本发明属于分子诊断生物学技术领域，涉及一步法核酸提取及荧光定量pcr检测试剂盒，具体涉及含2个探针的实时荧光定量pcr试剂，检测患者血液、尿液、脑脊液或者拭子中的等样本中甲、乙型流感病毒的新型试剂盒。
背景技术：
流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。该病是由流感病毒引起；流感病毒为属正粘液病毒科，可分为甲型流感病毒(influenzaavirus)，乙型流感病毒(influenzabvirus)和丙型流感病毒(influenzacvirus)三型，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。乙型流感通常是引起流感的局部爆发，抗原变异小，有时候也可以成为强势毒株。丙型流感病毒的抗原稳定，主要感染侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，但仍可严重发病并引起地方性大爆发。流感病毒主要依靠实验室进行确切诊断，常规的诊断方法主要包括血清学检测和病原分离和鉴定这两个方面。
近年来，分子生物学方法不断的被应用到病毒的快速检测中，其中流感病毒的核酸检测尤其是基于taqman技术的荧光定量pcr分子检测成为流感病毒检测诊断的主要发展方向。taqman探针检测为包括5‘端报告基因即荧光基团和3’端的淬灭基团。当探针完整时，淬灭基因与报告基因接近而被淬灭，导致无荧光产生，在pcr反应延伸过程中，taq酶的5‘-3’外切核酸酶活性将与模板结合的探针切断，导致报告基因与淬灭基团分离，产生荧光信号；每一轮pcr循环中，都有新的报告基因被剪切，而且荧光信号强度与扩增产物成正比。
运用pcr技术检测病毒rna主要包括病毒核酸的提取和核酸的pcr扩增，但是传统技术对于rna提取过程过于复杂，而且涉及的步骤繁琐，耗材花费大，而是特备耗时。
技术实现要素：
针对上述问题，所以我们提供了一种磁珠法对样本中的进行快速核酸裂解吸附的一步法试剂盒并保持较好的检测灵敏度。利用磁珠直接对样本进行提取，而不需要样本的纯化和洗涤，直接用磁珠和扩增的试剂接触进行核酸的扩增，减少了操作步骤，同时，避免了杂质对检测的干扰。
本发明一方面提供一种检测样本中甲、乙型流感病毒的核酸检测试剂盒，该试剂盒包括裂解液和磁珠悬浮液，其中，裂解液的成分包括1mnacl、0.01％triton-x和0.001mkcl，磁珠悬浮液包括羟基修饰的磁珠，多分散系数＜0.2；磁珠为直径小于或等于500nm，其中，磁珠的含量为10mg/ml。
在一些优选的方式中，当裂解液和磁珠溶液混合的时候，两者的体积比为200:1。
或者，提供一种混合物，该混合物为溶液混合物，该混合物中包括1mnacl、0.01％triton-x和0.001mkcl和0.005微升的10mg/ml的羟基磁珠；再或者，溶液中含有0.005毫克的羟基磁珠。或者，按照表1的方式提供磁珠裂解液，该磁珠裂解液由裂解液和磁珠液按照体积200：1的方式混合而成。
在一些优选的方式中，该试剂盒还包括pcr反应扩增的所必须的成分，所述的扩增试剂包括1～10mmol/l的mg2+，10～50mmol/l的tris–hcl缓冲液；50-1000umol/l的dntp浓度；25mmol/l的k离子，100μg/ml的酶稳定性试剂，例如bsa等。优选的为，扩增试剂中还包括甘油。在一些优选的方式中，还包括特异的探针序列，所述的序列为seq.1.1-1.3；seq.2.1-2.3。
另一方面，本发明的目的是提供一种一步法检测样本中甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，其中给试剂盒包括磁珠裂解液、定量pcr检测液。优选的，该试剂盒还包括：taq酶，rna反转酶，阴性对照、阳性对照和内控ic(一般是灭活的噬菌体)，说明书和盒体组成。具体组成见下表。
表1：磁珠裂解液的组分和体积比例。
表2:扩增试剂的组成和具体成分
优选的，定量pcr检测液含有pcr缓冲液、耐热dna聚合酶、三种引物和探针。所述的引物为具体为，为表3.
表3：荧光定量pcr扩增引物探针和内标序列
在一些方式中，还包括阴性对照为tebuffer；阳性对照为甲乙型流感病毒特定序列制备的假病毒；内控ic为灭活的噬菌体。本发明试剂盒应保存于-20℃，其中磁珠裂解液保存在4℃中)，反复冻融8次以内。
在一方面，本发明提供一种检测样本中甲、乙型流感病毒核酸的方法，该方法包括提供表1-3的试剂，该方法包括核酸的提取步骤和核酸的扩增步骤，其中，核酸的提取包括：
一、核酸提取：
1.将磁珠裂解液取出，振荡摇匀后短暂离心；
2.取合适离心管或者pcr管中加入n×80μl的磁珠裂解液和1μl的内控(ic)样本，混匀；
3.在步骤2的离心管或pcr管中，每管加入20μl溶解于生理盐水或病毒运输液中的咽拭子样本；
4.每次测试应至少设置一孔阴性对照(tebuffer)和一孔阳性对照，加样方法同样本，阴性和阳性的核酸提取方法和检测样本的方法保持一致，同时阴性和阳性中都同时加入内控样品1μl；
5.盖好管盖，短暂离心，将离心管或pcr管放在80℃恒温中孵育5min，然后室温放置5min。如果是，八联管可放入pcr仪中，设定80℃×5min，20℃×5min。
6.将步骤5离心管或八联管放在磁力架上静置1-2min；去除液体，保留磁珠，同时不对磁珠做任何进一步的洗过、洗涤或者处理。如不小心吸到磁珠，则将液体打回管内，重新静置1min后再吸。吸弃液体要完全，或者采用自动方法取出掉液体，仅仅保留磁珠在pcr管中。
二：荧光定量pcr扩增：
7.配置n份pcr检测液:n×49.2ulpcr扩增液+n×0.3ultaq酶+0.5ul反转录酶(试剂见表2和3)
8.用移液枪吸取50μl表2中的pcr检测液，分别加入到步骤6的离心管或八联管中。
9.用移液枪反复吸打至磁珠完全分散(请注意部分枪头可能吸附磁珠，将会影响检测结果，这里的混合也可以不采用移液枪，而是采用震动的方法自动混合)。如为1.5ml离心管，须转移至pcr管或pcr盘中。盖上盖子或封上胶膜。
10.立即放入pcr仪进行扩增检测。如暂时不检测，须将pcr管或pcr盘避光保存在2-8℃冰箱里不超过2小时。
11.在pcr仪里设置以下的循环参数：
45℃×10min；95℃×10min；再按95℃×15s60℃×45s循环40次；
荧光检测在60℃；反应体系为50μl
12.荧光通道检测选用(flua收集荧光-fam，flub收集荧光-ned，内控收集荧光-cy5)；如果用abi系列的pcr仪器，quencherdye选择none。11.保存文件，运行程序。
13.实验结束，设置合适的阈值线，获得ct值，判断样本阴性阳性结果。
在一些优选的方式中，所有方式中的样本可以是液体类样本拭子样本，例如鼻咽拭子、痰液类样本，拭子或者痰液样本溶于1-5ml生理盐水中。
有益效果：
1.对核酸进行简便快速提取：用磁珠吸附dna核酸不经过洗涤洗脱直接用于pcr反应；2.要求的样本量少：一般现有传统技术中的核酸提取样本是1ml，而本发明中对样本的要求是20ul或者更少就可以实现；3.通过荧光定量pcr对甲型和乙流病毒进行快速检测，有很好的特异性、灵敏度及病毒鉴定。
附图说明
图1为实施例子1中的国家标准品的检测结果。
图2为实施例子1中的国家标准品的检测结果。
图3是实施例子2中的临床样本的检测结果。
图4是本发明特异性的检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，实施例提供的方案为优选方案，是作为本领域的一般技术人员按照本发明的精髓来裂解如何实践，但不作为对本申请的限定，本申请的范围体现在权利要求中。
说明：在以下实施例子中所用的pcr扩增仪器为bio-radcfx96和abi7500。
实施例1：磁珠一步法检测经过确认阳性国家参考品乙型流感病毒
提供的试剂如下表：
表4：磁珠裂解液的组分和体积比例。
表5:扩增试剂的组成和具体成分
表6：荧光定量pcr扩增引物探针
具体方法如下：
一、核酸提取：
1.将如表4中的磁珠裂解液取出，振荡摇匀后短暂离心。
2.取合适离心管加入6×80μl的磁珠裂解液和6×1μl的内控(合计81μl)，混匀。然后用移液枪按照81μl/管，加入到1.5ml离心管或者pcr八联管中，4检测样本的数量，其中2为包括阴性和阳性对照，以及检测样本的合计数量到上述配好的裂解液中混匀，取6个相同的专用pcr管，每管分装80ul配置好的混有磁珠的裂解液。
3.在步骤2的离心管或pcr管中，4个样本检测管分别加入20μl样本(国家参考品乙型流感病毒：浓度为2.1×106tcid50/l、2.1×105tcid50/l、2.1×104tcid50/l、2.1×103tcid50/l)。
4.每次测试应至少设置一孔阴性对照(tebuffer)和一孔阳性对照，加样方法同样本，阴性和阳性的核酸提取方法和检测样本的方法保持一致。
5.盖好管盖，短暂离心，将离心管或八联管放在80℃恒温中孵育5min，然后室温放置5min。如果是，八联管可放入pcr仪中，设定80℃×5min，20℃×5min。
6.将步骤5离心管或八联管放在磁力架上静置1-2min。用移液器小心地吸去液体。如不小心吸到磁珠，则将液体打回管内，重新静置1min后再吸。吸弃液体要完全，或者采用自动方法取出掉液体，保留磁珠在pcr管中。
7.然后向pcr管中加入核酸扩增的试剂成分和反转录酶。
50ul反应体系如下：
pcr温控：45℃10min；
95℃10min；
95℃15s，60℃45s；40个cycles；
荧光选择通道fam，hex和cy5。
结果如图1所示，1号曲线，2号曲线，3号曲线和4号曲线分别为浓度为2.1×106tcid50/l、2.1×105tcid50/l、2.1×104tcid50/l、2.1×103tcid50/l的乙型流感病毒样本，而阴性样本没有信号的出现。
同样，对国家标准品h1n1(2009)浓度为9.8×104tcid50/l、9.8×103tcid50/l、9.8×102tcid50/l和9.8×101tcid50/l同时进行了测试，测试的结果见图2图2中1号曲线，2号曲线，3号曲线和4号曲线分别为浓度为29.8×104tcid50/l、9.8×103tcid50/l、9.8×102tcid50/l和9.8×101tcid50/l的甲型流感病毒h1n1(2009)样本。
实施例子2对临床的阳性样本或者阴性样本的检测(咽拭子)
分别对绍兴疾控中心给及的4个样本，分别为1号样本甲型流感阳性，2号乙型流感并阳性和3,4号样本甲乙型流感病毒阴性样本进行测试如下：
提供的试剂：
表7：试剂盒的组成和成分配比
其中，所涉及的引物参考表3的引物。
本试剂盒可匹配自动化样本前处理仪使用：
1.取出试剂盒1中磁珠裂解液，短暂离心，打开管盖，每管分别加入1ul内控。
2.将试剂盒2放置在冰上或4度冰箱里30－60分钟化冻。
3.将样本逐个加入到核酸转移液中，每孔20μl，这里的样本是咽拭子样本经过生理盐水或者缓冲溶液洗脱过的拭子溶液。
4.每次测试应至少设置一孔阴性对照和一孔阳性对照，加样方法同样本。
5.将加好样本和阴阳性对照的管条加载到仪器对应位置。
6.取出试剂盒2中rt-pcr反应液分别加入1ul酶混合液，短暂离心，打开管盖。
7.将甲乙流感病毒检测液加载到仪器对应位置。
8.关上仪器门，按开始键。
本试剂盒也可手工进行前处理操作：
1.将试剂盒1中的核酸转移液取出，振荡摇匀后短暂离心，取1.5ml离心管加入n×80ul的磁珠裂解液和n×1ul的内控，然后用移液枪按照81μl/管，加入到1.5ml离心管或者pcr八联管中(n＝样本的数量)。
2.将试剂盒2放置在冰上或4度冰箱里30－60分钟化冻。
3.在步骤1的离心管或pcr管中，每管加入20μl样本。
4.每次测试应至少设置一孔阴性对照和一孔阳性对照，加样方法同样本。这里的样本是咽拭子样本经过生理盐水或者缓冲溶液洗脱过的拭子溶液
5.盖好管盖，短暂离心，将离心管或八联管放在80℃恒温中孵育5min，然后室温放置5min。八联管可放入pcr仪中，设定80℃×5min，20℃×5min。
6.将步骤5离心管或八联管放在磁力架上静置1-2min。用移液器小心地吸去液体。如不小心吸到磁珠，则将液体打回管内，重新静置1min后再吸。吸弃液体要完全。
7.用移液枪吸取50μl试剂盒2中的rt-pcr反应液分别加入n×1ul酶混合液，分别加入
到步骤6的离心管或八联管中。
8.用移液枪反复吸打至磁珠完全分散。如为1.5ml离心管，
须转移至pcr管或pcr盘中。盖上盖子或封上胶膜。
9.立即放入pcr仪进行扩增检测。如暂时不检测，须将pcr
管或pcr盘避光保存在4度冰箱里不超过2小时。
二、pcr扩增：
1.在pcr仪里设置以下的循环参数：
45℃10min；95℃×10min；再按95℃×15s→60℃×45s循环40次；荧光检测在60℃；反应体系为50μl。
2.荧光通道检测选用fam，hex或ned和cy5；如果用abi系列的pcr仪器，quencherdye选择tamra。
3.保存文件，运行程序。
结果如图3，绍兴疾控中心给予的甲流阳性检测为甲流阳性，乙流阴性，给予的乙流阳性样本检测结果乙流阳性，甲流阴性，给予的阴性样本均检测为阴性；检测结果与绍兴疾控中心测试结果一致。3-6号曲线为1-4号样本的内控曲线，1号曲线为1号样本检测的甲流结果，2号曲线为2号样本检测的乙流结果，5-12曲线为1号样本的阴性检测结果。
实施例3：本发明方法检测甲、乙流与上海之江核酸提取试剂盒以甲、乙型流感病毒联合测定试剂盒中检测乙流比较
取绍兴疾控中心给予的确认过的2例阳性的甲、乙流咽拭子样本分别作为1号样本和2号样本，利用与实施例1或者2相同的方法进行核酸的提取。采用同样的样本，利用上海之江生物科技有限公司的核酸提取试剂进行提取(对比实验)。
一，对同样的样本，采用上海之江生物科技有限公司的核酸提取试剂进行提取，方法如下：
1.配置结合液：6ul的rna助沉剂、20ul的磁珠加入至500ul结合缓冲液，混匀。
2.加入140ul样本至526ul结合液
a.取526ul结合液至1.5m离心管中。
b.在上述离心管中加入140ul样本，将吸头轻轻地浸入结合液中，以防止液体溅出导致的交叉污染。
c.涡旋振荡10s或反复颠倒5-10s(使磁珠均匀分散至缓冲液，完全裂解病毒，并使rna和磁珠相结合)，静置3min以上。
3.吸取上述混匀静止体系666ul与亲和柱中，16000g(13000rpm)离心60s；弃去收集管废液。
4.亲和柱中加入500ul洗涤液a，16000g(13000rpm)离心40s；弃去收集管废液；重复一次
5.亲和柱中加入500ul洗涤液w，16000g(13000rpm)离心15s；弃去收集管废液；重复一次
6.亲和柱放入离心机中16000g(13000rpm)离心2min。
7.50ul洗脱液洗脱rna
a.亲和柱放入1.5ml无rnanase的离心管中，加入50ul65℃预热洗脱液，室温放置2min。
b.16000g(13000rpm)离心2min，rna被洗脱于无rnanase的离心管中备用或将其保存于-20℃或-80℃。
三、两次提取的样本做如下的扩增：(1)提取的样本都用上海之江生物科技有限公司的甲、乙型流感病毒联合测定试剂盒的试剂进行扩增(货号z-me-0010/z-me-0025)。(2)核酸扩增用本发明的扩增体系对两次提取的样本进行扩增。
三：采用上海之江生物科技有限公司的提供的甲、乙型流感病毒联合测定试剂盒(包括扩增所用的反转录酶以及扩增试剂以及引物、聚合酶等)进行检测以及扩增条件一致，获得的结果如下。
结果如下表：
结果表明，本方法检测的结果与上海之江试剂盒检测的结果无显著差异。但是，rna的提取过程，本发明试剂，而且花费的时间短，耗材少，简单快速。同样，利用本发明的扩增体系对两次提取的样本进行扩增，也获得同样的实验结果。这更进一步表明，本发明的核酸提取过程简单，可以实现全自动化的操作。
另外，对于以上核酸提取的过程中，在进行磁珠吸附核酸rna后，不经过任何后续处理好，例如洗涤、清洗等额外的步骤，而直接让磁珠限于rna逆转录酶接触反应，然后去掉逆转录酶，仅仅保留磁珠，然后再让磁珠和核酸扩增试剂接触，获得了更好的扩增效果，有信号峰的出现时间早于让磁珠同时接触聚合酶和逆转录酶。这样可以节约时间，但是操作上不有两步分开。(具体实验数据略)
实施例子4：特异性分析
按照实施例子1的磁珠核酸提取方法对以下样本进行核酸的提取，pcr扩增体系及扩增条件与实施例子1相同，取5份特异性参考品分别为rsv病毒,eb病毒、鼻病毒、腺病毒和副流感病毒阳性样本，进行荧光pcr试剂盒的特异性试验，结果如下图4。图4中，1号和2号曲线为甲型和乙流流感样本对照，3-8号曲线分别为rsv病毒,eb病毒、鼻病毒、腺病毒和副流感病毒样本及阴性对照曲线(甲乙流曲线，内控都正常未列出)。
检测结果显示甲、乙型流感病毒的核酸检测试剂盒与rsv病毒,eb病毒、鼻病毒、腺病毒和副流感病毒无交叉干扰。同时，利用现有商业购买的产品如近岸蛋白质科技有限公司的
实施例子5：灵敏度性分析
对国家的阳性标本进行梯度稀释，2.1×106tcid50/l，稀释后的浓度为：2.1×105tcid50/l；2.1×104tcid50/l；2.1×103tcid50/l，2.1×102tcid50/l，2.1×101tcid50/l后，采用实施例子1的核酸提取方法和扩增方法进行扩增，同时采用上海之江生物科技有限公司的试剂盒中的方法进行rna的提取，并用本发明的试剂进行扩增，发现，本发明的方法可以检测出2.1×101tcid50/l的浓度，而对比的提取方法只能检测出2.1×103tcid50/l的浓度，这说明本发明的提取方法可以获得有效的rna，同时灵敏度更高，可以检测药物治疗的效果，而对比传统的提取方法可能损耗了rna而不能检测出。