本发明属于植物基因工程
技术领域：
：。具体涉及两个棉花基因gbtsa1和gbtsb1在提高棉花抗黄萎病中的应用。从棉花中克隆得到参与到色氨酸的合成的基因gbtsa1和gbtsb1。通过基因沉默技术降低这两个基因的表达水平后，均能显著激活抗病激素水杨酸的合成及其信号路径。接种鉴定表明降低这两个基因的表达水平后可增强棉花对黄萎病的抗性。
背景技术：
：：棉花在我国国民经济中扮演着重要的角色。随着人们生活水平的提高，人们对天然纺织品的需求和质量也越来越高，而同时随着劳动力价格的上涨，棉花种植比较效益下降导致种植面积萎缩，这种供需的严重不平衡使得培育高产优质抗病棉花品种成为目前主要的育种目标。棉花黄萎病是当前危害棉花生产的世界性病害之一，在该病爆发时期，棉花的产量可以减少多达30％(caietal.,2009)。棉花抗黄萎病的机制比较复杂，在占了棉花总产95％的陆地棉种中，几乎没有抗病种质资源(zhangetal.,2011)。另外，在没有寄主的情况下，该病原菌仍可以在土壤中存活10年，这导致当前生产上很难制定切实有效的棉花黄萎病防控措施。植物在与病原菌的互作中进化出了多种防御体系，这些防御体系随着病原物的进化而不断进化。植物的第一道防御系统是植物的既存抗性，比如植物的物理结构包括蜡质，角质层，表皮毛，木栓组织等。当病原菌突破第一道防线入侵到植物细胞内部时，会诱导植物启动第二道防线，即免疫系统。包括pti和eti反应(zhaoetal.,2011)。另外植物还有复杂的激素信号网络系统，如乙烯，水杨酸，茉莉酸等。在这些激素分子中，茉莉酸经常与乙烯互作诱发对死体营养型病原菌的抗性。而水杨酸则介导对活体或半活体营养型病原菌的抗性，而且与系统获得性抗性有关。还有一些内源信号分子如活性氧，油菜素内酯，生长素等也对抗病反应起到很大作用(gaoetal.,2013)。除此之外，人们也更加关注植物产生的一些次生代谢物质如植物抗毒素、萜类和酚类等物质在植物抗病中的作用。目前，植物色氨酸合成路径及其代谢路径在拟南芥中研究最为广泛和深入，并逐渐成为研究植物基因表达调控的模式系统之一。色氨酸与植物抗病反应关系的研究目前主要集中在由色氨酸衍生出的一些次生代谢物质上，如植物抗毒素，芥子硫苷等。拟南芥中植物抗毒素的主要形式是camalexin，其可以抗多种病原菌，如灰霉，甘蓝链格胞菌等(moldrupetal.,2013)。而芥子油苷不仅与植物性食物的芳香和风味有关，而且具有多种生物活性，如参与植物抗病反应，抵抗细菌以及食草类昆虫中具有很大的作用(barthandjander,2006；bednareketal.,2009)，同时对维持生长素稳态，且对人类的癌症防御也起很大的作用(renetal.,2008)。虽然在拟南芥中色氨酸合成路径以及在抗病中的作用研究取得了一定的成果，但是在棉花中的作用却鲜有报道。申请人前期研究发现两个色氨酸合成相关基因gbtsa1和gbtsb1可能参与了植物广谱响应真菌侵染的抗病信号路径或免疫调控(xuetal.,2014)。通过vigs技术将这两个基因沉默后，导致植株出现类病斑，进一步实验分析发现，gbtsa1和gbtsb1沉默后显著激活水杨酸合成以及信号路径，因而显著提高了棉花对黄萎病菌的抗性。申请人的研究表明色氨酸合成相关基因调控sa合成以及信号路径，从而增强棉花对黄萎病菌的抗性，据申请人所知，这在其他物种中还没有报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用病毒诱导的基因沉默技术(vigs)(gaoetal.,2013)技术将棉花中gbtsa1和gbtsb1基因的表达水平降低后，植株出现类病斑表型，且显著增强棉花对黄萎病菌的抗性。gbtsa1和gbtsb1基因的表达水平降低后显著激活了水杨酸合成以及信号路径，对防控棉花黄萎病菌具有重要的意义。本发明的技术方案如下所述：申请人利用genevestigatorv2.0拟南芥芯片数据库在线分析系统(www.genevestigator.com)和拟南芥接种三种真菌(例如马铃薯晚疫病菌(phytophthorainfestans)、灰葡萄孢菌(botryiscinerea)和小麦白粉病菌(blumeriagraminis)后的芯片表达谱数据，对数据进行综合分析，选择在接种三种真菌后表达变化均大于2倍的基因。在ncbi中，通过tblastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)获得与拟南芥广谱响应真菌侵染基因同源的棉花序列，设定e<10-5。然后从中选择参与色氨酸合成的基因gbtsa1，gbtsb1，申请人利用vigs抑制gbtsa1和gbtsb1表达水平后发现棉花植株更抗黄萎病。随后，基因表达分析以及激素测定发现，抑制gbtsa1和gbtsb1表达水平后能显著激活棉花水杨酸(sa)合成以及信号路径，从而增强了棉花对黄萎病菌的抗性。本发明具体步骤如下：参考棉花基因组序列，设计全长引物对gbtsa1和gbtsb1进行扩增，引物序列为：(1)扩增gbtsa1基因gbtsa1-s:tcgaaaaagaacacagaaatgggt，gbtsa1-a:aggaagtacagatttcaaggattt；(2)扩增gbtsb1基因gbtsb1-s:atgtctgctctctctgagctgg，gbtsb1-a:tacctgcaaatgcttatttgct；对pcr产物进行ta克隆反应，将gbtsa1，gbtsb1分别构建到pgem-teasy载体上，通过载体上的m13测序引物对克隆片段进行测序，综合多个测序结果及参考序列进行比对，最终确定了gbtsa1的实际序列，其核苷酸序列如seqidno：1所示，该基因编码的蛋白质序列如seqidno：2所示。gbtsb1的实际序列，其核苷酸序列如seqidno：4所示，该基因编码的氨基酸序列如seqidno：5所示。选取gbtsa1，gbtsb1全长序列的一部分构建病毒诱导的基因沉默(vigs)载体，设计正向引物，该引物带有kpni，反向引物带有bamhi酶切接头的引物序列，如下所示：vigs-gbtsa1-s:cggggtaccaggtgcttgattcatgtggctcgga,，vigs-gbtsa1-a:cgcggatcctcggtctgtcggcgtagttggtgt；vigs-gbtsb1-s:cggggtaccattactcgctaaacgcttgggca，vigs-gbtsb1-a:cgcggatccccatagcatttgaacctccacca(上述引物中加粗且下划线部分为酶切接头序列)，扩增得到如seqidno：3，seqidno：6所述的序列。将trv:00载体用kpni以及bamhi进行双酶切后，将带有酶切接头的gbtsa1，gbtsb1pcr产物与酶切好的trv:00载体进行酶切连接，热击转化大肠杆菌top10，通过pcr鉴定阳性克隆，扩繁并提取质粒，将质粒通过电击的方法转化到农杆菌菌株gv3101感受态中，将pcr鉴定为阳性的克隆保存备用。将含有gbtsa1和含有gbtsb1序列的病毒载体通过农杆菌介导的方法注射到棉花刚平展的子叶中。两周后，提取rna反转录为cdna，检测gbtsa1和gbtsb1基因表达水平，并观察到植株叶片出现坏死斑(见图3)。最后将黄萎病菌v991接种抑制了gbtsa1和gbtsb1表达的植株，发现转基因植株更加抗病(见图4)。通过对抑制gbtsa1和gbtsb1表达水平后的植株以及对照植株中水杨酸和生长素含量测定，发现抑制gbtsa1和gbtsb1表达水平后植株中水杨酸(sa)的含量显著高于对照植株(见图5)。此外，利用qrt-pcr方法检测抑制gbtsa1和gbtsb1表达后植株和对照植株中sa合成以及信号基因ics1，npr1，pr1，pr2，pr5(这5个基因的登陆号见实施例7第一段)的表达后发现这些基因的表达水平在抑制gbtsa1和gbtsb1表达植株中均显著上调(见图6)。在将sa合成关键基因ics1分别与gbtsa1，gbtsb1共同抑制表达后可以恢复抑制gbtsa1，gbtsb1表达后植株坏死的表型(图7)，这进一步证明了抑制棉花中gbtsa1和gbtsb1表达后能显著激活sa合成及抗病信号路径，导致棉花免疫激活并使棉花更抗黄萎病。本发明的优点：目前植物中色氨酸合成路径参与植物抗病的机制并不明确，在棉花抗病中的作用更没有报道。本发明发现抑制棉花中gbtsa1和gbtsb1表达水平后通过显著增强sa合成和抗病信号路径来增强棉花对黄萎病菌的抗性。据申请人所知，这在其他物种中还没有报道。附图说明序列表seqidno:1是本发明克隆的gbtsa1基因的核苷酸序列(1-942bp)及其对应的氨基酸序列(1-942bp)，编码313个氨基酸残基。序列表seqidno:2是gbtsa1基因编码的蛋白质序列。序列表seqidno:3是本发明构建的病毒诱导的基因沉默载体gbtsa1vigs的核苷酸序列。序列表seqidno:4是是本发明克隆的gbtsb1基因的核苷酸序列(1-867bp)及其对应的氨基酸序列(1-867bp)，编码288个氨基酸残基。序列表seqidno:5是gbtsb1基因编码的蛋白质序列。序列表seqidno:6是本发明构建的本发明构建的病毒诱导的基因沉默载体gbtsb1vigs的核苷酸序列。图1：trv:gbtsa1病毒载体图谱，该载体骨架为trv:00，在细菌中的抗性为卡那霉素。图2：trv:gbtsb1病毒载体图谱，该载体骨架为trv:00，在细菌中的抗性为卡那霉素。图3：抑制gbtsa1，gbtsb1基因表达后的表型图。附图标记说明：图3中的a图和图3中的b图是trv:gbtsa1，trv:gbtsb1沉默植株整体以及局部显微观察，相比对照叶片出现明显的坏死斑。图3中的c图和图3中的d图为基因沉默效果的检测结果，与注射空质粒载体trv:00植株中cdna基因条带相比，注射trv:gbtsa1载体的后gbtsa1基因条带明显变弱。内参基因为棉花组成型表达基因ub7(genebank登录号：dq116441)。图4：gbtsa1，gbtsb1基因沉默后接菌图。附图标记说明：图4中的a图为gbtsa1基因沉默后接种16天的表型，可以看到对照材料(接种空载体)trv:00萎焉和黄化更加严重，而接种载体的trv:gbtsa1植株更加抗黄萎病。图4中的b图和图4中的c图为剖干图和恢复培养图，也可以看出对照材料(接种空载体)trv:00，比接种质粒载体的trv:gbtsa1材料维管束褐化更为严重，恢复培养时菌丝生长更快。图4中的d图为病指统计以及真菌生物量检测，也说明接种trv:gbtsa1质粒载体的植株更加抗病。gbtsb1基因沉默后植株坏死严重，故无法得到接种后表型图。图4中的e图和和图4中的f图为恢复培养和真菌生物量统计，也说明trv:gbtsb1材料比对照材料更加抗病。图5：trv:gbtsa1，trv:gbtsb1植株激素含量测定。附图标记说明：图5中的a图为水杨酸(sa)的含量检测，图5中的b图为吲哚乙酸(iaa)的含量检测，激素含量检测发现trv:gbtsa1，trv:gbtsb1植株中sa含量显著上升，而iaa含量显著降低。图6：trv:gbtsa1，trv:gbtsb1植株中sa合成和信号相关基因表达分析。附图标记说明：图6中的a图为基因eds1(基因登陆号见实施例7)的表达量检测，图6中的b图为基因ics的表达量检测，图6中的c图为基因npr1的表达量检测，图6中的d图为基因pr1的表达量检测，图6中的e图为基因pr2的表达量检测，图6中的f图为基因pr5的表达量检测(这5个基因的登陆号见实施例7第一段)。检测结果说明sa合成路径(eds1和ics)以及信号路径(npr1,pr1,pr2,pr5)相关基因在trv:gbtsa1，trv:gbtsb1沉默植株中被显著激活。图7：共沉默ics1可以恢复trv:gbtsa1，trv:gbtsb1植株坏死表型。附图标记说明：图7中的a和图7中的b图为共沉默ics1的表型图；图7中的c图,d图和e图为gbtsa1,gbtsb1以及gbics的沉默效果检测，图中trv:si代表(trv:gbtsa1&trv:ics),trv:bi代表(trv:gbtsb1&trv:ics)。具体实施方式实施例1gbtsa，gbtsb1基因的克隆a.rna的提取及cdna的获得rna提取的材料选自海岛棉“海7124”(中国农业科学院棉花研究所，国家棉花种质中期库)的根、茎和叶的混合样品，rna提取方法方法参考zhu等改良的异硫氰酸胍法(zhuetal.,2005)。rna完整性通过1.0％(w/v)琼脂糖胶(etbr)电泳检测，核酸浓度的测定采用thermer的nanodrop2000测定，只有rna260/280比值在1.9到2.1之间，且260/230比值大于2.0，说明rna质量很好。然后按常规方法合成cdna。b.gbtsa1，gbtsb1基因全长序列的获得以步骤a中的cdna样品为模板进行pcr扩增，扩增gbtsa1基因的引物为：gbtsa1-s:tcgaaaaagaacacagaaatgggt，gbtsa1-a:aggaagtacagatttcaaggattt；扩增gbtsb1基因的引物为：gbtsb1-s:atgtctgctctctctgagct，gbtsb1-a:tacctgcaaatgcttatttgct；pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。pcr产物经ta克隆反应连接至pgem-teasy载体(购自promega公司，美国)上。反应体系4℃过夜后转化大肠杆菌感受态细胞top10，10-12小时后挑取单克隆进行pcr阳性检测，将阳性克隆测序验证后确定其序列，其中gbtsa基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，该基因编码蛋白质的序列如seqidno：2所示；gbtsb1基因的核苷酸序列seqidno：4所示，该基因编码蛋白质序列如seqidno：5所示。实施例2：gbtsa，gbtsb1基因病毒载体的构建选取gbtsa1，gbtsb1全长序列的一部分进行vigs载体构建，设计正向引物带有kpni，反向引物带有bamhi酶切接头的引物序列，具体步骤如下所述：vigs-gbtsa1-s:cggggtaccaggtgcttgattcatgtggctcgga,vigs-gbtsa1-a:cgcggatcctcggtctgtcggcgtagttggtgt；以及vigs-gbtsb1-s:cggggtaccattactcgctaaacgcttgggca，vigs-gbtsb1-a:cgcggatccccatagcatttgaacctccacca(上述引物序列中下划线表示为酶切接头序列)，以cdna为模板，分别扩增得到如seqidno：3，seqidno：6所示的序列。将pcr产物以及trv:00质粒分别用kpni和bamhi(购自neb公司)进行双酶切。将酶切后的产物与酶切回收的trv:00质粒片段用t4dna连接酶(购自invitrogen公司，美国)连接，连接产物即为病毒沉默载体trv:gbtsa1,病毒沉默载体trv:gbtsb1(载体结构分别如图1和图2所示)。将上述两个载体进行热激转化，分别转入大肠杆菌top10(天根生物北京科技有限公司)中，37℃培养10-12h，挑取克隆作阳性检测。将检测后的阳性克隆提取质粒(按常规方法)转化农杆菌gv3101(天根生物北京科技有限公司)，将阳性菌液用20％甘油于-70℃下保存。实施例3：vigs介导的棉花植株转化将带有质粒的trv1，trv:00和trv:gbtsa1的农杆菌菌株在50μg/ml的卡那霉素(西格玛公司，美国)lb培养皿上活化。接种前一天，挑取一个克隆接种于10ml含有50μg/ml的lb培养液中。在28℃摇床上培养过夜，至菌液明显浑浊呈橘黄色，离心弃上清。用重悬液(10mmmgcl2，10mmmes，和200μm的乙酰丁香酮)重悬，调整浓度至od＝1.2-1.5左右，将trv1分别与trv:00，trv:gbtsa1等体积混合，然后将重悬液置于28℃摇床上摇1h。当棉花子叶平展后，将要进行vigs操作的棉花幼苗子叶背面用针头扎几个小孔，然后用2ml注射器将混合后的农杆菌菌液沿着小孔注射到棉花子叶中。注射后的棉花子呈浸水状，应尽量保证两片子叶充分注入农杆菌液。操作完成后用黑色塑料布将棉花植株盖住，避光培养24h。两周后取样检测基因表达水平变化以及观察表型。实施例4：trv:gbtsa1,trv:gbtsb1植株抑制基因表达水平效果检测取trv:gbtsa1植株幼嫩的叶片提取rna，rna的抽提用本申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室改良的异硫氰酸胍法(zhuetal.,2005)(请提供参考文献，如果后面的方法是改良的异硫氰酸胍法则不需要提供参考文献)。具体步骤为：cdna的合成是以2μg总rna为模版，与1μl500μg/mloligo-dt引物(promega公司，美国)，depc-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μlrtbuffer，1.25μl10mmdntp，1.75μldepc-water，1μlribonucleaseinhibitor(promega公司，美国)，和1μlsuperscriptⅲ反转录酶(invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后于70℃处理15min使superscriptⅲ反转录酶失活。每份cdna样品稀释至200μl后于-20℃下保存待用。以上述反转录合成的cdna为模板，用实施例2中的引物分别进行pcr扩增，以棉花基因ghub7(genbank登陆号：dq116441)作为内参对照进行相对定量分析，表达分析显示叶片中出现坏死斑的植株，发现gbtsa1和gbtsb1的表达显著降低，说明棉株中坏死斑的产生与gbtsa1和gbtsb1基因的表达量降低有关。实施例5：抑制棉花中gbtsa1和gbtsb1表达后植株抗性的鉴定对vigs处理后的棉花幼苗进行伤根接种黄萎病菌‘v991’(中国农业科学院植物保护研究所简桂良惠赠)。调整接种的黄萎病菌孢子浓度为105个/ml，接种时间为1min。接种后8天，开始统计棉花幼苗的黄萎病的发病情况，统计方法参照xu等(xuetal.,2012)报道的方法。结果表明在接种黄萎病菌10d后，空载体对照植株的叶片开始出现发黄、萎焉，而gbtsa1基因沉默后的植株发病明显较轻(见图4中的a图)。从植株发病情况以及病指统计结果来看，相比对照植株，gbtsa1基因沉默的植株抗病性增加。为了进一步验证接种黄萎病菌后的表型，取接种12天后转基因棉花植株子叶节以上同一部位的茎段，用刀片纵切，在体式显微镜(leicamzflⅲ，德国)下观察并照相。与对照相比的结果显示，gbtsa1基因沉默后的转基因棉花植株的维管组织中黄萎病菌菌丝的含量较少(图4中的c图)，这与其叶片黄萎病症状较轻相符合。同时取接种后15天的转基因棉花植株的茎段，将该茎段用常规“84消毒液”灭菌4min，然后用无菌蒸馏水漂洗3-4次进行消毒处理，然后在无菌条件下切去茎段的两端后再切成2-3mm的小茎段并插入常规pda培养基上，3次重复。将培养的茎段在25℃培养箱中培养4天后观察并拍照。从恢复培养结果中发现接种空载体的对照植株的茎段上均长出了黄萎病菌菌丝，而分别转gbtsa1和gbtsb1基因的且基因沉默植株的茎段上长出黄萎病菌的茎段较少(图4中的d图)，这与gbtsa1和gbtsb1基因沉默后植株抗病性增强的结果一致。实施例6：对trv:gbtsa1，trv:gbtsb1沉默植株激素含量测定经检测目标基因沉默后，取trv:gbtsa1，trv:gbtsb1沉默植株的叶片，每个样品进行3次重复取样(每个样品大约100mg)。样品用液氮充分研磨后加入750ul预冷的提取液(methanol/water/aceticacid，80:19:1，v/v/v，含有吲哚乙酸(iaa)的内标2h5-iaa10ng/ml，sa的内标naa100ng/ml)，于4℃黑暗条件下震荡16h。离心后取上清，用氮吹仪吹干后加300ul纯甲醇溶解，再通过直径13mm的尼龙膜过滤器(滤孔直径为0.22um)进行过滤。滤液通过hplc-ms/ms(1200llc-mssystem，varian)同时测量sa，iaa激素的含量。结果表明trv:gbtsa1，trv:gbtsb1沉默植株中sa的含量显著升高，而iaa的含量显著降低。实施例7：trv:gbtsa1，trv:gbtsb1沉默植株sa相关基因表达量的检测以实施案例4中的cdna为模板，选取sa合成和信号路径相关基因pr1(genebank登录号：xm016864191.1),pr2(genebank登录号：nm001327439.1),pr5(genebank登录号：xm016869118.1),ics(genebank登录号：xr001697413.1),npr1(genebank登录号：xm016873621.1),eds1(genebank登录号：km977668.1),以下列引物进行qrt-pcr检测。具体引物序列如下：pr1-rl-s:gactctgtccatcttggttgtgcta，pr1-rl-a:tttagtaaggtttttgaccgacgaa；pr2-rl-s:ccaccagcagcagaagttatcg，pr2-rl-a:ttcaaggtttgcactcggaaga；pr5-rl-s:gccgtgattcatacagttatcctca，pr5-rl-s:ttggctcttacttccgaccatct；ics1-rl-s:gtcttcagccacctaatggacccgc，ics1-rl-a:gctctggattcacctctagcacg；；npr1-rl-s:gcgaatcgttgctttcttcttca，npr1-rl-a:cacgtggtgctgttgttgttactg；eds1-rl-s:gcagcaacagctcctctacctcaa，eds1-rl-a:ggcagaccaagacgctacagataca；检测基因表达的qrt-pcr反应体系(总体积为20μl)：ssofastevogreensupermixwithlowrox10ul；模板10ul；引物0.5ul；pcr仪为abi7500，pcr反应程序：95℃1min，95℃15sec，60℃35sec，40循环。qpcr所用仪器为abiprism7000sequencedetectionsystemandsoftware(peappliedbiosystems,美国)，每个反应都设置3个重复。检测结果见图6，表明trv:gbtsa1，trv:gbtsb1沉默后显著激活sa合成和信号路径。实施例8：共沉默ics后恢复坏死表型构建ics1的病毒载体trv:ics，操作方法参照实施例2。将trv:ics1菌液分别与trv:gbtsa1以及trv:gbtsb1菌液等量混合，再参照实施例3的方法进行转化，14天后观察表型。提取叶片rna进行基因沉默效果检测，检测方法参照实施例4。基因沉默效果和基因的表达量见图7中的a图和图7中的b图，结果表明，当将ics1分别与gbtsa1以及gbtsb1基因共沉默后，可以恢复trv:gbtsa1,trv:gbtsb1单基因沉默叶片坏死的表型，这说明trv:gbtsa1,trv:gbtsb1基因坏死的表型是依赖于sa信号路径的。参考文献1.barthc,janderg(2006)arabidopsismyrosinasestgg1andtgg2haveredundantfunctioninglucosinolatebreakdownandinsectdefense.plantj46:549-562；2.bednarekp,-bednarekm,a,schneiderb,doubskyj,mansurovam,...,schulze-lefertp(2009)aglucosinolatemetabolismpathwayinlivingpl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