本发明属于pcr检测技术领域，尤其涉及艾滋病治疗药物nrtis耐药突变位点g73c的引物及其应用。
背景技术：
艾滋病自1981年发现以来，迅速在全世界蔓延，已成为危害人类健康的重大公共卫生问题。据unaids报道，截至2016年11月30日，全国报告现存活艾滋病病毒(hiv)感染者/aids病人659990例，报告死亡206336例。现存活hiv感染者383983例，aids病人276007例。
高效抗逆转录病毒治疗已广泛应用于艾滋病患者的临床治疗，目前约有1560万艾滋病病毒感染者接受抗逆转录病毒治疗，极大地提高了患者的生存率。然而，抗病毒治疗的人数及地区的快速扩大也导致艾滋病耐药毒株的传播和流行。我国不同地区抗病毒治疗人群耐药发生率从3％到56％不等。
对于艾滋病初治患者，抗病毒治疗方案为2种核苷类逆转录酶抑制剂(nrtis)+1种非核苷类逆转录酶抑制剂(nnrtis)或2种nrtis+1种蛋白酶抑制剂(pis)，分别以hiv病毒pol基因上的逆转录酶和蛋白酶为靶标。艾滋病的耐药发生在艾滋病病毒pol基因(seq.id.no.11)上，主要分为nrtis耐药突变、nnrtis耐药突变和pis耐药突变。其中pis药物有沙奎那韦，利托那韦，茚地那韦，奈非那韦，安普那韦和洛匹那韦等，可诱导产生g73c、i54v、g73c等耐药突变。
病毒耐药是导致治疗失败的主要原因之一，采用经济高效的耐药检测方法，及时了解hiv治疗患者的耐药性，对于提高艾滋病治疗效果和控制艾滋病疫情有重要意义。临床上广泛使用的耐药检测方法是基于测序的基因型检测，包括直接测序法、克隆测序分析、连续特异性扩增分析、深度焦磷酸测序等。这些方法虽然操作较为简单，但缺点明显，如检测时间长、费用高等。
等位基因特异性pcr(aspcr)是一种快速、准确、低成本的检测单碱基突变的技术。通过设计引物，使引物的3’末端倒数第二位碱基与突变位点配对，且可在3’末端倒数第三位自造碱基错配以试图提高引物特异性。进行pcr时，模板正确匹配的引物正常扩增，而与模板错误配对的引物没有扩增产物，从而确定序列的基因型。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供特异性强的艾滋病治疗药物nrtis耐药突变位点g73c的引物及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
艾滋病治疗药物nrtis耐药突变位点g73c的引物，为引物对一、引物对二、引物对三、引物对四或引物对五，每个引物对均由上游特异序列和下游序列组成；引物对一的上游特异序列和下游序列分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列；引物对二的上游特异序列和下游序列分别具有序列表seq.id.no.3和seq.id.n0.4的碱基序列；引物对三的上游特异序列和下游序列分别具有序列表seq.id.no.5和seq.id.no.6的碱基序列；引物对四的上游特异序列和下游序列分别具有序列表seq.id.no.7和seq.id.no.8的碱基序列；引物对五的上游特异序列和下游序列分别具有序列表seq.id.no.9和seq.id.no.10的碱基序列。
上述引物在检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点g73c中的应用。
艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点g73c的aspcr检测方法，采用上述引物，针对g73c位点突变以待检测样品的cdna为模板进行pcr扩增。
上述aspcr检测方法，pcr反应体系共25μl，其中2xsybrgreenpcrmastermix12.5μl，突变位点的上下游引物各1.0μl，待检样品cdna模板2μl，ddh2o8.0μl，rox0.5μl；pcr反应程序为：①预变性95℃1min，②然后95℃10sec，退火60℃60min，延伸72℃1min，重复40个循环。
检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点g73c的试剂盒，包括上述引物。
上述试剂盒，包括上述引物、2xsybrgreenpcrmastermix、ddh20和rox。
针对艾滋病耐药检测存在的问题，发明人利用等位基因特异性pcr技术设计并制备了检测艾滋病核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点g73c的aspcr引物(引物对一、引物对二、引物对三、引物对四或引物对五)，每个引物对均由上游特异序列和下游序列组成。据此，发明人还建立了相应检测方法及试剂盒。应用本发明可检测hiv-1病毒rna的pol基因的399位氨基酸的碱基进行突变，设计的aspcr引物只针对特定位点碱基突变序列，能特异性扩增突变模板，以有效检测艾滋病低丰度耐药，克服了基因型检测方法实验周期长、检测丰度高的缺点。本发明只涉及real-timepcr检测这一常见方法，易于掌握，操作快速，具有特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点，根据pcr的扩增曲线和ct值即可判断基因类型。
附图说明
图1是引物对一分别针对野生型模板与突变型模板的荧光定量pcr结果图，图中：1.引物对一针对野生型模板的荧光定量pcr结果，2.引物对一针对突变型模板的荧光定量pcr结果。
图2是引物对二分别针对野生型模板与突变型模板的荧光定量pcr结果图，图中：1引物对二针对野生型模板的荧光定量pcr结果，2引物对二针对突变型模板的荧光定量pcr结果。
图3是引物对三分别针对野生型模板与突变型模板的荧光定量pcr结果图，图中：1.引物对三针对野生型模板的荧光定量pcr结果，2.引物对三针对突变型模板的荧光定量pcr结果。
图4是引物对四分别针对野生型模板与突变型模板的荧光定量pcr结果图，图中：1.引物对四针对野生型模板的荧光定量pcr结果，2.引物对四针对突变型模板的荧光定量pcr结果。
图5是引物对五分别针对野生型模板与突变型模板的荧光定量pcr结果图，图中：1.引物对五针对野生型模板的荧光定量pcr结果，2.引物对五针对突变型模板的荧光定量pcr结果。
具体实施方式
实施例1hiv-1野生型质粒和突变型质粒的构建
(1)将经测序鉴定不含耐药突变的蛋白酶基因序列(长度970kb，)与pbi121载体进行连接，然后转化、提取质粒dna，测序验证质粒连接正确，获得hiv-1野生型克隆质粒，稀释至0.1ng/μl。
(2)通过人工定点突变的方法，分别对hiv-1野生型克隆质粒中对应逆转录基因第399位氨基酸的碱基进行突变，获得g73c位点的突变型质粒；稀释至0.1ng/μl。
实施例2aspcr方法检测g73c位点的特异度和灵敏度
分别以hiv-1野生型克隆质粒、g73c位点突变型质粒为模板，利用g73c位点突变型扩增引物对一(seq.id.no.1和seq.id.no.2)进行real-timepcr检测。反应体系和反应程序如下：
pcr反应体系共25μl，其中2xsybrgreenpcrmastermix12.5μl，突变位点的上下游引物各1.0μl，待检样品cdna模板2μl，ddh2o8.0μl，rox0.5μl；pcr反应程序为：①预变性95℃1min，②然后95℃10sec，退火60℃60min，延伸72℃1min，重复40个循环；③以每5秒升高0.5℃的速度，从60℃升至95℃，获得产物的特异性溶解峰。根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值判定结果，当以野生型模板进行pcr所获得的ct值与以突变型模板进行pcr时所获得的ct值的差值大于3.3时，认为扩增引物对对应的基因突变具有较好的特异性。
结果如图1所示，对于野生型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为27.14，对于突变型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为23.24，二者区别明显，扩增特异性较高。
实施例3aspcr方法检测g73c位点的特异度和灵敏度
分别以hiv-1野生型克隆质粒、g73c位点突变型质粒为模板，利用g73c位点突变型扩增引物对二(seq.id.no.3和seq.id.no.4)进行real-timepcr检测。反应体系、反应程序、判断方法参照实施例2。
结果如图2所示，对于野生型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为26，对于突变型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为21.7，二者区别明显，扩增特异性较高。
实施例4aspcr方法检测g73c位点的特异度和灵敏度
分别以hiv-1野生型克隆质粒、g73c位点突变型质粒为模板，利用g73c位点突变型扩增引物对三(seq.id.no.5和seq.id.no.6)进行real-timepcr检测。反应体系、反应程序、判断方法参照实施例2。
结果如图3所示，对于野生型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为31.73，对于突变型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为26.03，二者区别明显，扩增特异性较高。
实施例5aspcr方法检测g73c位点的特异度和灵敏度
分别以hiv-1野生型克隆质粒、g73c位点突变型质粒为模板，利用g73c位点突变型扩增引物对四(seq.id.n0.7和seq.id.n0.8)进行real-timepcr检测。反应体系、反应程序、判断方法参照实施例2。
结果如图4所示，对于野生型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为30.6，对于突变型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为24.18，二者区别明显，扩增特异性较高。
实施例6aspcr方法检测g73c位点的特异度和灵敏度
分别以hiv-1野生型克隆质粒、g73c位点突变型质粒为模板，利用g73c位点突变型扩增引物对五(seq.id.no.9和seq.id.no.10)进行real-timepcr检测。反应体系、反应程序、判断方法参照实施例2。
结果如图5所示，对于野生型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为30.68，对于突变型模板，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数ct值为22.65，二者区别明显，扩增特异性较高。
为方便现场和基层快速检测使用，根据实施例的研究结果，可以组装检测试剂盒，试剂盒包括aspcr引物、2xsybrgreenpcrmastermix、ddh2o和rox。
序列表
<110>广西医科大学
<120>艾滋病治疗药物nrtis耐药突变位点g73c的引物及其应用
<160>11
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