本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种引物对及包含其的试剂盒、用途和检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法。
背景技术：
蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)作为豆科模式植物，具有耐干旱、耐冷热、高产和优质的特点，同时又能改良土壤，还具有生长周期短、基因组小、遗传转化率高和自花授粉的优点。蒺藜苜蓿，包括紫花苜蓿(m.sativa)在内的大部分豆科植物，在遗传上具有相似性。可以将从蒺藜苜蓿中获取的信息借鉴到其它豆科植物。因此，在植物分子生物学和基因组学研究中蒺藜苜蓿备受关注。
随着畜牧业的发展，牧草的需求量越来越大，安全要求也越来越高。分子生物学手段，在牧草上的作用越来越显著，而豆科牧草作为牧草中最重要的两个科之一，为家畜提供了大量的蛋白质资源，因而对豆科牧草的基因改良是牧草领域的重要课题。
对于豆科植物分子生物学领域，蒺藜苜蓿作为豆科牧草的模式植物，是研究其他优良的基因是否在豆科植物中表达提供了优异的实验材料。准确而高质量的蒺藜苜蓿种子是对实验安全进行的保障，因而准确迅速鉴定出蒺藜苜蓿不同生态型，对于提高我国豆科饲草的分子生物学研究具有十分重要的意义。
蒺藜苜蓿不同生态型a17和r108在实验室里十分常见，但是这两种蒺藜苜蓿生态型在实验室的用途并不相同。a17蒺藜苜蓿基因组序列是由单种子后代测序所得，常用于t-dna插入分析；蒺藜苜蓿r108生态型因为具有基因组小、种子产量大和种子成熟时间短等特点，所以常被用于研究相关的分子遗传过程。
而这两种生态型的种子在外观形态上极其相似，分辨十分困难，一旦混杂，将对蒺藜苜蓿基因功能研究造成不可挽回的损失，而现在国内外还没有一个统一的、行之有效的鉴别方法。只能依靠肉眼观察，所以结果并不准确。
因此目前十分需要一种快速而准确的方法检测和鉴别蒺藜苜蓿生态型a17和r108。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的引物对，缓解了现有技术中检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108技术不足的技术问题，该引物对可以扩增出生态型a17和生态型r108的dna片段，且扩增产物的片段长度不同，因此可以同时检测出待测样品中是否含有蒺藜苜蓿生态型a17和r108。
本发明的第二目的在于提供一种包含上述引物对的试剂盒，该试剂盒配合其他分子生物学实验中常用试剂具有广泛的用途。
本发明的第三目的在于提供一种上述引物对或上述试剂盒在检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108中的用途，该用途十分广泛，例如可以应用于检测待测样品中是否含有蒺藜苜蓿生态型a17和/或r108的成分，例如还可以应用于鉴别蒺藜苜蓿生态型a17和r108；并且具有检测或者鉴别准确，快速，高通量的优点，并且上述引物对或试剂盒还适用于检测或鉴别蒺藜苜蓿生态型a17和r108的突变株，因此用途十分广泛。
本发明的第四目的在于提供一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法，缓解了现有技术中存在的缺乏一种快速而准确的方法检测和鉴别蒺藜苜蓿生态型a17和r108的问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的引物对，所述引物对包含引物nst480-f和引物nst480-r；
其中，所述引物nst480-f具有如seqidno.1所示序列，所述引物nst480-r具有如seqidno.2所示序列。
进一步的，引物nst480-f和引物nst480-r经过修饰；
进一步的，所述修饰包括在引物的5’端和3’添加标记物；
进一步的，所述标记物包括荧光标记、生物素标记或地高辛标记。
本发明还提供了一种包含上述引物对的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒还包括mg2+、dntp，dna聚合酶和pcrbuffer。
本发明还提供了一种上述引物对或上述试剂盒在检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108中的用途。
本发明还提供了一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法，该方法包括如下步骤：对待测样品的dna进行pcr扩增，通过检测扩增产物中是否包含蒺藜苜蓿生态型a17和/或r108的dna片段，判断待测样品中是否包含蒺藜苜蓿生态型a17和/或r108的成分；其中，所述pcr扩增时使用的引物包含上述引物对。
进一步的，所述待测样品为种子。
进一步的，先将种子萌发后再提取种子的基因组dna。
进一步的，在22-27℃条件下，在滤纸上将种子萌发60-84h后再提取种子基因组dna。
进一步的，所述pcr扩增的条件为a)94℃预变性4分钟；b)94℃变性30秒；c)50-56℃退火30秒；d)72℃延伸30秒；步骤b)-d)循环25-40次；e)72℃延伸7分钟；
其中，步骤b)-d)优选循环30-38次；更优选循环32-36次；
退火温度优选为51-55℃；更优选为51-53℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的引物对，可以同时扩增出蒺藜苜蓿生态型a17和r108的dna片段，并且其扩增蒺藜苜蓿两种生态型的扩增产物长度不相同，因此一次扩增待测样品即可分辨出待测样品是否包含生态型a17和r108，避免了分开扩增时由于扩增效率的差异或者人员操作的误差导致的假阳性或假阴性，并且上述引物对还可以扩增蒺藜苜蓿生态型a17和r108的突变株。
本发明提供的包含上述引物对的试剂盒，该试剂盒配合其他分子生物学实验中常用试剂可以具有广泛的用途。
本发明提供的上述引物对或上述试剂盒在检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108中的用途，上述引物对不仅能够从待测样品中检测出其中是否含有蒺藜苜蓿生态型a17和/或蒺藜苜蓿生态型r108的成分，更重要的是上述引物对可以鉴别蒺藜苜蓿生态型a17和蒺藜苜蓿生态型r108的种子，上述两种生态型的蒺藜苜蓿的种子在外观形态上极其相似，分辨十分困难。但是上述两种生态型的蒺藜苜蓿在分子生物学研究领域中具有不同的作用，生态型a17常用于t-dna插入分析；生态型r108因为具有基因组小、种子产量大和种子成熟时间短等特点，常被用于研究相关的分子遗传过程。因此如果混淆了生态型a17和生态型r108的种子将给蒺藜苜蓿基因功能研究造成不可挽回的损失。因此鉴别上述两种生态型的种子十分有应用价值和意义。
本发明提供的检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法，省时省力，操作简便，在实验室条件下较短时间内能够很好的完成，具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点。将该方法应用于鉴别蒺藜苜蓿生态型a17和r108的种子，有助于种子检验人员对a17和r108种子的区分，使蒺藜苜蓿更好的为豆科植物分子研究服务，此方法具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点，能够进行大批量蒺藜苜蓿种子真伪的检测，为保障蒺藜苜蓿种子纯度检测提供可行依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4中pcr产物凝胶电泳图；
图2为本发明实施例4中pcr产物凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的引物对，所述引物对包含引物nst480-f和引物nst480-r；其中，所述引物nst480-f具有如seqidno.1所示序列，所述引物nst480-r具有如seqidno.2所示序列。
可以理解的是，当待测样品中只含有生态型a17，使用上述引物对可以扩增出生态型a17的dna片段；当待测样品中只含有生态型r108时，使用上述引物对可以扩增出生态型r108的dna片段；当待测样品中同时含有生态型a17和生态型r108时，上述引物对可以同时扩增出生态型a17和生态型r108的dna片段，并且生态型a17和生态型r108的扩增产物的片段不同，扩增后可以分辨出上述引物对扩增出的两种产物，因此可以从上述引物对的扩增产物中知晓待测样品中同时包含生态型a17和生态型r108两种成分。
引物nst480-f和引物nst480-r可以同时扩增出蒺藜苜蓿生态型a17和r108的dna片段，并且其扩增蒺藜苜蓿两种生态型的扩增产物长度不相同，因此一次扩增待测样品即可分辨出待测样品中是否包含生态型a17和/或r108，避免了分开扩增时由于扩增效率的差异或者人员操作的误差导致的假阳性或假阴性，并且上述引物对还可以扩增蒺藜苜蓿生态型a17和r108的突变株。
在本发明的引物对的一种扩增产物中，引物nst480-f和引物nst480-r扩增出蒺藜苜蓿生态型a17的dna片段具有如seqidno.3所示序列，该序列片段长度为176bp，其互补序列如seqidno.4所示；引物nst480-f和引物nst480-r扩增出蒺藜苜蓿生态型r108的dna片段具有如seqidno.5所示序列，该序列片段长度为167bp，其互补序列如seqidno.6所示。
在一些可选的实施方式中，引物nst480-f和引物nst480-r经过修饰；所述修饰例如可以为但不限于为磷酸化、生物素标记、地高辛标记、荧光基团标记、硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰或脱氧次黄嘌呤修饰。可以理解的是只要符合分子生物学实验的常规实验原理，本发明不限制引物的修饰方式。在一些优选的实施方式中，所述引物使用荧光标记修饰，经荧光标记修饰的引物可用于荧光定量pcr。
本发明还提供了一种包含上述引物对的试剂盒。将上述引物对预先制备成为试剂盒，可提高实验效率，该试剂盒配合其他分子生物学实验中常用试剂可以具有广泛的用途。例如该试剂盒可选地包括mg2+、dntp、dna聚合酶等pcr试剂时可以作为pcr扩增试剂盒，当进一步还包括荧光染料时可以作为荧光定量pcr试剂盒。可以理解的是，该试剂盒可以用于检测待测样品中是否独立的包含蒺藜苜蓿生态型a17或蒺藜苜蓿生态型r108，也可以用于检测是否同时包含蒺藜苜蓿生态型a17或蒺藜苜蓿生态型r108；当该试剂盒还包含检测其他物种的引物时，也可用于同时检测多种物种的样品。
本发明还提供了一种上述引物对或上述试剂盒在检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108中的用途。上述引物对不仅能够从待测样品中检测出其中是否含有蒺藜苜蓿生态型a17和/或蒺藜苜蓿生态型r108的成分，更重要的是上述引物对可以鉴别蒺藜苜蓿生态型a17和蒺藜苜蓿生态型r108的种子，上述两种生态型的蒺藜苜蓿的种子在外观形态上极其相似，分辨十分困难。但是上述两种生态型的蒺藜苜蓿在分子生物学研究领域中具有不同的作用，生态型a17常用于t-dna插入分析；生态型r108因为具有基因组小、种子产量大和种子成熟时间短等特点，常被用于研究相关的分子遗传过程。因此如果混淆了生态型a17和生态型r108的种子将给蒺藜苜蓿基因功能研究造成不可挽回的损失。因此鉴别上述两种生态型的种子十分有应用价值和意义。
本发明还提供了一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法，该方法包括如下步骤：对待测样品的dna进行pcr扩增，通过检测扩增产物中是否包含蒺藜苜蓿生态型a17和/或r108的dna片段判断待测样品中是否包含蒺藜苜蓿生态型a17和/或r108的成分；其中，所述pcr扩增时使用的引物包含上述引物对，既引物nst480-f和引物nst480-r。可以理解的是，所述pcr扩增时使用的引物除了引物nst480-f和引物nst480-r还可以包含其他引物对，以达到同时扩增其他目的片段的目的。例如当需要检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108中是否掺杂其他物种和其他生态型时，可以添加相应的引物，进行复合pcr，本发明不限制添加的其他引物对，可以理解的是，另添加的引物对不应该影响本发明引物对的扩增效率。可以理解的是，上述pcr例如可以为但不限于为普通pcr、荧光定量pcr或高分辨率溶解度曲线(hrm)等，本发明不限制pcr的类型，只要可以使用本发明提供的引物对进行链式聚合酶反应即可；本发明也可以进一步对pcr的体系和使用的试剂进行改进以增强pcr的反应效率，但这些改进都是基于扩增时使用本发明提供的引物对完成的。
本发明提供的检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法，省时省力，操作简便，在实验室条件下较短时间内能够很好的完成，具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点。
在一些优选的实施方式中，所述待测样品为蒺藜苜蓿的种子。该方法可以有效的鉴别出蒺藜苜蓿不同生态型a17和r108的种子，有助于种子检验人员对a17和r108种子的区分，使蒺藜苜蓿更好的为豆科植物分子研究服务，此方法具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点，还能够进行大批量蒺藜苜蓿种子真伪的鉴别，为保障蒺藜苜蓿种子纯度检测提供可行依据。
在一些优选的实施方式中，先将种子萌发后再提取种子的基因组dna。在一些可选地实施方式中，在22-27℃条件下，在滤纸上将种子萌发60-84h后再提取种子基因组dna。可选地，种子萌发的温度例如可以为但不限于为22℃、23℃、24℃、25℃、26℃或27℃，优选25℃；可选地，种子萌发的时间例如可以为但不限于为60h、62h、65h、70h、72h、75h、78h、80h或84h，优选72h；优选采用双层滤纸萌发法萌发种子。由于种皮较厚不易破碎，先将种子萌发便于后续提取种子dna，优选采用sds的方法提取种子dna。
在一些可选的实施方式中，所述pcr扩增的体系为20μl体系，其中包括takara2×pcrtaqmix10μl，浓度为50ng/μldna模板1μl，浓度为10nm的引物nst480-f1μl，浓度为10nm的引物nst480-r1μl和ddh2o7μl；在用于检测的pcr扩增反应中，20μl体系即可以满足扩增后产物检测的用量的需要。可以理解的是，上述pcr体系可以根据实际的实验和检测情况进行调整和优化。
在一些可选的实施方式中，所述pcr扩增的条件为a)94℃预变性4分钟；b)94℃变性30秒；c)50-56℃退火30秒；d)72℃延伸30秒；e)72℃延伸7分钟；其中，步骤b)-d)循环25-40次。可选地，上述退火温度例如可以为但不限于为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃或56℃，优选50-56℃，更优选52℃；可选地，步骤b)-d)循环次数例如可以为但不限于为25、28、30、32、35、38或者40次，优选32-36次。上述pcr扩增条件可以根据pcr体系的改变进行调整和优化。
在一些可选的实施方式中，例如可以为但不限于使用聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳等方法检测pcr扩增的产物，也可以将pcr产物直接测序，或者当使用荧光定量pcr或hrm等可以在pcr扩增的同时显示产物的方法时，也可以选择不使用额外的技术手段检测pcr的扩增产物，因此可以理解的是本发明不限制pcr产物的检测方法。在一个优选地的实施方式中，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法检测扩增产物，该方法成本低，速度快，不需要额外修饰引物；优选使用凝胶为6％-10％的page胶，例如可以为但不限于浓度为6％、7％、8％、9％或10％的page胶，优选浓度为8％的page胶，可以通过调整优化电泳的条件使电泳的条带更为清晰。
下面结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的引物对
本实施例提供了一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108，该引物对包含引物nst480-f和引物nst480-r，其中，引物nst480-f具有如seqidno.1所示序列，引物nst480-r具有如seqidno.2所示序列。
nst480-f(5′-3′)：ggagaacaatgagaacaacaatg
nst480-r(5′-3′)：gaccaccatcaccacatgc
实施例2一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的试剂盒
本实施例提供了一种检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的试剂盒，该试剂盒包含如下组分：引物nst480-f和引物nst480-r、2×pcrmaster和ddh2o；
其中2×pcrmaster包含3mmmgcl2，0.2mmdntp，0.1u/μltaq和2×pcrbuffer。
实施例3一种鉴别紫蒺藜苜蓿生态型a17和r108的种子的方法
本实施例提供了一种鉴别紫蒺藜苜蓿生态型a17和r108的种子的方法，该方法包含如下步骤：
a)收集蒺藜苜蓿生态型a17和r108不同突变型的种子，采用双层滤纸萌发法，25℃萌发72小时，sds法提取萌发种子基因组dna备用；
b)使用引物nst480-f和引物nst480-r对步骤a)中提取的基因组dna进行pcr扩增；
pcr扩增体系为20μl体系，其中包括takara2×pcrtaqmix10μl，浓度为50ng/μldna模板1μl，浓度为10nm的引物nst480-f1μl，浓度为10nm的引物nst480-r1μl和ddh2o7μl；
pcr扩增程序：a)94℃预变性4分钟；b)94℃变性30秒；c)52℃退火30秒；d)72℃延伸30秒；步骤b)-d)循环35次；e)72℃延伸7分钟；
c)pcr产物检测：用8％的page胶进行检测，100ml体系，53.0mlh20，26.3ml聚丙烯，20ml5×tbe，700μl35％过硫酸铵，70μltemed，凝固50min，在竖板电泳仪中，200v电压电泳1h40min，之后用核酸染料染色，放在凝胶成像仪上照相；根据扩增产物片段判断种子是生态型a17还是生态型r108。
实施例4引物nst480-f和引物nst480-r扩增蒺藜苜蓿种子dna
取蒺藜苜蓿生态型a17中30种不同的突变株种子，种子信息如表1所示；取蒺藜苜蓿生态型r108中30种不同的突变株种子，种子信息如表2所示；将所有种子采用双层滤纸萌发法，25℃萌发72小时，sds法提取萌发种子基因组dna，将基因组dna浓度稀释为50ng/μl作为模板，pcr扩增的体系，反应条件以及扩增产物电泳的方法同实施例3；结果如图1和图2所示，其中各泳道代表的样品如表1和表2所示，泳道m代表marker；从图1和图2可以看出，以蒺藜苜蓿生态型a17和r108的种子基因组dna为模板的电泳条带清晰明亮，以蒺藜苜蓿生态型a17种子的基因组dna为模板时条带为176bp，以蒺藜苜蓿生态型r108种子的基因组dna为模板的电泳条带为167bp，并且引物nst480-f和引物nst480-r可以扩增出多种突变体的dna。
表1蒺藜苜蓿生态型a17突变体信息
表1蒺藜苜蓿生态型r108突变体信息
实施例5引物nst480-f和引物nst480-r
为进一步验证引物nst480-f和引物nst480-r的有效性，对蒺藜苜蓿生态型a17和r108的扩增产物的dna片段进行了测序。其结果显示紫蒺藜苜蓿生态型a17和r108的扩增产物片段中都包含引物nst480-f和引物nst480-r。
以50ng/μl蒺藜苜蓿生态型a17基因组dna为模板，采用引物nst480-f和nst480-r引物进行pcr扩增。pcr体系和方法同实施例3。pcr产物经2％琼脂糖中检测，回收长度约170bp的dna片段，连接pgem-t载体后得到pgem-t-nst480-a17重组质粒，将该质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。将含pgem-t-nst480-a17质粒的大肠杆菌涂于含amp、iptg和x-gal的lb培养基上，37℃过夜培养，挑取3个阳性克隆菌斑，在含amp的lb液体培养基中37℃过夜摇菌培养。菌液检测后与预计条带大小相符，送上海生工生物工程有限公司进行测序，挑选3个阳性克隆菌株，送去测序。结果显示，引物nst480-f和引物nst480-r可以很好地对蒺藜苜蓿生态型a17的dna片段进行扩增，扩增出了176bp的专用基因片段。其中扩增出的蒺藜苜蓿生态型a17的片段具有如seqidno.3所示序列，该序列片段长度为176bp，其互补序列如seqidno.4所示。
以50ng/μl蒺藜苜蓿生态型r108基因组dna为模板，采用引物nst480-f和nst480-r引物进行pcr扩增。pcr体系和方法同实施例3。pcr产物经2％琼脂糖检测，回收长度约167bp的dna片段，连接pgem-t载体后得到pgem-t-nst480-r108重组质粒，将该质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。将含pgem-t-nst480-r108质粒的大肠杆菌涂于含amp、iptg和x-gal的lb培养基上，37℃过夜培养，挑取3个阳性克隆菌斑，在含amp的lb液体培养基中37℃过夜摇菌培养。菌液检测后与预计条带大小相符，送上海生工生物工程有限公司进行测序，挑选3个阳性克隆菌株，送去测序。结果显示，引物nst480-f和引物nst480-r可以很好地对蒺藜苜蓿生态型r108的dna片段进行扩增，扩增出了167bp的专用基因片段。其中扩增出的蒺藜苜蓿生态型r108的片段具有如seqidno.5所示序列，该序列片段长度为167bp，其互补序列如seqidno.6所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
sequencelisting
<110>兰州大学
<120>引物对及包含其的试剂盒、用途和检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法
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