本发明涉及肽聚糖的制备，尤其是涉及一种小分子可溶性肽聚糖的制备方法。
背景技术：
肽聚糖（peptidoglycan,pg）是细菌细胞壁的特有组成部分，其基本结构是由n-乙酰葡萄糖胺（n-acetylglucosamine）和n-乙酰胞壁酸（n-acetylmuramicacid）通过β-1,4糖苷键连接而成的双糖单位，同时糖链间由肽链交联，构成稳定的网状结构。不同细菌来源肽聚糖的肽链构成有所不同。革兰氏阳性细菌细胞壁所含的肽聚糖占干重的50%-80%，革兰氏阴性菌细胞壁所含的肽聚糖占干重的5%-20%，肽聚糖在机体免疫力提高以及食品药品的无菌性检测方面有着重要作用，近年来肽聚糖与临床血流细菌感染的相关性也逐渐受到重视。目前细菌肽聚糖的制备方法主要是通过对细菌液体培养物进行离心或是直接挑取细菌固体培养基单菌落获得菌体，然后用物理或化学方法对收集到的菌体进行处理，破坏细菌的细胞壁，再通过提纯获得肽聚糖，此方法获得的肽聚糖交联度高，几乎不溶或微溶于水，无法直接进行分子量测定，同时活性位点暴露不完全，免疫活性不强，严重限制了肽聚糖在各个领域的研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种小分子可溶性肽聚糖的制备方法，使用该方法制备的可溶性肽聚糖较常规方法制备的肽聚糖的溶解性和免疫活性均有极大提高。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的小分子可溶性肽聚糖的制备方法，包括下述步骤：
第一步，将活化好的细菌菌种配制成0.5麦氏菌悬液，按照1%~5%的接种量接入液体培养基中，37℃培养至生长衰败期，再继续培养1~2天；
第二步，将第一步得到的培养基置于沸水中20分钟灭活，然后离心10分钟后取上清，用三氯乙酸滴至无沉淀后，静置8小时，离心取上清；
第三步，将第二步得到的上清液置于截留分子量为8kd透析袋中，以蒸馏水为透析液透析三天，然后将透析袋内的剩余液体用95%乙醇沉淀，分离、干燥后得到可溶性肽聚糖。经测定，本发明制备的可溶性肽聚糖的分子量呈弥散性，范围为36kd-150kd。
为提高可溶性肽聚糖的产量，在进行第二步灭活前可以采用物理方法（如超声波处理）或化学方法（如溶菌酶处理）促进第一步中的菌体溶解，然后对菌体溶解物再进行第三步处理。
本发明的优点在于利用细菌的过渡生长产生自溶现象制备肽聚糖，降低了菌体破碎的要求，工艺流程简单，生产成本也大大降低。通过对处于生长衰败期细菌的液体培养基进行处理，离心取上清，然后从上清中提取可溶性肽聚糖。通过本方法制备的肽聚糖在水中的溶解度是常规方法制备所得肽聚糖溶解度的500倍以上，配制的同浓度肽聚糖水溶液免疫反应活性是常规方法制备肽聚糖的1000倍左右，为肽聚糖应用于医学检验等方面提供了可能性。
具体实施方式
一、本发明所述的本发明所述的小分子可溶性肽聚糖的制备方法，包括下述步骤：
第一步，细菌培养
将活化好的细菌菌种配制成0.5麦氏菌悬液，按照1%~5%的接种量接入液体培养基中，37℃培养至生长衰败期，再继续培养1~2天；
第二步，去除蛋白质和不溶性肽聚糖
将第一步得到的带有处于生长衰败期细菌的液体培养基置于100℃沸水中20分钟灭活，然后将灭活后的培养基于5000转/分~10000转/分离心10分钟后取上清，用一定浓度的三氯乙酸滴至无沉淀产生后，静置8小时，离心取上清；
第三步，去除无机盐和脂类
将第二步得到的上清液置于截留分子量为8kd透析袋中，以蒸馏水为透析液透析三天，然后将透析袋内的剩余液体用95%乙醇沉淀，分离，将沉淀干燥后即可得到小分子可溶性肽聚糖成品。
为提高可溶性肽聚糖的产量，在进行第二步灭活前可以采用物理方法（如超声波处理）或化学方法（如溶菌酶处理）促进第一步中的菌体溶解。该步骤并不是必须的，因为大部分革兰氏阳性菌在适当培养基中经过度生长自溶产生的可溶性肽聚糖已经相当可观，尤其是生长自溶现象比较明显的细菌（如肺炎链球菌），效果更加明显。
二、下面通过具体实施例对本发明方法做更加详细的说明。
实施例1制备来源于肺炎链球菌的小分子可溶性肽聚糖
第一步，加1.0ml无菌纯化水到肺炎链球菌（atcc49619）菌株冻干品中，充分混匀，转种哥伦比亚血琼脂平板，在35℃-37℃培养24小时，挑取单菌落，
用生理盐水配制成0.5麦氏浓度菌悬液，按照5%接种量接入营养肉汤培养基中，37℃培养5天；
第二步，将培养后的营养肉汤培养基置于100℃沸水20分钟灭活，将灭活后的培养基8000转/分离心10分钟后除去沉淀，取上清，用3%三氯乙酸滴至无沉淀产生，静置8小时，8000转/分离心10分钟后取上清；
第三步，将上清液置于截留分子量为8kd透析袋中，以蒸馏水为透析液，透析3天，将透析袋内的剩余液体用95%乙醇沉淀，分离，将沉淀干燥后即得到可溶性肽聚糖。
经高效液相系统（hplc）测定，该可溶性肽聚糖的分子量分布呈弥散状，范围为36kd-150kd。
实施例2制备来源于金黄色葡萄球菌的小分子可溶性肽聚糖
第一步，加1.0ml无菌纯化水到金黄色葡萄球菌（atcc25923）菌株冻干品中，充分混匀，转种营养琼脂平板，在35℃-37℃培养24小时，挑取单菌落，用生理盐水配制成0.5麦氏浓度菌悬液，按照3%接种量接入营养肉汤培养基中，35~37℃培养6天；
第二步，用无菌纯化水配制5%溶菌酶，按照1:100的体积比加入液体培养基中，混合均匀，37℃消化8h，然后置于超声波处理仪中（500w,20khz）处理30分钟；
第三步，将处理后的培养基置于100℃沸水20分钟灭活，将灭活后的培养基8000转/分离心10分钟后除去沉淀，取上清，用3%三氯乙酸滴至无沉淀产生，静置8小时后，10000转/分离心10分钟后取上清；
第四步，将上清液置于截留分子量为8kd透析袋中，以蒸馏水为透析液，透析3天，将透析袋内的剩余液体用95%乙醇沉淀，分离，将沉淀干燥后即得到可溶性肽聚糖。
经高效液相系统（hplc）测定，该可溶性肽聚糖的分子量分布呈弥散状，范围为36kd-150kd。
三、试验检测
1、溶解性验证
试剂：本发明实施例2制备的来源于金黄色葡萄球菌的小分子可溶性肽聚糖（a）；购自西格玛（货号77140）的来源于金黄色葡萄球菌的肽聚糖（b）；无热源水。
方法及结果：
分别取以上两种肽聚糖10mg置于1ml无热源水中，充分搅拌，静置1小时，含有小分子可溶性肽聚糖的水溶液（a）外观澄清，底部无沉淀；含有肽聚糖的水溶液（b）底部有大量沉淀；此时向水溶液（b）中继续添加无热源水至500ml，充分搅拌后静置1小时，水溶液（b）底部仍然存在明显沉淀。结果证明本发明制备的小分子可溶性肽聚糖（a）在水中的溶解性至少是肽聚糖（b）的500倍。
2、免疫活性验证
试剂：本发明实例2制备的来源于金黄色葡萄球菌的可溶性肽聚糖，购自日本和光纯药的slp试剂，购自日本和光纯药的肽聚糖标准品（1μg/ml，悬浊液），购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司的真菌葡聚糖检测试剂。
方法：
日本和光纯药生产的slp试剂利用昆虫血淋巴的免疫应激反应可特异性的检测样本中的肽聚糖和葡聚糖；基于鲎试剂的真菌葡聚糖检测试剂可特异性的检测样本中的葡聚糖。
2.1将由本发明实例2制备的可溶性肽聚糖以及购自日本和光纯药的肽聚糖标准品分别用无热源水梯度稀释至1μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml,0.001μg/ml（其中和光纯药标准品在稀释及使用前应充分震荡混匀），滴加进两排检测孔中，分别用slp试剂检测（酶标仪检测波长650nm）；其检测结果如下表1所示：
表1
结果显示：本发明实施例2制备的可溶性肽聚糖反应活性明显高于和光纯药肽聚糖标准品，其中本发明0.001μg/ml的可溶性肽聚糖的反应结果与1μg/ml的和光纯药肽聚糖标准品相当。
2.2将本发明实施例2制备的可溶性肽聚糖用无热源水稀释至1mg/ml，然后用真菌葡聚糖检测试剂检测（酶标仪检测波长545nm，参比波长620nm），和空白、阳性对照进行对比，结果见下表2：
表2
结果显示：本发明实施例2制备的可溶性肽聚糖未检出葡聚糖存在，证明本发明方法制备的提取物确为肽聚糖。