本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种防治烟草根茎类病害的生防菌剂及其制备方法。
背景技术：
烟草是一种重要的叶用经济作物，是烟区农民脱贫致富的主要经济来源，但是烟草生长受到根茎类病害青枯病、黑胫病和根黑腐病的严重影响，烟草根茎类病害在热带和亚热带烟区的发生尤为严重，是威胁世界烟草生产的毁灭性病害。3种主要根茎类病害常混合发病，加重危害程度，许多重病区的老病田或旱地烟田，全田发病和绝产无收的现象每年都发生，导致烟叶产量和质量下降而造成的直接产值损失非常严重。烟草青枯病是由茄科拉尔氏菌ralstoniasolanacearum引起的一种细菌性维管束病害。该病在我国南方主要烟区如广西、广东、福建、湖南、浙江等省(自治区)普遍发生，发病面积较大，为害严重，近年来还有向北方烟区扩展的趋势，如山东、河南、陕西及辽宁等省都己有该病的分布和造成为害的记载，局部烟区还相当严重。烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，又称烟草疫病，中国各主要产烟区均有不同程度发生，其中安徽、山东、河南省为历史上的重病区，该病常与烟草青枯病混合发生，故危害更为严重。由于近年来连作烟田面积扩大，此病为害有明显上升之势。烟草黑胫病病原为寄生疫霉烟草致病型(phytophtoraparasiticavar.nicotianaetucker)，为卵菌纲真菌。该病主要为害茎杆，感病植株茎基部初呈水渍状黑斑，后向上下及髓部扩展，绕茎一周时，植株萎蔫死亡，纵剖病茎，可见髓部黑褐色坏死并呈叠片状，长满白色絮状菌丝。烟草根黑腐病也是世界性的病害，在我国云南、贵州、湖北、广西等省区发生较重，严重地块发病率可达30％以上，近年亦有加重危害的趋势。烟草根黑腐病病原thielaviopsisbasicola为基生根串株霉，属半知菌亚门真菌。该病在苗床期以及大田种植时均会发生为害，幼苗期发病，病菌首先从幼苗的土表部位侵入，病斑环绕茎部，并向上入侵子叶，引起腐烂，毁掉烟苗；大田期发病，烟株初期地上部分表现生长停滞，易于萎蔫，拔根可见根尖变褐，黑褐腐烂，严重者病根全部成特异的黑色，须根往往难以拔出，残留在土壤中。
3种烟草根茎类病害的主要侵染源均来源于土壤，特别是历年发病田块，防治上存在较大的困难。特别是烟草青枯病，由于该病属于细菌性病害，植株感病属系统性浸染，因而防治十分困难；烟草黑胫病和根黑腐病属于真菌性病害，目前化学防治上虽有一些相对比较有效的药剂，但对根治病原菌的为害还存在较大的困难，大田植株一旦感病，病情难以控制。此外，化学药剂对烟草根茎类病害的防治还存在诸多不足之处，病菌对化学农药易产生抗药性，大量使用化学农药会造成环境污染和生产成本的上升。近年来，研究比较多的是生物防治和诱导抗病性。生物防治具有无公害、无污染等优点，是在防治烟草根茎类病害上的一种经济、有效和可持续发展途径。利用生防菌防治青枯病是近年来做得较多的研究之一，如罗宽等用拮抗的pseudomonasspp.在温室防治烟草青枯病取得较好防效，但未应用于大田；印度的anuratha和gnanamanick用p.fluorescens进行多种作物青枯病的防效试验，均取得良好防效。hayward等在菲律宾的研究发现菌根菌可以减轻青枯病的发生，suresh等发现泡襄丛枝菌根提取物对青枯菌的生长繁殖有强烈的抑菌作用。目前生物防治方法可在一定程度上减轻青枯病的为害，但目前实际应用中还存在防效不稳定等局限性。由于田间由发生多种根茎类病害混合发生为害的现象，因此，如何筛选可同时抑制3大根茎类病害的生防菌剂及其最佳使用方法，是烟草根茎类病害防治上亟待解决的问题。
洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacepacia)是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性杆菌，因其可以产生多种抗菌成分而成为生物防治中的主要成员。近年来的研究表明，洋葱伯克霍尔德氏菌不是一个种，而是一组表型相近但基因型不同的复合物，称为洋葱伯克霍尔德氏菌群(burkholderiacepaciacomplex，简称bcc)，至今已发现bcc包括20个不同的基因型，由于这些基因型之间有很低的dna杂交率，因此可代表不同的种。上个世纪80年代初，人们在研究中发现部分bcc菌株可降解农药和除草剂中一些长期存在且对人有潜在致癌作用的化学物质，还可净化污水，具有非常好的生态和经济价值；同时还发现有些bcc菌株具有防治植物病虫害和促进植物生长的作用，被制成生物杀虫剂和生物杀菌剂，在农业生产中起着重要作用。但是，与此同时，人们又发现该菌的一些菌株是人体条件致病菌。欧美一些国家因其部分菌株为条件致病菌而放弃或者限制bcc生物农药的使用，但目前仍有不少国家在生产和使用以它为原料制成的生物农药，我国也于1996年注册了该类产品。
bcc由20个种(或基因型)构成，包括b.cepacia、b.multivorans、b.cenocepacia、b.stabilis、b.vietnamiensis、b.dolosa、b.ambifaria、b.anthina、b.pyrrocinia、b.ubomensis、b.latens、b.diffusa、b.arboris、b.seminalis、b.metallica、b.contaminans、b.lata、b.pseudomultivorans、b.stagnalis和b.territorii。这些种在自然界普遍存在，尤其与植物关系密切。目前已研究发现，bcc致病菌株与特定的毒力基因(bcesm基因)存在相关性。bcesm基因被认为是bcc菌中一种与人体致病性/毒性连锁的遗传标记，对已经注册的洋葱伯克霍尔德氏菌株，一旦发现该类标记的存在，则撤销注册。因此，通过致病因子bcesm基因的检测，可以区分bcc的致病菌株和非致病菌株。当然，为了确保bcc生防菌株使用的安全性，利用动物模型(小白鼠)或植物模型来进一步检测菌株是否有致病性也是必要的。苜蓿一般用于医院呼吸道感染细菌致病性测定的模式植物。人们研究发现，苜蓿可以代替老鼠作为模式植物测定bcc菌群对哺乳动物的毒性，苜蓿模型甚至表现出了比老鼠模型更高的灵敏度。因此，用苜蓿模型可简单快捷地检测出bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性，为安全利用bcc菌株奠定了基础。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种生防菌剂及其制备方法，该生防菌剂能有效控制烟草青枯病、黑胫病和根黑腐病3种病害，且该生防菌剂对烟草生长有显著促进作用。
本发明提供的技术方案如下：
一种防治烟草根茎类病害的生防菌剂，所述的生防菌剂的活性成分是由菌株16029和菌株16098两种细菌混合发酵的发酵液组成。
作为优选，菌株16029的分类学命名为burkholderiaanthina，于2018年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.15165。
作为优选，菌株16098的分类学命名为burkholderiacenocepacia，于2018年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.15166。
本发明还提供了所述的防治烟草根茎类病害的生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)种子液制备：将菌株16029和菌株16098分别接种在营养肉汁培养基na上独立培养，30℃摇床振荡培养20-24h，将两菌株培养液等量混合，即得生防菌剂的种子液；
(2)菌剂发酵液的获得：取培养好的生防菌剂的种子液接种到发酵培养基上，25-28℃振荡培养30-36h，得到生防菌剂的发酵液；
(3)本发明生防菌剂的获得：向生防菌剂的发酵液中添加菌剂添加剂，搅拌均匀，即得生防菌剂。
作为优选，步骤(2)中发酵培养基为：麦芽浸粉2.0g/l，蔗糖8.0g/l，酵母粉2g/l、磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸锰0.3g/l，nacl3.0g/l，ph值为6.5-7.0。
作为优选，步骤(2)中种子液的接种量为3％。
作为优选，步骤(3)中菌剂添加剂是将麦麸和豆饼粉按质量比2:1混合、烘干并粉碎后得到的。
作为优选，步骤(3)中菌剂添加剂的添加量为2％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的生防菌剂能同时对烟草青枯病、烟草黑胫病和烟草根黑腐病3种主要根茎类病害的病原菌具有较强的抑制作用，可作为烟草根茎类病害的生防菌剂加以利用。本发明菌剂作为生防菌剂在防治烟草根茎类病害上显示出良好的应用前景，盆栽防治试验结果表明，接种菌剂对烟草青枯病的防治效果达84.77％；而大田防治试验对烟草青枯病的防治效果也达到80.64％，对黑胫病以及根黑腐病的防治效果均达到85％以上，显著优于化学药剂的防治效果，较好地控制了烟草根茎类病害的为害。
(2)本发明的生防菌剂同时具有溶磷和解钾特性，接种该生防菌剂对烟草生长具有显著促进作用。
(3)本发明的生防菌剂容易培养，发酵条件简单，容易操作，只要提供了生长良好的种子液，一般烟农可利用简易的发酵条件进行扩大培养获得菌剂发酵液，培养后的发酵液添加生防助剂后可直接应用于生产，具有良好的推广应用前景。
(4)本发明的生防菌剂对于减少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义。
附图说明
图1为两株bcc菌株的抑菌效果；
图2为本发明的生防菌剂对烟草的促生长效果；
图3为本发明的生防菌剂防治烟草青枯病的盆栽试验效果；
图4为本发明的生防菌剂所用bcc菌株对烟草的致病性检测结果；
图5为本发明的生防菌剂所用bcc菌株对苜蓿的致病性检测结果。
保藏信息说明
burkholderiaanthina，其保藏编号为cgmccno.15165，保藏日期为2018年01月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)；
burkholderiacenocepacia，其保藏编号为cgmccno.15166，保藏日期为2018年01月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)。
具体实施方式
以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
(1)菌株的筛选
本发明所述的复合微生物菌剂所包含的2株生防菌(菌株原始编号分别为16029和16098)均是从广西壮族自治区北海市合浦县木薯主产区的木薯根系土壤中分离筛选出来的，上述菌株已于2018年01月保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，菌株16029和菌株16098的保藏编号分别为cgmccno.15165和cgmccno.15166。
(2)菌株的分类鉴定
通过菌落形态、16srdna序列分析、biolog细菌鉴定系统、bcc菌群的特异性扩增pcr、bcc的不同基因型鉴定引物检测等分析，将保藏编号为cgmccno.15165以及cgmccno.15166的两株细菌分别鉴定为花园伯克霍尔德氏菌(burkholderiaanthina)和新洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacenocepacia)。
实施例2：生防菌剂的制备
本发明生防菌剂的发酵液由菌株16029和菌株16098种子液混合培养获得，基于以下实验筛选结果：
(1)菌株16029和菌株16098都具有溶磷解钾效果，但是菌株16029的溶磷解钾效果要比菌株16098的好一些。
(2)两菌株都能抑制烟草青枯病等重要植物病原菌，具有生防潜力，但菌株16098的生防效果较16029的要好一些。两菌株的菌悬液和培养原液有较强的抑菌作用，但无菌过滤液抑菌效果均不明显。两株bcc菌的抑菌效果筛选见图1。
(3)在培养条件一致的情况下，两菌株的生长曲线是基本一致的。
(4)通过测定不同碳源、氮源和无机盐对两菌株生长的影响，确定菌剂的种子培养基为普通营养肉汁培养基na(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl5.0g，加定容至1l，ph7.0)；菌剂扩大培养(发酵)的培养基为：麦芽浸粉2.0g/l，蔗糖8.0g/l，酵母粉2g/l、磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸锰0.3g/l，nacl3.0g/l，ph值为6.5-7.0。
所述的防治烟草根茎类病害的生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)本发明菌剂种子液的获得：将菌株16029和菌株16098分别接种在na培养基上独立培养，30℃摇床振荡培养20-24h，将两菌株培养液等量混合即为本发明菌剂的种子液。
(2)菌剂发酵液的获得：取培养好的种子液接种到发酵培养基上，接种量为3％，25-28℃振荡培养30-36h即得本发明菌剂的发酵液。
(3)本发明菌剂的添加剂(助剂)制备：麦麸和豆饼粉按2:1(重量比)混合烘干并粉碎，灭菌后密封保存。
(4)本发明生防菌剂的获得及其使用：向菌剂发酵液中添加2％上述菌剂添加剂(助剂)即为本发明生防菌剂，按需要稀释相应的倍数后可直接在生产上使用。
本发明菌剂发酵培养基容易制备，发酵条件简单，为满足田间使用量较大的要求，一般烟农可在获得种子液和菌剂助的条件下自己制备发酵培养基并进行简单的发酵培养，培养后的发酵液按比例与助剂混合可直接使用。
实施例3：本发明的生防菌剂的植物促生长特性
(1)土壤培养法测定菌剂的溶磷解钾效果
以基本栽培土红壤土与育苗基质等体积混合，并加入适量磷酸钙和钾长石粉，混合均匀后装瓶灭菌，接种本发明菌剂发酵液，接种量为3％，对照接等量无菌培养液，20d后测定各处理的有效磷和有效钾含量。有效磷采用钼锑抗比色法测定，有效钾则采用火焰光度法测定。
实验结果表明，接种处理前期混合基质的有效磷和有效钾含量分别为8.2mg/kg和117.6mg/kg；20d后接种菌剂处理的有效磷和有效钾含量分别14.2mg/kg和144.5mg/kg，而对照处理的则分别为8.6mg/kg和119.0mg/kg。
可见，接种生防菌剂处理20d后基质的有效磷和有效钾含量均有较大幅度提高，且分别比对照处理的提高了65.12％和21.43％。
(2)本发明的生防菌剂对烟草幼苗的促生长作用
烟草育苗盆经常规育苗处理，烟苗长出两片真叶后以本发明菌剂30倍稀释液喷施2次(间隔7d)，对照喷施等量清水。
如图2所示，本发明的生防菌剂处理过的烟苗长势明显优于对照，菌剂接种处理的烟草幼苗叶片的叶面积、叶绿素含量分别比对照提高27.5％和34.8％。
实施例4：本发明的生防菌剂在防治烟草根茎类病害上的防治试验
(1)本发明菌剂防治烟草青枯病的盆栽接种试验
盆栽试验中的栽培土为健康水稻田的耕作层土壤，烟草按常规育苗移栽，每盆单株种植，移栽7d、14d和21d后分别接种本发明菌剂的30倍稀释发酵液，每次单株接种200ml，对照接等量清水。烟草青枯病菌的接种则选用本研究团队从广西百色烟草主产区的青枯病株上分离筛选获得具有较强致病力的3株劳尔氏青枯菌的混合菌液，接种浓度为108cfu/ml，每盆(株)灌根接种菌悬液150ml；烟草青枯病菌的第一次接种时间为移栽后第10d，以后每隔3天接种等量病原菌液1次，连续接种5-8次至对照出现明显青枯病症状。对照(ck)开始出现典型青枯病症状后开始对烟草的发病情况进行连续调查，记录发病植株数，根据以下公式计算菌剂接种的相对防治效果：
防效＝{(空白对照处理病株率-防治处理区病株率)/空白对照处理病株率}×100。
试验研究结果显示，烟草移栽25d(青枯菌接种15d)后对照即出现青枯病症状，接种本发明生防菌剂处理的烟苗则在移栽30d后才第一次出现个别植株发病症状；移栽50d后接种菌剂处理的烟草病株率为11.5％，且全部为1级病株，而对照的病株率为75.5％，且30％的病株病情达7-9级。根据病株率计算本发明菌剂对烟草青枯病的防治效果达84.77％。
(2)本发明的生防菌剂防治烟草3种主要根茎类病害的大田试验
田间小区防治试验设3个处理，分别为本发明菌剂处理、化学药剂防治处理和空白对照(ck，不做防治处理)，处理方案详见表1。每处理设4个重复小区，每小区面积约为0.08亩，烟草株数80株，即每处理合计试验烟草株数为320株。
表1烟草根茎类病害小区防治试验处理方案
烟草青枯病、烟草黑胫病以及烟草根黑腐病的调查及分级标准按《烟草病害分级及调查方法》(我国烟草行业标准yc/t39-1996)。
病情指数以及防治效果按以下公式进行计算：
病情指数＝{∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)}×100
相对防治效果(％)＝{(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数}×100
根据最后一次调查结果计算各处理的病情指数和防治效果(见表2)。
表2烟草3种根茎类病害小区试验防治效果
如表2所示，本发明的生防菌剂对烟草青枯病的防治效果达到80.64％，对黑胫病以及根黑腐病的防治效果则分别达到85.13％和87.83％，其防治效果明显优于化学药剂，可有效控制烟草3种病害的为害。
实施例5：本发明的生防菌剂的安全性评价
分别测定了生防菌剂所用的bcc菌株对洋葱、烟草叶片和苜蓿是否具有致病性；同时，通过pcr特异性扩增，检测菌株是否含有bcc菌群的致病因子(bcesm)，从而证明菌剂对植物、人畜以及生态环境是否安全。
(1)对洋葱以及烟草叶片的致病性检测
不同bcc菌株分别活化培养，对洋葱鳞茎的致病性检测用1ml一次性灭菌注射器吸取100μl含107个细胞的供试菌株的菌悬液，针刺接种新鲜且健康的洋葱鳞茎，以无菌水作对照。接种后于人工气候箱内在30℃、相对湿度95％和12h光/12h暗的条件下培养，每天观察洋葱鳞茎是否腐烂。用同样浓度的菌悬液接种烟草，以一次性接种注射器把1ml菌悬液压入叶片，以注入1ml无菌水作为对照。5-7d后，观察注射部位是否会出现褐色过敏性坏死斑。
如图4所示，接种洋葱鳞茎7d后，洋葱鳞茎没有腐烂迹象；烟草叶片接种后，同样与对照无异，没有出现过敏性坏死斑。该研究表明本发明菌剂所有的两株bcc菌对洋葱和烟草均没有致病性，菌株不是植物病原菌，对植物安全。
(2)供试菌株对苜蓿的致病性检测
苜蓿是代替老鼠作为测定bcc对动物毒性的模式植物，用苜蓿模型可简单快捷地检测出bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性。
将供试两个菌株分别接种到lb培养基中，30℃摇床培养(180rpm)培养24h，离心收集菌体，以无菌水调菌悬液浓度到108/ml用于接种。紫花苜蓿种子用98％浓硫酸浸泡20min，以无菌水清洗4次，然后泡在灭菌水中，30℃浸种7h，再清洗2次，换水后再浸泡10h，然后将种子放在水琼脂平板上准备接种。将琼脂平板上的种子用接种针刺一个小孔，取20μl准备好的菌悬液点接种在伤口处，以针刺接种无菌水的种子作为对照。接种后的种子置于28℃光照培养箱中培养，7d后检查接种发病情况。
如图5所示，接种供试菌株的处理与无菌水对照一样均无发病症状，接种点附件无坏死现象，种子根和子叶均生长良好，没有出现共黄化现象。该结果表明供试菌株对哺乳动物是安全的。
(3)供试菌株是否含有bcc致病因子bcesm的检测
bcc菌群的致病因子b.cepaciaepidemicstrainmarker(bcesm)序列的检测用mahenthiralingam(1997)设计的引物bcesm1：5'-ccacggacgtgactaaca-3'和bcesm2：5'-cgtccatccgaacacgat-3'进行pcr扩增，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像分析仪成像。
经pcr检测，两株供试菌株均没有扩增出约1400bp的bcesm致病因子序列。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110>广西壮族自治区农业科学院微生物研究所
<120>一种防治烟草根茎类病害的生防菌剂及其制备方法
<130>zyws
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1394
<212>dna
<213>burkholderiasp.
<400>1
gcagtcgaacggcagcacgggtgcttgcacctggtggcgagtggcgaacgggtgagtaat60
acatcggaacatgtcctgtagtgggggatagcccggcgaaagccggattaataccgcata120
cgatctacggatgaaagcgggggaccttcgggcctcgcgctatagggttggccgatggct180
gattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagag240
gacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggg300
gaattttggacaatgggcgaaagcctgatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt360
cgggttgtaaagcacttttgtccggaaagaaatccttggctctaatacagccgggggatg420
acggtaccggaagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagg480
gtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggtttgctaagaccg540
atgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattggtgactggcaggctagagtatgg600
cagaggggggtagaattccacgtgtagcagtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccg660
atggcgaaggcagccccctgggccaatactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaa720
acaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactagttgttggggatt780
catttccttagtaacgtagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaag840
attaaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattc900
gatgcaacgcgaaaaaccttacctacccttgacatggtcggaatcctgctgagaggcggg960
agtgctcgaaagagaaccggcgcacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtga1020
gatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgctacgcaagagca1080
ctctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatg1140
gcccttatgggtagggcttcacacgtcatacaatggtcggaacagagggttgccaacccg1200
cgagggggagctaatcccagaaaaccgatcgtagtccggattgcactctgcaactcgagt1260
gcatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgg1320
gtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttttaccagaagtggctagtcta1380
accgcaaggaggac1394
<210>2
<211>1393
<212>dna
<213>burkholderiasp.
<400>2
gcagtcgaacggcagcacgggtgcttgcacctggtggcgagtggcgaacgggtgagtaat60
acatcggaacatgtcctgtagtgggggatagcccggcgaaagccggattaataccgcata120
cgatctatggatgaaagcgggggaccttcgggcctcgcgctatagggttggccgatggct180
gattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagag240
gacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggg300
gaattttggacaatgggcgaaagcctgatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt360
cgggttgtaaagcacttttgtccggaaagaaatccttggctctaatacagtcgggggatg420
acggtaccggaagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagg480
gtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggtttgctaagaccg540
atgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattggtgactggcaggctagagtatgg600
cagaggggggtagaattccacgtgtagcagtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccg660
atggcgaaggcagccccctgggccaatactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaa720
acaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactagttgttggggatt780
catttccttagtaacgtagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaag840
attaaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattc900
gatgcaacgcgaaaaaccttacctacccttgacatggtcggaatcctgctgagaggcggg960
agtgctcgaaagagaaccggcgcacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtga1020
gatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgctacgcaagagca1080
ctctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatg1140
gcccttatgggtagggcttcacacgtcatacaatggtcggaacagagggttgccaacccg1200
cgagggggagctaatcccagaaaaccgatcgtagtccggattgcactctgcaactcgagt1260
gcatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgg1320
gtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttttaccagaagtggctagtcta1380
accgcaaggagga1393