序列中，正义链的5'端之后的19个核苷酸序列与反义链的5'端之前的19个核苷酸序列互补；其中a为腺嘌呤核糖核苷酸；g为鸟嘌呤核糖核苷酸；c为胞嘧啶核糖核苷酸；u为尿嘧啶核糖核苷酸；da为腺嘌呤脱氧核苷酸；dc为胞嘧啶脱氧核苷酸；dg为鸟嘌呤脱氧核苷酸；dt为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。本发明中，优选所述的nn为两个游离且连续的脱氧核苷酸dtdt。本发明中，采用sirna设计法则，结合计算机辅助设计软件，并通过对比实验筛选得到。采用对照序列：sipd-l1-pc为阳性对照的sirna序列，sinc为阴性对照的sirna序列。在此基础上，经过rt-qpcr及流式细胞术实验筛选，选出pd-l1/cd274基因抑制效率大于50%来进行t淋巴细胞对神经胶质瘤细胞的杀伤作用，评价所设计的序列生物学功能。沉默程序性死亡受体-配体1（pd-l1/cd274）基因表达的几种具有不同核苷酸序列的sirna序列中，候选的sirna靶序列分别如下表所示，它们的正义链和反义链中的nn均为dtdt。序列名称靶序列sipd-l1-1cagaaagatgaggatatttsipd-l1-2gtatgagtttttcctatttsipd-l1-3gtagtagatgttacaatttsipd-l1-4gtagatgttacaattttgtsipd-l1-5gtagagtatggtagcaatasipd-l1-6caaattcccagtagaaaaasipd-l1-7cagtagaaaaacaattagasipd-l1-8ggataagaacattattcaasipd-l1-9caaaatcaaccaaagaattsipd-l1-10caacaactaatgagattttsipd-l1-pcgtatggtagcaatatgacasinc在人和小鼠基因无同源性上表中，其中六条为高效沉默pd-l1/cd274表达的sirna双链，分别是：sipd-l1-1、sipd-l1-2、sipd-l1-3、sipd-l1-4、sipd-l1-5、sipd-l1-8。这六种sirna双链的靶序列中，尤其是sipd-l1-3、sipd-l1-4、sipd-l1-5、sipd-l1-8沉默效果更好，它们的序列中具有基本相同的caat或者tcaa碱基短序列，这可能也是本发明的序列具有较好沉默作用的重要原因之一。所述的sirna序列为sipd-l1-3或者sipd-l1-8时，沉默表达的效果最好。本发明涉及下列三个理论依据：1）rna干扰的理论。sirna为双链结构，进入细胞后，双链解螺旋，变成单链（正义链及反义链，或sensestrand-s,antisensestrand-as），其中的as链与靶mrna(本专利是指与pd-l1/cd274的mrna)序列互补，形成新的局部双链（长短不一致），此时，ago2等细胞内的酶将靶mrna切断。这就是rna干扰理论（2006年诺贝尔生理医学奖），即只要细胞内存在这种rna的双链结构，都可以被类似于ago2等酶切割，mrna就不是完整的结构，就失去了翻译功能，不能翻译为蛋白质。本专利保护的六条sirna片段，可分别结合（序列互补）于pd-l1/cd274的mrna的不同位置，都能够实现rna干扰，沉默pd-l1/cd274mrna的翻译功能。2）肿瘤细胞通过pd-1/pd-l1通路实现免疫逃逸的理论：肿瘤细胞及肿瘤微环境通过上调pd-l1表达（这里说的是，肿瘤细胞本身或其微环境可表达pd-l1），并与细胞毒性的cd8+t细胞表面的pd-1结合，来限制宿主的免疫反应。或理解为人体内的cd8+t细胞，可通过细胞毒性作用来消灭肿瘤；如果人体出现了肿瘤细胞，一般情况下，cd8+t细胞具有抗肿瘤效应；但肿瘤细胞本身表达出的pd-l1，一旦t细胞靠近肿瘤细胞要杀灭肿瘤细胞时，就结合t细胞膜表达的pd-1受体，pd-l1与pd-1结合后，此时经过一系列的信号传导途径，t细胞就不能“执行杀灭肿瘤细胞的任务”了。如果，不让肿瘤细胞表达pd-l1（本专利的sirna沉默pd-l1的表达），或用抗pd-l1的抗体药物让pd-l1失去与t细胞表面表达的pd-1受体结合的能力，就不能抑制t细胞的功能，就不妨碍t细胞“执行杀灭肿瘤细胞的任务”了。本专利发明的sirna序列，从rna水平多个位置切割pd-l1的mrna，从而终止pd-l1蛋白的翻译和表达，从理论上讲，能有效减少pd-l1蛋白水平的突变带来的抑制效价或作用的降低或缺失。因此，本专利发明的sirna序列抑制pd-l1的功能强于临床上已应用的抗体药物。3）得到sirna序列也是遵循现在的一些公知理论，国外大的研究结构开发了一些软件，只需要将靶mrna序列输入该软件，设置一些限定条件，就可以得到多条能特异性沉默该靶mrna的sirna序列，通过合成得到这些sirna片段后，用脂质体将这些sirna转染进细胞后，用pcr技术测定该细胞中完整的靶mrna的量就可以评判这些获得的sirna的沉默效率。但沉默效率又有多个因素的影响，比如与sirna互补的mrna片段是否有二级结构（如螺旋等），不能让sirna中的反义链“很舒服”地与靶mrna结合，不能完全彻底地被ago2等切断，从而pcr的结果表现为沉默效率的差异。在实际应用时，一般选用沉默效率最高的sirna片段。沉默效率低的可用加大给药剂量的方式弥补。本发明的另一目的是提供一种上述沉默程序性死亡受体-配体表达的sirna序列的用途。用于设计和制备因人体病变组织中pd-l1/cd274过度表达、导致免疫系统异常而引起的相关疾病的药物（尤其是针对肿瘤免疫逃逸的抗肿瘤药物）。所述的相关肿瘤疾病为肺癌、肝癌、食管癌、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、头颈癌、脑瘤、胶质细胞瘤中的任一种或多种。有益效果：本发明基于现有生物医药理论，结合实验验证，获得多种高效表达水平的sirna。理论结合医学实践，结论可靠。具有良好的推广应用价值。本发明设计的六条高效特异性沉默程序性死亡受体-配体1（pd-l1/cd274）表达的sirna序列，可以有效降低肿瘤细胞表面的pd-l1/cd274蛋白的表达水平，促进t淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而产生与抑制pd-1/pd-l1通路类似的抑制肿瘤生长效果。而且，从数百种可能的序列中，优选了6种靶序列简单的品种，在合成药物中具有良好的可操作性，未知副作用小。附图说明图1是采用rt-qpcr检测中用lipofectamine2000转染sirna后，人神经胶质瘤细胞系（u87mg）中pd-l1/cd274的mrna表达水平分析图。图1中，纵坐标中文含义：pd-l1相对表达水平。此处表示转染sirna后，细胞还有多少pd-l1表达；表达水平越高，表示加入的sirna沉默pd-l1表达的沉默效率越低。图中的sipd-l-8的沉默效率最高。图2是采用流式细胞术分析用lipofectamine2000转染sirna后，人神经胶质瘤细胞系（u87mg）中表面pd-l1/cd274蛋白的表达效果图。图2中，纵坐标：count指细胞数；横坐标：pe指红色荧光pe的强度，峰面积指整个细胞群的百分比。图3是采用流式细胞术分析用lipofectamine2000转染sirna后，加入人cd8阳性t细胞后，人神经胶质瘤细胞系（u87mg）凋亡效果图。图3中，纵坐标：pi（propidiumiodide)是染细胞核的染料，pi值越高，细胞核染色越深，意味着整个细胞膜被破坏，暴露整个细胞核。av(annexinv)是染细胞膜上凋亡抗原的染料，av值越高，细胞膜凋亡抗原越多。q4是正常细胞群。q1是机械损伤坏死的细胞，指胰酶消化过度，整个细胞被机械损伤了。q2是指晚期凋亡细胞。q3是早期凋亡细胞。具体实施方式实施例1：rt-qpcr验证的sipd-l1-1~10的rna水平的基因沉默效率。如图1所示的，按照公知的细胞生物学的方法，在细胞培养板中转染对数生长期的人神经胶质瘤细胞系（u87mg），在lipofectamine2000转染试剂的辅助下，100nm浓度的sipd-l1-1~10分别与脂质体形成脂质复合物转染细胞，rt-qpcr实验结果显示在rna水平，sipd-l1-1、sipd-l1-2sipd-l1-3、sipd-l1-4、sipd-l1-5及sipd-l1-8均有效沉默pd-l1/cd274基因mrna的表达。其中sipd-l1-8的沉默作用最为显著。实施例2：流式细胞术验证的sipd-l1-1~10的表面蛋白水平基因沉默效率。如图2所示，按照公知的细胞生物学的方法，在细胞培养板中转染对数生长期的人神经胶质瘤细胞系（u87mg），在lipofectamine2000转染试剂的辅助下，100nm浓度的sipd-l1-1~10分别与脂质体形成脂质复合物转染细胞，48小时后，收集细胞，进行流式细胞术检测细胞表面蛋白。结果显示在rna水平，sipd-l1-1、sipd-l1-2、sipd-l1-3、sipd-l1-4、sipd-l1-5及sipd-l1-8均沉默细胞表面pd-l1/cd274蛋白的表达。实施例3：流式细胞术验证沉默pd-l1/cd274后，人cd8阳性t细胞对神经胶质瘤细胞的毒性作用。如图3所示，按照公知的细胞生物学的方法，前面实验已知sipd-l1-3、sipd-l1-5及sipd-l1-8均能将细胞表面pd-l1/cd274蛋白抑制50%以上。在此基础上，在细胞培养板中转染对数生长期的人神经胶质瘤细胞系（u87mg），在lipofectamine2000转染试剂的辅助下，100nm浓度的sipd-l1-3、sipd-l1-5及sipd-l1-8分别与脂质体形成脂质复合物转染细胞，24小时后，加入人cd8阳性t细胞进行干预。继续干预24小时后，进行流式细胞术检测神经胶质瘤细胞的凋亡情况。实验结果显示，sipd-l1-3、sipd-l1-5及sipd-l1-8均可引起细胞凋亡，其中sipd-l1-3的作用最为显著。当前第1页12