一种谷氨酰胺转氨酶液体酶酶活稳定制剂的制备方法与流程

本发明属于酶制剂领域和食品添加剂领域，具体涉及了一种谷氨酰胺转氨酶液体酶酶活稳定制剂的制备方法。

背景技术：

谷氨酰胺转氨酶(英文简称transglutaminase,缩写名为tg)是由331个氨基酸组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质，可催化蛋白质的分子内和分子间的谷氨基酸残基与赖氨酸残基之间形成共价交联，这种交联对蛋白质的性质、凝胶能力、热稳定性和持水力等有显著影响，从而改善蛋白质的结构和功能性质，赋予食品蛋白质以特有的质构和口感。这些特性使谷氨酰胺转氨酶在肉制品、水产品、豆制品、面制品、米制品和乳制品等食品加工中得到了广泛的应用，具有很大的市场价值。

谷氨酰胺转氨酶最早由clarke等在豚鼠肝脏中首次发现，1989由ando等从茂源链轮丝菌首次分离得到，1997年由日本味之素公司率先实现规模化生产，2001年正式列为我国食品添加剂。泰兴市生物科技有限公司是国内谷氨酰胺转氨酶的主要生产企业之一，全国销量领先，积极拓展海外市场。本发明使用的酶粉也是由该企业提供。

目前谷氨酰胺转氨酶制剂主要是粉末制剂，但从生产成本、安全防护以及应用等方面存在很多问题。各企业纷纷对液体酶投入研究，为解决保存、运输及应用等方面的问题，并实现经济绿色可持续生产使用。本发明主要针对谷氨酰胺转胺酶液体制剂在37℃的长期保存性进行研究，保证谷氨酰胺转胺酶液体制剂在加工、运输、应用等方面中可能遇到的受温度影响酶活波动的稳定性，为可商业化、绿色经济提供理论参考。

技术实现要素：

本发明提供一种谷氨酰胺转氨酶液体酶酶活稳定制剂的制备方法，制备得到的谷氨酰胺转胺酶液体制剂有良好的酶活稳定性，可在37℃下恒温环境保存一月后的谷氨酰胺转胺酶酶活剩余率在85％以上。

本发明提出的制备方法，包括如下步骤：

步骤1)酶粉溶解：将谷氨酰胺转氨酶酶粉与水混合，溶解并离心，取上清液；

步骤2)除菌：采用0.22μm膜过滤除菌酶液与试剂；

步骤3)混合：定量量取或称取所述步骤2)得到的酶液、水分活度调节剂、氧化还原电位剂，混合，用ph调节剂补足100％体积，混合均匀；获得所述谷氨酰胺转氨酶液体酶的酶活稳定制剂。

其中，所述谷氨酰胺转氨酶液体酶酶活稳定制剂的组成成分及含量为：所述谷氨酰胺转氨酶含量为100-200u/ml，所述水分活度调节剂的体积分数占所述制剂的30％-60％w/v，所述氧化还原电位调节剂的质量分数占所述制剂的0.1％-1％w/v，所述ph调节剂补足100％体积。

优选地，谷氨酰胺转氨酶含量为110u/ml，水分活度调节剂体积分数占制剂的25％-54％(w/v)，氧化还原电位调节剂质量分数占制剂的0.15％(w/v)或0.2％(w/v)，ph调节剂补足100％体积。

本发明中，所含谷氨酰胺转氨酶液体酶就由酶粉溶解，经离心分离取上清液纯化得到的酶液。

本发明中，所述水分调节剂包括山梨糖醇、麦芽糖醇、丙三醇、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖、麦芽糖等中的一种或多种；优选地，为含有丙三醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖的一种或多种复配。

本发明中，所述的氧化还原电位调节剂包括l-抗坏血酸及其盐、l-半胱氨酸及其盐、还原性谷胱甘肽、茶多酚、大豆蛋白水解物、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、植酸等一种或多种；优选地，为还原型谷胱甘肽。

本发明中，所述ph调节剂为盐酸、柠檬酸、磷酸、植酸、柠檬酸三钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、蒸馏水、自来水等一种或多种调节剂组成的缓冲体系；优选地，为含磷酸、柠檬酸中的一种或其盐的缓冲液等具有较强ph缓冲能力的调节剂。

本发明中，所述方法制备得到的谷氨酰胺转氨酶液体酶酶活稳定制剂中，谷氨酰胺转氨酶液体酶的酶活在37℃保存一个月后的酶活剩余率为85％以上。

本发明进一步包括步骤：

步骤4)保存与测定：37℃恒温环境放置。在一具体实施方案中，在37℃恒温环境放置1月，测定最终酶活，谷氨酰胺转胺酶酶活剩余率在85％以上。

本发明还提出了由上述方法制备得到的谷氨酰胺转氨酶液体酶酶活稳定制剂，该制剂为能使谷氨酰胺转氨酶液体酶保持长期稳定酶活的配方，显著有效延长谷氨酰胺转氨酶液体酶稳定保存期。

本发明实现了谷氨酰胺转氨酶液体制剂在37℃放置1个月85％以上的保存率，酶活稳定，为商业上应用的稳定型谷氨酰胺转氨酶制剂提供技术方案。

本发明方法及制备得到的制剂中添加了氧化还原电位调节剂，如l-抗坏血酸及其盐、l-半胱氨酸及其盐、还原性谷胱甘肽、茶多酚、大豆蛋白水解物、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、植酸等，实验表明添加氧化还原电位剂能较大幅度提高液体酶稳定性，以还原型谷胱甘肽为例，添加比未添加在同等条件下提高酶活稳定性20％左右。氧化还原电位调节剂的添加，很大程度上实现了谷氨酰胺转胺酶液体制剂的37℃条件下的稳定性，是促进作用影响最大的配方。

本发明方法及制备得到的制剂中还采用了水分活度调节剂和ph调节剂，其中缓冲液的添加可有效缓冲在加入各类添加剂后液体酶制剂中ph，使谷氨酰胺转胺酶液体制剂保持在稳定最佳ph范围内。加入水分活度调节剂，一定程度降低了谷氨酰胺转胺酶液体制剂的水分活度，提高液体酶制剂长期保存的稳定性，同时有利于抑制微生物繁殖，如本发明使用了含有丰富羟基单元的水分活度调节剂，如：丙三醇、海藻糖、山梨糖醇等物质，可极大稳定谷氨酰胺转胺酶分子的空间结构。将水分活度调节剂、氧化还原电位剂、ph调节剂联合使用，相互协同作用，可起到维持液体酶稳定性，达到最佳的稳定效果。

本发明通过多种方法联合作用的方法提高液体酶稳定性、达到协调增强酶稳定性，成功解决了谷氨酰胺转胺酶液体制剂在37℃下稳定性差的问题，并研究出一种在37℃下稳定性良好，可长期保存氨酰胺转胺酶液体制剂，对谷氨酰胺转胺酶液体制剂的生产成本降低、节能环保、健康使用、市场推广具有重要意义。

本发明方法及制备得到的液体谷氨酰胺转胺酶的酶活稳定制剂配方中所涉及到各种成分成本低廉易得，具有食品级来源，各成分比例也符合食品安全和食品添加剂等相关国家标准要求。本发明为液体谷氨酰胺转胺酶液体制剂37℃可长期保存性提供新的技术构思和技术方案。

附图说明

图1为本发明谷氨酰胺转氨酶液体酶的酶活稳定制剂的制备流程示意图。

具体实施方式

以下实施实例是为了更好地理解本发明，本发明的权利包括但不限于以下实施实例所叙述的内容，任何根据本行业的常规知识所做的修订和改进均不影响本发明的权利。

本发明提出的谷氨酰胺转氨酶液体酶酶活稳定制剂的制备方法，包括步骤：

1)酶粉溶解：将谷氨酰胺转氨酶酶粉与水混合，溶解并离心，取上清液；

2)除菌：采用0.22μm膜过滤除菌酶液与试剂；

3)混合：定量量取或称取所述步骤2)得到的酶液、水分活度调节剂、氧化还原电位剂，混合，用ph调节剂补足100％体积，混合均匀；获得所述谷氨酰胺转氨酶液体酶的酶活稳定制剂。

进一步包括步骤4)37℃恒温环境放置。如，在37℃恒温环境放置1月，测定最终酶活。如图1所示。

为了实现上述目的，本发明先用实验和理论阐明发明技术方案，随后总结出并给出本发明的技术方案，具体如下：

实验设计方案大致为：选定最佳影响液体酶热稳定性的温度与时间、测定单一物料对液体酶热稳定性的影响、优选物料进行96孔板45℃放置一周筛选及小样37℃放置1月验证。

首先，考察纯酶液下不同温度下的失活情况，确定最佳处理温度与时间，进一步考察单一物料与纯酶液复配该温度下处理后酶液失活情况，确定可延长液体酶长期保存稳定性的物料。

实施例1纯酶液下不同温度下的失活情况

浓度为100u/ml的纯酶液在不同温度下水浴处理不同时间，测定酶活，具体结果如表1，

表1.不同温度下处理不同时间下的酶活变化

由表1数据表明，谷氨酰胺转氨酶在相同处理时间下，45℃酶活损失较少，60℃处理30min后几乎无酶活，而55℃，30min酶活失活速率最快。因此，综合考虑选定55℃,30min作为热处理实验的温度与时间。

实施例2不同水分活度调节剂下的对液体酶热稳定性的影响

不同单一水分活度调节剂与浓度为100u/ml的纯酶液1:1混合，与55℃水浴处理30min，处理完毕后，迅速冰水浴，测定酶活。

表2.例举不同糖类处理下的酶活稳定性

由表2数据说明，添加水分活度剂中的糖类，能够延长谷氨酰胺转氨酶在高温下的稳定性，其中葡萄糖、海藻糖、蔗糖对酶活保存率的提供影响较大，以浓度25％为例，55℃30min处理下的酶活保存率在74％以上。因此，优先选择葡萄糖、海藻糖、蔗糖作为延长酶液长期保存的水分活度调节剂。

表3.例举不同醇类处理下的酶活稳定性

由表3数据说明，添加水分活度剂中的醇类，除1,3-丙二醇外均能够延长谷氨酰胺转氨酶在高温下的稳定性，其中山梨糖醇、甘油、麦芽糖醇对酶活保存率的提供影响较大，以浓度30％为例，55℃30min处理下的酶活保存率在80％％以上。因此，优先选择山梨糖醇、甘油、麦芽糖醇作为延长酶液长期保存的水分活度调节剂。

实施例3不同金属盐离子下的对液体酶热稳定性的影响

不同单一氯化金属盐离子与浓度为100u/ml的纯酶液1:1混合，与55℃水浴处理30min，处理完毕后，迅速冰水浴，测定酶活。

表4.例举不同金属盐离子处理下的酶活稳定性

由表4数据说明，单独添加金属盐离子，对延长谷氨酰胺转氨酶在高温下的稳定性无明显促进作用，但可看出浓度为20mm的mgcl2和cacl2提高了液体酶的稳定性，但随着浓度增加，稳定性迅速下降，而kcl和nacl虽然随浓度增加稳定性减少，但减少幅度远低于另外2种金属盐离子。

实施例4不同氨基酸下的对液体酶热稳定性的影响

不同单一氨基酸与浓度为100u/ml的纯酶液1:1混合，与55℃水浴处理30min，处理完毕后，迅速冰水浴，测定酶活。

表5.例举不同氨基酸处理下的酶活稳定性

由表5数据说明，单独添加氨基酸，对延长谷氨酰胺转氨酶在高温下的稳定性无明显影响，与对照相比，酶活保存率波动幅度不大。

实施例596孔板筛选不同水分活度调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶长期保存的影响

无菌过滤后的不同糖醇与150u/ml按照一定比例混合，于45℃恒温条件下放置1周测定剩余酶活，进行96孔板筛选。确定延长液体谷氨酰胺转氨酶长期保存的水分活度调节剂的种类与最优配比。

表6.例举不同水分活度调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶45℃放置1周下的影响

由表6数据说明，单一水分活度调节剂随着浓度增加均能在一定程度下延长谷氨酰胺转氨酶在高温下的稳定性。其中，一定浓度的甘油、山梨醇、葡萄糖、蔗糖对液体酶液酶活稳定性具有促进作用。

表7.例举不同水分活度调节剂复配对液体谷氨酰胺转氨酶的影响

由表7数据结合表6数据表明，不同水分活度调节剂复配与单一水分活度调节剂相比能在一定程度下提高谷氨酰胺转氨酶在高温下的稳定性。其中，山梨糖醇与蔗糖、葡萄糖复配时效果高于其他2种水分活度调节剂。因此，优先选择山梨糖醇与蔗糖、葡萄糖复配。

实施例696孔板筛选不同ph调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶长期保存的影响

无菌过滤后的浓度为0.02m不同ph调节剂稀释纯酶液至150u/ml，于45℃恒温条件下放置1周测定剩余酶活，进行96孔板筛选。优选利于谷氨酰胺转胺酶液体制剂长期保存的最佳的ph调节剂。

表8.例举不同ph调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶45℃放置1周下的影响

由表8数据表明，不同ph调节剂能在一定程度上对提高液体谷氨酰胺转氨酶高温下的稳定性。其中，缓冲液柠檬酸缓冲液(柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液)和磷酸钠缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)酶活与对照相比剩余率较高。因此，优先选择柠檬酸缓冲液和磷酸钠缓冲液作为延长谷氨酰胺转胺酶长期保存稳定性的ph调节剂。

实施例796孔板筛选不同氧化还原电位剂对液体谷氨酰胺转氨酶长期保存的影响

无菌过滤后的不同氧化还原电位剂与浓度为150u/ml谷氨酰胺转胺酶纯酶液按照一定比例混合，于45℃恒温条件下放置1周测定剩余酶活，进行96孔板筛选。确定延长液体谷氨酰胺转氨酶长期保存的氧化还原电位剂的种类与最优配比。

表9.例举不同氧化还原电位剂对液体谷氨酰胺转氨酶的影响

由表9数据表明，添加氧化还原电位可以延长谷氨酰胺转胺酶液体制剂的长期保存性，其中，l-半胱氨酸钠的对谷氨酰胺转胺酶液体制剂的影响优于半胱氨酸。

表10.例举不同氧化还原电位剂复配对液体谷氨酰胺转氨酶的影响

结合表9和表10数据表明，不同氧化还原电位剂复配与单一氧化还原电位剂相比能在一定程度下提高谷氨酰胺转氨酶在高温下的稳定性。其中，l-半胱氨酸钠与谷胱甘肽1:1复配时酶活剩余率较高。因此，优先选择l-半胱氨酸钠与谷胱甘肽作为延长谷氨酰胺转胺酶长期保存稳定性的氧化还原电位剂。

实施例8小样验证不同物料不同配比

将96孔板筛选的不同ph调节剂，水分活度调节剂，以及氧化还原电位调节剂进行无菌过滤，与纯酶液按照一定比例混合均匀，放置于37℃恒温环境下一个月，测定酶活，验证及确定能够延长谷氨酰胺转氨酶液体酶长期保存的最优试剂配比。并测定该配比下的理化参数。

表11.例举不同氧化还原电位剂复配在37℃放置1个月下的影响

通过添加ph调节剂，水分活度调节剂，以及氧化还原电位调节剂，我们将谷氨酰胺转氨酶液体酶制剂在无菌条件下实验了37℃放置1个月86％以上的保存率，为商业上应用的稳定型谷氨酰胺转氨酶制剂提供理论参考。

通过对上述各种理化因素对谷氨酰胺转胺酶液体制剂的热稳定的影响，并选定最优配方观察其在37℃放置1个月的条件下酶活保存率(稳定性)，我们确定谷氨酰胺转胺酶液体制剂在37℃放置1个月的条件下能够稳定保持的最佳水分活度调节剂、氧化还原电位剂、ph调节剂的种类与配比。

实施例9

谷氨酰胺转胺酶粉末由泰兴市东圣生物科技有限公司提供，酶活单位为10000-15000u/g。称取一定量的纯水，混合均匀，离心取上清液，进行微滤除菌(孔径0.22μm)获得酶活为1000-1500u/ml的澄清谷氨酰胺转胺酶纯化浓缩液。

检测酶活采用氧肟酸法(彭灿.微生物谷氨酰胺转胺酶稳定性的研究[d].华东师范大学，2007)

实施例10

一种液体谷氨酰胺转胺酶的制备方法，该液体酶制剂总体系为15ml，制备方式如下，根据配料表12称取。

表12.一种液体谷氨酰胺转胺酶的制备

将配方中的物料，混合均匀，通过无菌过滤得外观为浅黄色溶液，测定初始酶活为145.3u/ml,置于15ml已灭菌的离心管中，最终制得液体型谷氨酰胺转胺酶制剂，测定初始酶活，置于37℃下保存1个月，测定剩余酶活，计算酶活保存率。结果发现，液体酶制剂气味等未发生明显变化，酶活保存率85.41％。

实施例11

取实施例1中谷氨酰胺转胺酶纯化浓缩液，按表13配方配置液体谷氨酰胺转氨酶制剂，混合均匀后，按照实施例2中的有关方法测定ph、水分活度、氧化还原电位，起始酶活，然后采用0.22μm滤膜无菌过滤，置于15ml已灭菌的离心管中，于37℃下保存1个月测定剩余酶活，计算酶活保存率。

表13.一种液体谷氨酰胺转胺酶的制备

结果发现，本方法制得的谷氨酰胺转胺酶制剂具有良好的稳定性，液体酶制剂外观与气味等未发生明显变化，酶活保存率86.20％。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。