一种抗烟草花叶病毒的N′au基因及其克隆方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物保护技术领域，进一步属于烟草病毒防治技术领域，具体涉及一 种抗烟草花叶病毒的，基因及其克隆方法和应用。
【背景技术】
[0002] 烟草花叶病毒病（Tobaccomosaicvirus,TMV)是中国重要的烟草病害，每年造 成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列（朱贤朝，2002)。TMV病毒存在TMV-Cg株系和 TMV-U1株系等株系分化，其中，TMV-U1株系是烟草上的主要危害株系。中国烤烟主栽品种 K326和云烟87等均不抗TMV-U1株系，一般主要采取培育无毒苗、药剂防治和销毁田间病残 体等措施防治，对控制TMV的发生和流行上有一定的效果，但TMV在局部田块爆发的情况仍 然时有发生，造成较大的经济损失(朱贤朝，2002)。因此，种植TMV抗病品种依然是防控TMV 最根本、最经济有效的手段；而对抗病品种的要求是抗性高、无产量劣势、无农艺性状劣势。
[0003] 目前，烤烟的TMV抗源主要来源于烟草野生种心叶烟（TVYco ，其 抗性由一个显性单基因（Λ0控制，Λ基因抗TMV-U1株系。Λ基因于1994年被克隆，是植物 中克隆的第一个NBS类抗病基因（Whitham，1994)。Λ基因的基因组序列大小为6656bp，包 括5个外显子和4个内含子，属于TIR-NBS-LRR类型抗病基因。在其编码蛋白的N端编码一 个与果绳Toll蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体（Toll/interleukin-Ireceptor，TIR) 的胞外域相似的结构，还编码核苷酸结合位点（nucleotide-binding-site，NBS)和富含亮 氨酸的重复序列（leucine-richrepeat，LRR)结构域（Whitham, 1994)。Λ基因的抗病机理 为在病毒侵染位点出现过敏性坏死斑(枯斑)，通过诱导产生的细胞过敏性死亡限制TMV在 植物体内的移动。在介导了过敏反应后，烟草植株能够获得系统性抗性，对TMV或其它类似 病原的再次入侵产生广谱抗性(Whitham，1994)。通过一系列的常规杂交和回交转育， 因的抗性从心叶烟先转育至香料烟中，后转育至烤烟品种中（Bagley，2002)。采用杂交育 种转育因的抗性，实际上是转育携带因的染色体片段(简称为Ml入片段)。世界 上抗TMV烤烟育种利用的抗TMV基因几乎都是因。代表性品种是较早商业化种植的携 带因渐渗片段的抗TMV烤烟品种Cokerl76和SpeightH20。由于产量较低、上部叶落 黄较慢等连锁累赘，携带因的烤烟品种不能满足生产的迫切需要。与因紧密连锁 的来源于心叶烟的染色体片段存在连锁累赘、已被育种利用的TMV抗源的遗传背景狭窄和 常规育种手段的局限性，导致抗TMV烤烟育种缺乏突破性进展。因此，在烟草种质资源库中 筛选、鉴定新的抗TMV基因具有重大意义。
[0004]另外，烟草野生种存在一种，基因，对应的无毒基因为烟草花叶病毒属病毒的外 壳蛋白基因（Coatprotein，简写为CP)，属于CC-NBS-LRR类抗病基因（Sekineetal·， 2012)。，基因抗TMV-Cg株系但不抗TMV-U1株系。
[0005] 为此，本发明希望寻找到一种能抗TMV病毒的新基因。
【发明内容】
[0006] 本发明第一目的在于提供一种抗烟草花叶病毒的，ai/基因；第二目的在于提供 一种所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的克隆方法；第三目的在于提供一种所述抗烟草花 叶病毒的，ai/基因编码的多肽；第四目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因 的瞬时表达载体；第五目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的，ay基因的瞬时表达载 体的构建方法；第六目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的应用；第七目的 在于提供一种根据所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的应用所得到的烟草品种、及其种子 和无性繁殖体；第八目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的表达盒；第九目 的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的转基因细胞系；第十目的在于提供一 种含所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的重组菌。
[0007] 本发明第一目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的碱基序列如 SEQIDNo. 1 所示。
[0008] 本发明第二目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的克隆方法包 括如下步骤： (1) 以ahia的总DNA为模板，进行PCR扩增，使用的用上下游引物分别 为： N，-H8-F:5' -ATGGAGATTGGCTTAGCAGT-3'， N，-H8-R:5' -TCACAGGCATTCACAATCGA-3' ； (2) 将得到的PCR产物进行回收和纯化； (3) 测序。
[0009] 本发明第三目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因编码的多肽的 氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0010] 本发明第四目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的瞬时表达载 体包括基因和载体pHellsgate8。
[0011] 本发明第五目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ay基因的瞬时表达载 体的构建方法为采用限制性内切酶ΧΑοΙ和酶切载体pHellsgate8,胶回收的，ay PCR扩增产物，使用一步法无缝克隆试剂盒与线性pHellsgate8载体连接。
[0012] 本发明第六目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的应用是通过 染色体片段导入、或基因导入、或基因编辑得到含，基因的烟草植株。
[0013] 本发明的第七目的是这样实现的，根据所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的应用 所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体。
[0014] 本发明的第八目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ay基因的表达盒。
[0015] 本发明的第九目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的转基因细 胞系。
[0016] 本发明的第十目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的，ai/基因的重组菌。
[0017]本发明提供的对TMV-U1和TMV-Cg株系均有抗性的，ay基因具有重要的应用价 值，通过杂交育种、转基因、基因突变等手段培育出广谱抗性的烟草品种。常规育种容易获 得携带，ai/基因且连锁累赘较小的抗TMV品种。经研究发现：基因在栽培烟草品种 如云烟87等中存在相似性较高的同源序列，携带，aw基因的渐渗片段容易与栽培品种发 生交换，容易获得携带，μ的渐渗片段较短的单株，因此，常规育种容易获得携带，ai/基 因且连锁累赘较小的抗TMV品种。与之相比，携带Λ基因的烟草野生种心叶烟的渐渗片段 较长、且与在栽培烟草品种如云烟87的核苷酸同源性较低，携带因的渐渗片段很难与 栽培品种发生交换，常规育种难以获得较短的渐渗片段单株，因此，难以获得携带因且 连锁累赘较小的抗TMV品种。
【附图说明】
[0018] 图1为4种烟草品种接种TMV-U1株系病毒； 图中：Α为Λ：ahia(ΡΙ42334)，表现枯斑；Β为Cokerl76,表现枯斑；C为Λ： (PI555569)，表现花叶、无枯斑；D为K326,表现脉明花叶、无枯斑。
[0019] 图2为使用分子标记N1/N2和E1/E2检测Λ基因； 图中：1 为Λ?ahia(PI42334); 2 为Cokerl76;3 为Λ?6T_/Kei^iri\s(PI555569); 4为K326;M为2000bp分子量标准。
[0020] 图3为4种烟草品种分别接种TMV-U1CP、TMV-CgCP和空白的瞬时表达载体农杆 菌； 图中：A为Λ?ahia(PI42334);B为Cokerl76;C为Λ?6T_/Kei^iri\s(PI555569);D为K326 ;1为接种TMV-U1CP的瞬时表达载体农杆菌；2为接种TMV-CgCP的瞬时表达载体 农杆菌；3为接种空白的瞬时表达载体农杆菌。
[0021] 图4为，ay基因PCR扩增结果； 图中：1为ddH20 (阴性对照）；2为Λ?kmirisDNA(阳性对照）；3为Λ?ahia(PI42334)DNA;5K为 5kb分子量标准。
[0022] 图5为将含，