本发明属于核酸检验领域，关于一种同时检测马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr引物、试剂盒及方法。
背景技术：
马梨形虫病是由马泰勒虫(旧名马巴贝斯虫)和驽巴贝斯虫(旧名马焦虫)寄生于马属动物(包括马、驴、骡和斑马)的红细胞内，从而引起的蚌传性血液原虫病。该病在世界各地广泛流行，且死亡率高，我国大部分省市几乎都有过该病的发生或病原的分离报道，给我国畜牧业生产造成了巨大的经济损失。据估计，我国每年约有3500万头(只)小反刍动物感染梨形虫病，直接年经济损失可达3～4亿元。
马传染性贫血病简称马传贫(eia)，是由马传染性贫血病病毒引起的马、骡、驴传染病。本病于1843年首先在法国发现，直至1904年才由法国兽医师瓦勒和卡雷证实是由病毒引起。第一次和第二次世界大战期间曾广泛传播，现几乎遍及全世界，对养马业造成巨大经济损失。中国于1955年证实有此病，仅能感染马属动物(马、骡、驴)，在自然条件下，以马的易感性最高，骡、驴次之。马梨形虫病和马传染性贫血病在临床上症状相似度极高，其特征主要为间歇性发烧、消瘦、进行性衰弱、贫血、出血和浮肿；在无烧期间则症状逐渐减轻或暂时消失。世界动物卫生组织(oie)将马梨形虫病和马传染性贫血病列为b类疫病，我国将其列为二类疫病。
综上所述，马梨形虫病和马传染性贫血病严重影响马属动物(马、骡、驴)的养殖，对畜牧业带来严重的经济影响，建立一种能够同时检测马梨形虫病和马传染性贫血病的试剂为目前所需。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种同时检测马梨形虫病和马传染性贫血病三重荧光定量pcr引物和探针。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测马梨形虫病和马传染性贫血病三重荧光定量pcr试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种同时检测马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr引物，其核苷酸序列如下所示：
马泰勒虫引物：
thf1：5'-cgtttactttgagaaaattagag-3'，
thr1：5'-taaccattactcyggctcct-3'；
驽巴贝斯虫引物：
baf1：5'-aatccggccaatagcact-3'，
bar1：5'-cgcgagtcacgttcttct-3'；
马传染性贫血病毒引物：
eiavf1：5'-aaggtgacggthcaggggt-3'，
eiavr1：5'-aacrtcytccagcaatggaa-3'。
一种同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr探针，其核苷酸序列如下所示：
马泰勒虫探针：
thp1：5'-cttttgccttgaatactttagcatggaat-3'；
驽巴贝斯虫探针：
bap1：5'-caagaaccacagttacttccacgac-3'；
马传染性贫血病毒探针：
eiavp1：5'-taartccaccaaacttagcgcccag-3'。
进一步的，所述探针的5'标记的荧光基团为：fam、vic、texasred中的一种，探针的3'标记的淬灭基团为：bq1、bq2中的一种；且探针thp1、bap1和eiavp1的5'标记的荧光基团不一致。
一种同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。
进一步的，该试剂盒中还含有上述所述的探针。
进一步的，该试剂盒中还含有酶液，所述酶液由taq酶、mlv酶和酶稀释液组成。
进一步的，所述taq酶、mlv酶和酶稀释液的体积比为3.5～4.5：1：4.5～5.5。
一种同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr方法，包含以下步骤：
1)提取样本核酸；
2)以提取的核酸为模板，用所述的引物thf1、thr1、baf1、bar1、eiavf1和eiavr1，及所述探针thp1、bap1和eiavp1进行荧光pcr扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增产物进行曲线分析，确定样品中是否含有马泰勒虫、驽巴贝斯虫、马传染性贫血病毒。
进一步的，步骤2)中的荧光pcr扩增反应体系为：
所述酶液含有taq酶和mlv酶。
进一步的，步骤2)中的荧光pcr扩增反应程序为：40-45℃逆转录15～20min，循环1次；93～95℃预变性1～10min，循环1次；93～95℃变性5～15s，循环36～45次；55～60℃退火、延生及信号采集30～60s，循环36～45次。
本发明的有益效果是：
本发明提供的马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光pcr检测试剂盒及其检测方法，能同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒。准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光rt-pcr检测试剂盒标准品10倍稀释梯度扩增曲线图；
图2是本发明实施例提供的马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光rt-pcr检测试剂盒检测马泰勒虫的fam通道定量标准曲线图；
图3是本发明实施例提供的马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光rt-pcr检测试剂盒检测驽巴贝斯虫的vic通道定量标准曲线图；
图4是本发明实施例提供的马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光rt-pcr检测试剂盒检测马传染性贫血病毒的texasred通道定量标准曲线图；
图5是本发明实施例提供的马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光rt-pcr检测试剂盒阳性对照和阴性对照扩增结果图；
图6是本发明实施例提供的马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光rt-pcr检测试剂盒检测6个核酸样本的扩增结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
一种同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr引物，其核苷酸序列如下所示：
马泰勒虫引物：
thf1：5'-cgtttactttgagaaaattagag-3'，
thr1：5'-taaccattactcyggctcct-3'；
驽巴贝斯虫引物：
baf1：5'-aatccggccaatagcact-3'，
bar1：5'-cgcgagtcacgttcttct-3'；
马传染性贫血病毒引物：
eiavf1：5'-aaggtgacggthcaggggt-3'，
eiavr1：5'-aacrtcytccagcaatggaa-3'。
一种同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr探针，其核苷酸序列如下所示：
马泰勒虫探针：
thp1：5'-cttttgccttgaatactttagcatggaat-3'；
驽巴贝斯虫探针：
bap1：5'-caagaaccacagttacttccacgac-3'；
马传染性贫血病毒探针：
eiavp1：5'-taartccaccaaacttagcgcccag-3'。
优选的，所述探针的5'标记的荧光基团为：fam、vic、texasred中的一种，探针的3'标记的淬灭基团为：bq1、bq2中的一种；且探针thp1、bap1和eiavp1的5'标记的荧光基团不一致。
一种同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。
优选的，该试剂盒中还含有上述所述的探针。
优选的，该试剂盒中还含有酶液，所述酶液由taq酶、mlv酶和酶稀释液组成。
优选的，所述taq酶、mlv酶和酶稀释液的体积比为3.5～4.5：1：4.5～5.5。
一种同时检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr方法，包含以下步骤：
1)提取样本核酸；
2)以提取的核酸为模板，用所述的引物thf1、thr1、baf1、bar1、eiavf1和eiavr1，及所述探针thp1、bap1和eiavp1进行荧光pcr扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增产物进行曲线分析，确定样品中是否含有马泰勒虫、驽巴贝斯虫、马传染性贫血病毒。
优选的，步骤2)中的荧光pcr扩增反应体系为：
所述酶液含有taq酶和mlv酶。
优选的，步骤2)中的荧光pcr扩增反应程序为：40-45℃逆转录15～20min，循环1次；93～95℃预变性1～10min，循环1次；93～95℃变性5～15s，循环36～45次；55～60℃退火、延生及信号采集30～60s，循环36～45次。
实施例1一种同时检测马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr引物和探针
本发明根据马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒通用的核酸序列，设计了大量用于检测马梨形虫病和马传染性贫血病毒三重荧光定量pcr的引物和探针；本发明经过大量筛选，筛选出一组灵敏度高和特异性强的引物和探针，序列如下：
所述马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒的引物序列包括：
马泰勒虫引物：
thf1：5'-cgtttactttgagaaaattagag-3'(seqidno:1)，
thr1：5'-taaccattactcyggctcct-3'(seqidno:2)；
驽巴贝斯虫引物：
baf1：5'-aatccggccaatagcact-3'(seqidno:3)，
bar1：5'-cgcgagtcacgttcttct-3'(seqidno:4)；
马传染性贫血病毒引物：
eiavf1：5'-aaggtgacggthcaggggt-3'(seqidno:5)，
eiavr1：5'-aacrtcytccagcaatggaa-3'(seqidno:6)。
马泰勒虫探针：
thp1：5'-fam-cttttgccttgaatactttagcatggaat-bq1-3'(seqidno:7)；
驽巴贝斯虫探针：
bap1：5'-vic-caagaaccacagttacttccacgac-bq1-3'(seqidno:8)；
马传染性贫血病毒探针：
eiavp1：5'-texasred-taartccaccaaacttagcgcccag-bq2-3'(seqidno:9)。
作为优选实施例，所述pcr检测时，对不同的所述基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒基因探针上标记的荧光信号不相同。本发明选用了fam、vic和texasred荧光基团标记，但是本发明要求的权利不仅限于这3种固定荧光标记。
实施例2阳性标准品制备、三重荧光定量pcr扩增
1)标准样品的制备
为绘制三重荧光定量pcr的标准曲线，我们分别提取阳性马泰勒虫、驽巴贝斯虫dna作为pcr模板，分别用引物将相应的靶序列进行扩增，将扩增产物连入载体中，分别获得含马泰勒虫、驽巴贝斯虫靶序列的质粒，即马泰勒虫阳性标准品、驽巴贝斯虫阳性标准品。另外，提取马传染性贫血病毒的基因组核酸，逆转录后用引物将相应的靶序列进行扩增，将扩增产物连入载体中，获得含马传染性贫血病毒靶序列的质粒，即马传染性贫血病毒阳性标准品。
2)阳性标准样品的三重荧光定量pcr检测
将上述马泰勒虫阳性标准品、驽巴贝斯虫阳性标准品、马传染性贫血病毒阳性标准品进行10倍梯度稀释作为标准品来检测定量范围。
最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行扩增，每个梯度3个复孔；
其中，荧光pcr扩增反应体系为：
每1μl酶液含有0.4μltaq酶、0.1μlmlv酶和0.5μl酶稀释液。
pcr扩增反应程序为：42℃逆转录20min；95℃预变性5min；95℃变性15s；55℃退火、延伸及信号采集50s；循环40次。
3)绘制标准曲线及结果分析
检测结果如图1～4所示，图1为马梨形虫病和马传染性贫血三重荧光rt-pcr检测试剂盒标准品10倍稀释梯度扩增曲线图；图2为马泰勒虫的fam通道阳性标准品的标准曲线图，图3为驽巴贝斯虫的vic通道定量标准品的标准曲线图，图4为马传染性贫血病毒的texasred通道定量标准品的标准曲线图。从图中可以看出，在101～105copies/ml范围内标准曲线呈现良好的线性关系(famr2＝0.996；vicr2＝0.994；texasredr2＝0.996)，检测下限为10copies/ml。
上述结果说明本发明针对马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒基因分别设计特异性引物和taqman探针，在反应体系中含有马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒基因模板的情况下，可以实现pcr反应，并释放荧光信号。利用荧光定量pcr仪器对pcr过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
实施例3一种同时检测马梨形虫病和马传染性贫血病三重荧光pcr方法
1)样本核酸提取：待提样本6例，包含4例马梨形虫病和2例马传染性贫血病血清样本，由广州市动物疫病监察所提供。所述样本核酸提取优选采用急性期(发病5日内)、恢复期和监测点马属动物血清100μl。
2)以提取的核酸为模板进行三重荧光定量pcr
pcr反应体系为：
每1μl酶液含有0.4μltaq酶、0.1μlmlv酶和0.5μl酶稀释液。
pcr扩增反应程序如下：
42℃逆转录20min；95℃预变性5min；95℃变性15s；55℃退火、延伸及信号采集50s；循环40次。
同时，设置阴性对照组和阳性对照组，其中阴性对照为不含有马泰勒虫、驽巴贝斯虫和马传染性贫血病毒基因组的生理盐水溶液。阳性对照组为同时含有马泰勒虫阳性标准品、驽巴贝斯虫阳性标准品、马传染性贫血病毒阳性标准品的溶液。
3)结果分析：通过荧光扩增曲线图ct值的大小来判断结果的阴阳性的，确定样品中是否含有马泰勒虫、驽巴贝斯虫、马传染性贫血病毒。当扩增曲线图ct值≤36,并呈现明显指数增长时,结果表现为阳性；当扩增曲线图ct值>36或无ct值,结果表现为阴性；因此,为了在判断阴阳性时具有参照，检测样本时需要给马梨形虫病和马传染性贫血病三重荧光rt-pcr检测试剂盒设置阴性对照液和阳性对照液。
本发明实施例中，用于检测马梨形虫病和马传染性贫血病的荧光定量pcr仪包括但不限于：abi系列、bio-rad系列(icycler/mjopticon2)、stratagenemx系列、rochelightcycler、ccpheidsmartcycler、corbettrortor-gene、杭州博日系列。
检测结果如图5～6所示，其中图5为阳性对照和阴性对照扩增结果图；图6为阴性对照组和6例样本的扩增结果，其中3例仅能检出马泰勒虫，1例可同时检测出马泰勒虫和驽巴贝斯虫，2例检出马传染性贫血病毒，检测结果符合预期，准确率达100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含本发明的保护范围之内。
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