一种调控水稻理想株型的基因OsVAS1的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控水稻理想株型的基因osvas1。本发明采用候选基因筛选的方法，克隆到同时参与水稻生长素和乙烯合成途径基因osvas1，发现用crispr技术定点突变osvas1基因，可以改良水稻株型并增加产量，并证实了该基因的功能及应用途径。

背景技术：

水稻理想株型是根据生产实际的需要在上世纪80年代由国际水稻所提出，相关领域成果就不断产出，受到广泛关注。比如osipa1,osnpt1等(jiaoetal.,2010；miuraetal.,2010；wangetal.,2017)；理想株型主要包括茎的粗壮度，分蘖数，穗型等农艺性状。理想株型有助于水稻产量和水稻抗倒伏等性状的提升，对水稻粮食安全具有重要意义。

生长素是最早研究开发的激素之一，对植物的生长发育具有重要作用，近年来对生长素的研究越来越深入。生长素合成途径在拟南芥中研究较深，现已知生长素主要由色氨酸依赖途径中的ipa合成途径生成，即由taa酶催化色氨酸生成吲哚丙酮酸，再由yuc酶催化吲哚丙酮酸生成生长素(zhao,2001；chengetal.,2006；chengetal.,2007；mashiguchietal.,2011；wonetal.,2011；zhao,2012)。在2013年，zheng等在拟南芥中通过遗传筛选得到了一个能互补sav的突变体，命名为vas1，vas1同时参与生长素与乙烯的合称途径，直接证明了两种激素之间的紧密联系(zhengetal.,2013)。但是生长素研究在水稻中并不深入，尤其关于生长素与理想株型之间的关系的报道则更为少见。

本发明通过在水稻中分离筛选候选基因，分离并克隆了水稻中的osvas1基因，并利用crispr技术对该基因进行定点突变，后续再用超量表达等手段验证了该基因的功能，该基因突变之后，株型变化显著，产量提升明显，并且还未见报道，可以作为潜在的育种工具。

技术实现要素：

本发明的目的涉及一种调控水稻理想株型的基因osvas1。本发明的osvas1基因利用crispr技术定点突变以后能显著提高产量，减少分蘖数，茎杆强壮度等农艺性状。超量表达该基因则会显著增加籽粒大小，分蘖数增加，叶夹角增大等；其中，所述的含有osvas1基因的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示，序列长度为5835bp，它对应的第一个转录本氨基酸序列如seqidno：2所示，其对应的氨基酸序列为394个。它的第二个转录本氨基酸序列如seqidno：3所示,其对应的氨基酸序列为208个。

携带有本发明osvas1基因的超表达载体可通过使用ti质粒使用农杆菌介导进行dna转化，也可以通过微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

可使用包括本发明的osvas1基因的表达载体转化宿主,其中宿主可以是包括水稻在内的多种植物，培育理想株型植物新材料。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

附图说明

序列表seqidno:1是本发明分离克隆的包含有osvas11基因开放阅读框(openreadingframe)的核苷酸序列，序列长度为5835bp。

序列表seqidno:2是osvas1基因的第一个转录本的核苷酸序列(长度为1185bp)，也是该转录本的编码的氨基酸序列(1-1185bp)，编码394个氨基酸。

序列表seqidno:3是osvas1基因的第一个转录本编码的蛋白质的序列，编码394个蛋白质。

序列表seqidno:4是osvas1基因的第二个转录本的核苷酸序列(长度为627bp)，也是该转录本的编码的氨基酸序列(1-627bp)，编码208个氨基酸。

序列表seqidno:5是osvas1基因的第二个转录本编码的蛋白质的序列，编码208个蛋白质。

图1.crispr定点突变pcxun-cas9载体的图谱。附图标记说明：在ricecas9元件后的nosterminator之后的多克隆酶切位点引入sgrna可以达到基因编辑效应。本发明在kpni处引入。

图2.osvas1基因结构图以及定点突变靶位点位置。附图标记说明：图中上下两个图为该基因的两个不同的转录本。其中图2中的a图对应序列表序列表seqidno:2的转录本。图2中的b图对应序列表seqidno:3的转录本.红色箭头表示设计的crispr靶位点所在的位置。黑色实心部分为编码区外显子，白色空心部分为非编码区，实线部分为非编码内含子区。

图3.vcr-1和vcr-2突变体的植株表型。附图标记说明：图3中的a图表示vcr-1、vcr-2突变体与野生型zh11的整体植株表型对照；图3中的b图表示vcr突变体与野生型zh11的主茎的粗细对比；图3中的c图和d图分别表示株高和分蘖数的统计结果，n＝15；e,f表示vcr突变体与野生型zh11的的一次枝梗数对比和统计结果，n＝15。

图4.osvas1超量表达t0代的基因相对表达量。附图标记说明：纵坐标为相对倍数。

图5.osvas1超量表达阳性植株的表型。图5中的a有表示voe超表达家系与野生型zh11的整体植株表型对照；图5中的b图表示voe超表达与野生型水稻中花11(zh11)的主茎的粗细对比；图5中的c图和d图)分别表示株高和分蘖数的统计结果，n＝15。

图6.用于osvas1基因超量表达的载体1301u的图谱。

具体实施方式

实施例1

1、osvas1候选基因的确定以及该基因定点突变载体的构建和转化

申请人为了研究水稻中生长素的合成机制，将拟南芥中相关同源基因atvas1的氨基酸序列在水稻数据库ricegenomeannotationproject中做了同源性比对分析，发现loc_os01g08270的氨基酸序列与其同源性最高，达到66.5％。确定该基因为水稻中的osvas1基因。

随后我们利用crispr-p网站(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr2/crispr)设计该基因crispr定点突变的靶位点，将该基因序列或者id输入网站提示的位置即可得到候选靶位点序列，最终我们选择靶位点序列如下：agatgcaggaattgcttcgaggg，其中下划线部分为pam(protospaceradjacentmotif)序列，该靶位点位于seqidno:1序列的615bp-636bp，可以同时对该基因的两个转录本进行定点突变，见图2。crispr载体的构建使用报道的pcxun-cas9载体(载体结构见图1)，该载体已申请专利，申请号为2016106398543。该基因定点突变载体的构建以及转化水稻具体实施步骤如下：

1)pcxun-cas9载体(载体结构见图1)的构建

扩增水稻cas9基因，以克隆到ph-ubi-cas9-7的质粒(miaoetal.,2013)为模板，以cas9-f(5’-atggccccaaagaagaagcg-3’和cas9-r(5’-tcaatcgccgccgagttgtg-3’)为引物进行pcr扩增pcr扩增，获得了约4.1kb的cas9基因片段，将所获得的pcr产物克隆到pcxun载体上(chenetal.,2009)，将阳性克隆对应样品测序(北京擎科生物科技有限公司测序)，以验证目的pcr产物的正确性。

pcr过程如下：

cas9目的片段经凝胶电泳并挖胶回收(使用qiagen公司的回收柱)后用于载体pcxun-cas9的构建。

然后将质粒pcxun用xcmi酶酶切，形成t载体，反应体系如下：

37℃反应3个小时，然后挖胶、过柱、回收。

再将步骤1)中的cas9片段经t4连接酶16℃反应过夜连入xcmi酶酶切过的pcxun载体形成中间载体pcxun-cas9.

2)以携带u3启动子的质粒为模板，设计u3启动子前后接头引物(用kpni限制性内切酶消化载体，大写字母部分为载体末端序列，用于gibsonassembly一步法(gibsonetal.,2009)连接)，引物序列如下：

osu3-f:cccctttcgccaggggtaccgtaattcatccaggtctccaag，

osu3-r:tacgaattcgagctcggtaccgctgtgccgtacgacggtacg；

3)将设计的特异性靶位点序列通过重叠pcr方法引入u3启动子中，据此设计的osvas1靶序列sgrna引物，序列如下：

u3osvas1cr-f:agatgcaggaattgcttcgagttttagagctagaaatagcaagtta

其中下划线部分为设计的osvas1的定点突变靶位点序列，斜体序列部分为靶位点互补配对序列。

重叠pcr程序如下：

pcr1反应，反应体系如下：

同时我们进行pcr2反应，如下：

4)以pcr1和pcr2产物为模板，进行pcr3反应，如下：

挖胶并利用qiagen试剂盒回收pcr3产物，并用gibsonassembly一步法(gibsonetal.,2009)将纯化过的pcr3产物和kpni切过的载体pcxun-cas9连接，50℃反应一小时，取1μl电转(1800v)，并涂布在含卡那霉素(50μg/ml)抗性的lb培养基上。挑取单克隆菌落，抽提质粒并进行阳性检测，将质粒dna送测序公司测序核实。

将测序后证明序列正确的阳性质粒pcxun-cas9-sgrna(osvas1-cr)电转化到农杆菌(eha105)中，并侵染水稻愈伤组织。转化品种为水稻中花11(zh11，来自中国农业科学院作物科学研究所),具体转化步骤如下：

1)将水稻品种中花11的成熟胚去壳，用70％乙醇泡1min，0.15％升汞消毒20min，无菌水洗3～4次；将所得的外植体接种到诱导培养基上，于26℃暗培养诱导愈伤组织；

2)诱导培养35d后，取活力强、颗粒状的愈伤组织转入继代培养基进行继代培养；

3)取继代培养20d的愈伤组织的颗粒，接入预培养培养基上，于26℃下暗培养4d；

4)在预培养的第三天，用la(lb中加入1.5％琼脂)划线接种农杆菌菌株，28℃静止培养2d；之后，将农杆菌全部刮入悬浮培养基；于28℃，200r/m振荡培养0.5-1h；在分光光度计600nm波长光测定菌液浓度，调至od值＝1.0；

5)将预培养后的愈伤组织接入100ml锥形瓶(大约到40ml处)，加入调制好的农杆菌菌液，浸泡30min，期间摇动数次。配制悬浮培养基:(500μl乙酰丁香酮as(acetosringone)+5ml50％葡萄糖；

6)倒去菌液，将愈伤组织置于灭菌滤纸上吸干表面菌液(一定要吸干菌液，使愈伤组织的表面发白)，但不能直接用电吹风吹干)，接入共培养培养基(250μl乙酰丁香酮as+5ml50％葡萄糖)，暗培养3d，再转入250ml共培养培养基上进行共培养；

7)将共培养后的愈伤组织用无菌水先快速摇动清洗两次；然后加入无菌水浸泡10min，使愈伤组织内部的菌体游离出来；倒去洗液，再加入含400mg/l的羧苄青霉素(cn)无菌水浸泡15min；倒干洗液，将愈伤组织置于灭菌滤纸上吸干，接入筛选培养基；26℃暗培养。每3周继代一次，共继代两次。每转化一个质粒，需灭菌单蒸水1～2瓶，其中第一次筛选时，在300ml筛选培养基中加入500ul羧苄青霉素(cn)和300ul潮霉素(hn)；第二次继代筛选时，在筛选培养基中加入400ul羧苄青霉素(简称cn)和300ul潮霉素(简称hn)。

8)将筛选培养基培养的抗性愈伤组织接入预分化培养基，26℃暗培养一周。

9)将预分化培养一周的抗性愈伤组织转入分化培养基(50ml/瓶；改用三角瓶或平底试管做培养瓶)；25℃，2000lux光照培养，通过再生获得转基因植株。

10)待小植株3～5cm；转入生根培养基上促进生根。

11)将根系健壮的植株移入盆钵，凉棚过渡3～5d；然后移到自然条件下生长，直至成熟。

以上各种培养基的具体配方及其配制方法见说明书的末尾的附录。

2、osvas1定点突变体的鉴定

具体步骤如下：

1)取成熟的水稻叶片，并经ctab法提取dna样品；

设计检测转基因植物的阳性引物的序列如下：

cas9check-f:gcatgaagaggatcgaggag，

cas9check-r:gatctcttgctcggacttgg；

用该引物进行pcr扩增,条带大小在750bp的即为阳性。随后挑取鉴定为阳性的植株进行测序，设计测序引物的序列如下所述：

osvas1cr-seqf:tgaccctaacatcgtatccaac，

osvas1cr-seqr:ttgacccaaacagtaaaggaac；

挑取测序为纯合的两个家系继续在田间种植，命名为vcr-1,vcr-2(见图2)，其突变形式分别为：

参考序列:tgtgctcttttttcagatgcaggaattgcttcgagggaacaaggatgtga

野生型:ttttcagatgcaggaattgcttcgagggaacaaggat

vcr–1:ttttcagatgcaggaattgc--cgagggaacaaggat(2bp缺失)

野生型:cttttttcagatgcaggaattgcttcgagggaacaaggatgtgatgtcgct。

野生型:cttttttcagatgcaggaattgcttcgagggaacaaggatgtgatgtcgct

vcr–2:cttttttcagatgcaggaat------gtgatgtcgcttgcg(20bp缺失)

说明：上述引物序列的下划线部分为本发明设计的crispr靶位点序列。

2017年在湖北武汉的田间水稻自然生长发育整个阶段，申请人对突变体植株表型进行了考察，发现相比于野生型，突变体植株表现为理想株型所需要的农艺性状，具体表现为，分蘖数变少(见图3中的a图,d图)；株高略有增加(见图3中a图,c图)；主茎变粗(见图3中的b图)；一次枝梗数增加(见图3中的e图,f图)。本发明的突变体具体表型图见图3所示。说明本发明克隆的基因功能缺失之后，符合理想株型的型态建成，有助于为后续育种改良提供有益的遗传资源。

3、osvas1基因的功能鉴定

基于该基因定点突变以后的表型，接下来通过构建超量表达载体来进一步研究该基因功能。具体实施步骤如下：

根据使用的超量表达载体1301u(载体图谱见图6)，首先设计超表达载体osvas1的引物：

其中上述引物的下划线部分为kpni消化1301u产生的载体上的粘性末端重复序列，斜体部分为该基因转录区间上的序列。本发明取水稻品种中花11的水稻叶片立即存放于液氮中，按常规方法抽提水稻叶片的总rna，进行反转录。以反转录产物cdna为模板进行扩增，得到包含最长阅读框的osvas1全长序列。然后利用qiagen试剂盒纯化回收pcr产物和kpni消化酶切过的1301u载体，并用gibsonassembly一步法(gibsonetal.,2009)将这两者连接，电转然后挑单克隆，最后得到阳性质粒并转化水稻，后续的转化详细制备步骤参见本实施例1。

随后将得到的t0代植株，按常规方法提取t0代植株总dna并用gus引物进行阳性检测，gus引物序列如下：

gus-f:ccaggcagttttaacgatcagttcgc，

gus-r:gagtgaagatccctttcttgttacc；

抽提总rna并反转录来检测该基因表达量，设计rt引物如下：

vas1-rtf:gaattgctcatggaagcgatgtctcc

vas1-rtr:ctgtaccattccctcagtcacaagttctt

t0代植株相对表达量见图4所示；最终选取两个voe-2，voe-3，voe-4三个阳性家系进行后续的实验。通过对这两个家系在海南和武汉的连续表型考察，这两个家系植株相比于野生型主要表现为分蘖数增加(图5a,d)，茎杆变细(图5b)，植株变矮(图5a,c)。证实了该基因参与水稻各个时期的生长发育过程。

附录：本发明涉及的各种组培培养基配方

诱导培养基

继代培养基

预培养基

共培养培养基

悬浮培养基

筛选培养基

分化培养基

生根培养基

主要参考文献

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序列表

<110>华中农业大学

<120>一种调控水稻理想株型的基因osvas1

<141>2017-12-01

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5835

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(5835)

<400>1

gtctcatgcttatcctccaacttcgcggcgcaccctccgcaaacgtaagccaaaaagatc60

aggaaaagagacagaaaaatcggaataaaagagtgatagatagatagatagatactccgt120

agatactagatcagcagcgatttttttttcagtttttgttttttcatttcttcctctgtc180

ttgtttagatgttggggttggtgagcccttggggggaatcagttggtgactgactcgaga240

agttcagaggttgttgtctccgaattctttaaccccaacctctcctcttctcttctcttc300

tctcctcttcttccttatactgcttcttgggctcgccgctgcgctgttctttggtcttct360

tggatctctgaccctaacatcgtatccaacttctccagttcttgttcttggaggggtgag420

gaagaggaggaggaggaggtgagatgggtagcttcgggaggctggcgaggagggccgtgg480

agacggaagcgccggtcatggtcaaggtgatggagaagaagctccctgcctcgtcgaaat540

cgcatctttcccttctgatttctttggtcttgattgatgagttctatctctcttgtgcct600

tgtgctcttttttcagatgcaggaattgcttcgagggaacaaggatgtgatgtcgcttgc660

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tgttttcatgagagtaccaatgagtttgtgttgttgttggtacttggtcacaggcatttt780

gatgtttgcatttgattgggaagagtgttcgaaatggattagtgaaatgatcatttgtat840

tgttcctttactgtttgggtcaattgtctcagtaaactgttcacgttgtaaggtgaatca900

ggagagtttagtacatctgataacatattgtgctttgtataacacaactatttatcaagc960

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tatttcatacttaaatttaatgctacttatctcacataatgtcttggatgttgtgtagaa1680

accatgtctcatgcaagacatagtttcctcctctttcctcatttattcacttgccacatc1740

agttttcatcctatgtgacagcttatttaatgctatggacactatcctagtcattgggtt1800

gggaatagcctaatatcaggaatcacatgctatccttacaaaattttatcaacgagaaag1860

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tttgaatcgtaggattgagaaaacatagtaatagaaaaaacgtaggattttgataggaat1980

gtaagtgtaaaatagaggattacaaaacgcaggaaaaacacaggaatgaccgtttgattg2040

aaccgcaggaaaaacgcaggatttggatgagagagatagactcaaagaaaagttactaag2100

aggttgaagctcttgcttaatttcctccaaaatttctataggattgttcattccatagga2160

attttaaaggattggataggattcaatcctttgattcaaaggacttcataggaaattttc2220

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gctctgttgagagctataatagttcaatgctaccatgtaacagtgcagtagcacagttct2340

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gatttctcttactgcgataatattttattgaaaaactaataatatgaatggtaattatta2460

taaacatgttcgttgccttccctctattttcttcctgaaatttttagcatacattttgca2520

gctgcgcagagagaataagctaaccaagtcgtcaattatggttacctctggtgcaaatca2580

ggtaatgcacatgctttccagtttccacctgatttattacagctttgtcatcttattccg2640

gttttcctctgtgtattttgccttgtttagctagactataggatgccaatttgtttttct2700

tcttcagttctatgagatgctttcttacttttctgtatgactgcttcacctaaaccttgt2760

ttaccaactaggttagccaaataaaagtcaaataaagtgatgtcttctatcaaattttgg2820

caggcctttgtaaatgtggtcctcaccctttgtgatgctggggatgcagttgtcatgttt2880

gcaccatattacttcaattcctacatgtcattccagatgacaggagttactgacatatta2940

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atattacttaaagcaattgtaaagacgaggcactacgaaagaatgaactacacatggaca3660

tgatcaccttaagtagtagtttaaaaggacagttcaccataagcagttgagcaactgtgc3720

ttgacttcttgaagttgagtcctggatgacgccctctctgatagattaaataaataggac3780

ttcaagaatgtggtatctctttcaaaaagtatctgcaaaccacccgccagtaagggtttg3840

tcaaatgtagttatcttcacatgctcagcttattcaagtagggaaaatcttccatttctt3900

ctcaacactagaattggacacatggaacaactcgttttcttttgaaggtcccatttcagt3960

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