本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种高产乙酸乙酯菌种的筛选及其应用。
背景技术：
：乙酸乙酯是我国白酒中含量较多的香味物质之一，尤其是对清香型、凤香型和米香型等白酒的风格及成型具有重要作用。同时它又是清香型白酒的主体香味成分，也可作为人造香料的基础物质及其他食品行业的添加剂。鉴于乙酸乙酯在食品行业中的重要作用及食品行业对乙酸乙酯的高需求量，高产乙酸乙酯的菌株成为研究急需解决的问题，目前乙酸乙酯生成主要有3条途径：一是通过化工方法来合成乙酸乙酯，然后再进行提纯；此方法由于化学药品的使用，存在危害物质的残留，二是微生物主要为产酯酵母，如异常毕赤酵母的发酵生成，此方法是目前主要的工业生产使用的方法，如中国专利公布号cn105349444a公开了一种从曲药、酿造醅或酿造原料中筛选出的低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，但普通的酵母产酯量已远远不能满足现在生产的需求；三是从菠萝、香蕉等果品中提取，此方法虽然健康安全，但提取成本较高，不利于大规模工业生产。技术实现要素：根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种高产乙酸乙酯菌种的筛选及其应用，为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种高产乙酸乙酯菌种的筛选，该筛选方法为：将酒糟、酒丸与酒饼研磨混合，将混合料置于浓度10％的乙醇中进行浸泡30-45min，取10g浸泡后的混料接入150ml富集培养基中，置于28℃进行培养34-36h，稀释涂布在平板培养基中，在28℃，摇床150r/min，培养36-48h，挑取发酵形成具有酵母典型特征的菌落，接入斜面培养基，与28℃培养至长出菌苔，挑选透明圈和菌落直径较大的菌落，接入种子培养基中，在28℃，摇床180r/min，培养16-20h，将种子培养液接入发酵培养基中，相同温度下培养24h，发酵结束后，再选透明圈和菌落直径较大的菌落，接入种子培养基中，进行发酵复筛，测定发酵液酯含量，筛选出高产乙酸乙酯的菌种。优选的，所述酒糟、酒丸与酒饼的质量比为1:0.5:0.3。优选的，所述富集培养基成分为：葡萄糖40g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏6g/l，kcl0.41g/l，kh2po41.5g/l，nacl80g/l及氯霉素0.4g/l，ph为5.5。优选的，所述平板培养基成分为：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，氯霉素0.4g/l，琼脂20g/l，ph为5.5。优选的，所述种子培养基成分为：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，kh2po41.5g/l，mgs04·7h200.5g/l，ph为5.5。优选的，所述发酵培养基的成分包含有：葡萄糖50g/l，酵母膏5g/l，kh2p041.5g/l，mgs04·7h2o0.5g/l，乙酸0.5％，体积分数95％的乙醇5％，调整ph为ph5.5。一种高产乙酸乙酯菌种的应用，主要应用于食品工业和酿酒行业。与现有技术相比，本发明的有益效果：1.本发明采用乙醇浸泡过的原料进行酵母菌的培养与筛选，克服了常见的酵母菌的耐乙醇性能差的缺点，提高了筛选出的酵母菌的耐乙醇性能，有利于在酿酒过程中酒风味的提升。2.本发明采用种子培养和发酵复筛选培养相交替的培养筛选出的酵母菌种纯度高，且产酯性能提升。具体实施方式下面通过对实施例的描述，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。实施例1一种高产乙酸乙酯菌种的筛选，该筛选方法为：将酒糟、酒丸与酒饼按质量比为1:0.5:0.3进行研磨混合，将混合料置于浓度10％的乙醇中进行浸泡45min，取10g浸泡后的混料接入150ml富集培养基中，富集培养基成分为：葡萄糖40g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏6g/l，kcl0.41g/l，kh2po41.5g/l，nacl80g/l及氯霉素0.4g/l，ph为5.5，然后将富集培养基置于28℃进行培养34h，在无菌操作条件下，将培养液进行梯度稀释成10-1-10-5倍，然后将稀释的培养液分别涂布在平板培养基中，平板培养基成分为：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，氯霉素0.4g/l，琼脂20g/l，ph为5.5，将平板培养基在28℃，摇床150r/min，培养42h，从平板培养基中挑取发酵形成具有酵母典型特征的菌落，接入斜面培养基，斜面培养基的成分是在平板培养基成分的基础上增加了琼脂20g/l，然后将斜面培养基与28℃培养至长出菌苔，挑选透明圈和菌落直径较大的菌落的培养液制备成菌悬液，然后将菌悬液以1.5％的接种量接种到200ml的种子培养基中，种子培养基成分为：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，kh2po41.5g/l，mgs04·7h200.5g/l，ph为5.5，在28℃，摇床180r/min，培养18h，将种子培养液接入发酵培养基中，发酵培养基的成分包含有：葡萄糖50g/l，酵母膏5g/l，kh2p041.5g/l，mgs04·7h2o0.5g/l，乙酸0.5％，体积分数95％的乙醇5％，调整ph为ph5.5，相同温度下培养24h，发酵结束后，选透明圈和菌落直径较大的菌落再次接入种子培养基中，进行发酵复筛，最后测定发酵液酯含量，筛选出高产乙酸乙酯的菌种。筛选出的高产乙酸乙酯菌种主要应用于食品工业和酿酒行业。实施例2将实施例1中筛选出的酵母菌种在ypd培养基中进行活化后，并分6组进行接种发酵，接种量为0.2ml，置于30℃恒温培养相中静止培养3天，6组的酵母菌发酵产物的外观和气味评价如下编号外观气味描述1淡黄色香气淡薄2浅黄色水果香，有甜味3浅黄色酒香4浅黄色酒香，水果香5棕黄色酒香淡薄6浅黄色酒香，水果香实施例3将实施例2中编号4的酵母菌，进行扩大培养后，接种进行发酵培养，发酵结束加入80ml无水乙醇，进行蒸馏，直至蒸馏出液液体积等于发酵液体积，然后，采用回流皂化法测定馏出液中的总酯，测的编号4的总酯量为4.85g/l。上面结合具体实施例对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。当前第1页12