GGC2基因的分离克隆及其在水稻改良中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种ggc2基因的分离克隆、功能验证及在水稻改良中的应用。本发明通过基因工程技术改变ggc2基因的表达丰度，可以改良水稻的粒型、株型。

背景技术：

随着人口不断增加、耕地面积的减少和环境的恶化，粮食安全受到严重挑战。株高、分蘖、穗型和粒重长期以来一直是作物遗传改良的重要目标性状。水稻育种改良的首要目标是提高产量。水稻产量由粒重、每穗颖花数和分蘖数所影响，粒重又可以进一步分解为粒长、粒宽和粒厚(xingandzhang,geneticandmolecularbasesofriceyield.annurevplantbiol2010,61:421-442)。随着人民生活水平的提高，对稻米的品质要求越来越高，并且越来越注重对环境的保护，因此育种的目标在针对产量的同时，还注重品质的改良、抗性的筛选、和氮磷利用的效率等。谷粒大小也是稻米的重要品质性状，消费者普遍喜好细长的粒型的籼稻品种。在我国，认为优质的籼稻品种的稻米长宽比不能低于2.8。因此种子大小是粒重的决定因素，直接影响水稻的产量以及品质。

水稻的产量同时与株型密切相关，以理想株型为改良目标的育种模式在农业生产上受到高度的重视。水稻的株型包含株高、分蘖、穗型、根形态、器官的大小和角度等组成因素(wangandli,molecularbasisofplantarchitecture.annurevplantbiol,2008,59:253-279)。株高与水稻产量、光合作用以及与抗倒伏性密切相关。发掘改良水稻株高的基因资源，实现对茎杆的控制，可以提高水稻增产的潜力。上个世纪以降低株高为目标的第一次“绿色革命”培育的半矮秆品种，极大的增加了全球农作物的产量。2002年水稻绿色革命基因sd1被成功克隆，其编码的是一种赤霉素氧化酶，控制赤霉素的合成(sasakietal.,greenrevolution:amutantgibberellins-synthesisgeneinrice.nature,2002,416:701-702)。穗形态是产量的重要组成元件，包括一次枝梗，二次枝梗，穗长以及穗密度。鉴于穗型在农业生产上的重要意义，科学家已经发现了大量的控制穗型发育的基因，并且一些基因已经在育种实践中得到了应用(zhangandyuan,molecularcontrolofgrassinflorescencedevelopment.annurevplantbiol,2014,65:553-578)。

在水稻中存在着一类具有c末端的非典型的g蛋白γ亚基，控制着水稻的株高、穗型以及粒型。其中gs3最早被克隆，主要负调控种子的大小，在育种中广泛应用，对水稻产量有重要的影响(fanetal.,gs3,amajorqtlforgrainlengthandweightandminorqtlforgrainwidthandthicknessinrice,encodesaputative

transmembraneprotein.theorapplgenet,2006,112:1164-1171)。第二个被克隆的基因dep1，控制穗形态以及株高，它的突变可以显著增加穗粒数，降低株高，增加产量(huangetal.,naturalvariationatthedep1locusenhancesgrainyieldinrice.natgenet,2009,41:494-497)。因此水稻g蛋白γ亚基对水稻的遗传改良具有重要的利用价值。

水稻还含有其他编码g蛋白γ亚基的基因，与gs3以及dep1的同源程度非常低，它们的生物学功能依然是未知的。本发明通过植物基因工程的手段，在水稻中研究g蛋白γ亚基的功能，挖掘在农业生产上可以用于改良水稻株型、粒型以及穗型的新的g蛋白γ亚基，为水稻理想株型的分子设计育种挖掘基因资源。

技术实现要素：

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个ggc2基因，旨在通过对水稻ggc2基因的研究和应用，在水稻种子大小、株高、分蘖数和穗型等目标性状上改良水稻的产量、株型和品质，为水稻遗传育种提供新的基因资源。本发明提供了ggc2基因及其编码的蛋白质，对该基因进行功能及在水稻产量、株型和品质改良中的应用进行了生物功能验证。本发明分离的基因编码一个g蛋白γ亚基，其生物学功能为调控水稻的种子大小、株高、分蘖数和穗型。

本发明分离和应用一个编码g蛋白γ亚基的ggc2基因的dna片段，并对该片段的作用机理进行阐述。ggc2基因具有如seqidno：1所示的核苷酸序列，其编码蛋白质如seqidno：3所示，也包括与seqidno：2所示的编码区的核苷酸序列有90％以上同源性的基因序列，也包括基因的插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物，或者其功能相当于seqidno：1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的ggc2基因的dna片段作探针，从cdna和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用pcr技术，从栽培稻、野生稻或者禾本科作物的基因组、mrna和cdna中扩增得到本发明的基因或同源基因。同样也可以采取化学合成的方法获得本发明的基因或同源基因。

采用以上技术，可以分离得到包含ggc2基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得增加种子大小，减少分蘖数的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可与其它调控元件，如组成型启动子、诱导型启动子和器官特异性启动子融合构建基因表达载体。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。突变该基因可以降低株高，改变穗型以及使种子变小；可以通过转基因技术、反义rna、rnai、锌指核酸酶(zinc-fingernucleases，zfn)、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,talen)和crispr(clusteredregularlyinterspersedshortpalindromicrepeats)/cas9等技术对其操控以调控植物的种子大小、株高和穗型。

携带有本发明ggc2基因的表达载体可通过使用ti质粒，植物病毒载体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach(1998)methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2^ndedition))。

实现本发明的具体技术方案如下：

1、根据水稻基因组注释的结果，从水稻中分离出包含ggc2基因完整编码区段的dna片段，其核苷酸序列如seqidno：3所示；具体的分离方法在实施例1中有详细描述。

2、将上述包含有ggc2基因完整编码区段的dna片段连接到pcambia1301s载体上，构建得到ggc2的超量表达载体，申请人将该表达载体命名为35s:ggc2oe。具体方法在实施例2中有详细描述。

3、设计ggc2的crispr突变靶点，构建ggc2的crispr突变载体。申请人将该载体命名为pyl-cas9-grna-ggc2；具体方法在实施例3中有详细描述。

3、利用优化过的农杆菌介导的转基因方法(linandzhang,optimisingthetissuecultureconditionsforhighefficiencytransformationofindicarice.plantcellrep,2005,23:540-548)将表达载体35s:ggc2oe以及crispr敲除载体pyl-cas9-grna-ggc2导入水稻受体中花11，获得转化植株。具体方法在实施例4中有详细描述。

4、借助pcr的方法分析鉴定阳性转基因植株。在t0代鉴定35s:ggc2oe转基因植株的基因型，表达量以及表型，进行共分离检测，并对相关表型进行统计分析。具体方法在实施例5中有详细描述。在t0代鉴定pyl-cas9-grna-ggc2转基因植株的靶位点突变情况，并对相关表型进行统计分析；具体方法在实施例6中有详细描述

与现有技术相比，本发明的优点如下：

本发明描述了分离克隆包含有ggc2基因完整编码区段的dna片段以及验证ggc2基因功能的方法。本发明发现ggc2基因可以控制水稻的种子大小、株高、分蘖数和穗型，将其超量表达可以增加种子大小，减少分蘖数，将ggc2基因敲除之可以降低株高，改变穗型并使种子变小。本发明可以为水稻的产量、株型和品质遗传改良提供一种新颖方法。

附图说明

序列表seqidno:1是本发明分离克隆的包含有ggc2基因的基因组序列。序列长度为3133bp.

序列表seqidno:2是ggc2基因的编码区(即cds)。该基因编码335个氨基酸。

序列表seqidno:3是ggc2基因的编码的蛋白质序列。编码335个氨基酸的蛋白质序列。

序列表seqidno:4是表达载体osu3-o1-grna-polyt的序列。序列长度为603bp。

序列表seqidno:5是表达载体osu6a-o2-grna-polyt的序列。序列长度为629bp。

序列表seqidno:6是表达载体osu3-o1-grna-polyt的序列。序列长度为16419bp。

图1：本发明ggc2克隆以及功能验证的技术路线。

图2：是本发明构建的表达载体35s:ggc2oe的构建过程示意图。附图标记说明：

图2中的a图：插入表达载体35s:ggc2oe的包含有ggc2基因编码区的dna片段示意图。

图2中的b图：用于构建表达载体35s:ggc2oe的空载体pcambia1301s的结构示意图。

图3：本发明构建的表达载体35s:ggc2oe的结构示意图。本发明将图2中的a图所示的片段通过saci和sali双酶切插入图2中的b图所示的载体pcambia1301s的saci和sali酶切位点中间，形成转化用的表达载体35s:ggc2oe。

图4：crispr载体pyl-cas9-grna-ggc2构建过程示意图。附图标记说明：

图4中的a图：ggc2基因的结构以及crispr靶点o1以及o2序列位置示意图。

图4中的b图：将靶点o1以及o2分别通过pcr的方法插入到pylsgrna-osu3以及pylsgrna-osu6a中，获得osu3-o1-grna-polyt以及osu6a-o2-grna-polyt片段的过程。

图4中的c图：本发明构建的表达载体pyl-cas9-grna-ggc2的结构示意图。本发明将图4b获得的2个grna片段通过bsai酶切位点与pylcrispr/cas9-mt载体相连接。

图5：35s:ggc2oe转基因植株t0代表达量检测以及粒长数据。

图6：pyl-cas9-grna-ggc2载体转基因植株ggc2^kot0代突变位点检测。附图标记说明：

图6中的a图：ggc2^ko-7以及ggc2^ko-26测序显示的峰图。

图6中的b图：ggc2^ko-7以及ggc2^ko-26突变位点序列分析。

图7：野生型中花11植株(wt)与35s:ggc2oe以及ggc2^ko转基因植株的表型比较。附图标记说明：

图7中的a图：抽穗期的野生型中花11(wt)与35s:ggc2oe以及ggc2^ko转基因植株株高形态的比较。

图7中的b图：野生型中花11(wt)与35s:ggc2oe以及ggc2^ko转基因植株穗型的比较。

图7中的c图：野生型中花11(wt)与35s:ggc2oe以及ggc2^ko转基因植株种子形态的比较。

具体实施方式

根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆包含有ggc2基因完整编码区段的dna片段

本发明采用水稻0.5mm长的幼穗的rna经过反转录得到的cdna为模板，利用ggc2基因(该基因的基因组序列如seqidno:1所示)的特异引物，通过pcr的方法分离克隆ggc2基因的编码区即cds序列(序列见seqidno：2)，其蛋白质序列如seqidno:3所示。

具体的操作步骤如下：

(1)提取水稻幼穗rna

抽提水稻品种中花11(或称zh11，来自中国农业科学院作物科学研究所)植株幼穗分化期0.5mm长的幼穗的rna，rna抽提用的试剂购采用invitrogen公司生产的trizol抽提试剂盒(具体操作步骤按照试剂盒提供的说明书操作)。

(2)反转录合成cdna第一链

步骤如下：

①取抽提的总rna3μg，加入dnasei1μl,10×dnaseibuffer1μl，加depc(焦碳酸二乙酯，rna酶的强烈抑制剂，工作浓度为0.01％)处理过的水到10μl，混匀后室温放置15min以去除残留的基因组dna；

②加入0.2medta1μl，并于65℃水浴中孵育10min以去除dnasei的活性

③加入oligo(dt)15引物1μl，并于65℃水浴中孵育10min以破坏rna的二级结构，然后冰上放置2min；

④加入5×firststrandbuffer4μl，0.1mdtt(巯基乙醇)2μl，10mmdntpmixture1μl，反转录酶1μl，混匀后置于42℃水浴锅内温浴1.5h；

⑤反应结束后将反转录产物置于85℃干浴10min以灭活反转录酶；

⑥向反转录产物中加入80μl水，混匀后-20℃保存反应最终产物。反应中用到的试剂全部购自invitrogen公司。

(3)扩增ggc2基因的编码区的cdna，其序列如seqidno:3所示。

为了扩增ggc2基因编码区的cdna，本发明设计了如下引物：

ggc2oef(正向引物)：5'-gagctccggtggataagttgggttgag-3'(下划线的序列为saci识别位点)；

ggc2oer(反向引物)：5'-gtcgaccatactgtagtttaacgatctact-3'(下划线的序列为sali识别位点)；

该引物对可以扩增出ggc2基因的起始密码子上游21bp到终止密码子下游24bp之间的蛋白质编码区段，具体序列如下：

cggtggataagttgggttgagatgggggaggcgccgaggcccaagtcgccgccgaggtacccggacctgtgcggccggcggcggctgcagctggagatgcagatcctcaaccgggaggtcggcttcctcgagcaagagctacagggacttgaacggattcagccggtctcgaggtgttgcaaagatgtcaacgaatttgttggtgcaaagtcggatccgcttataccaataaacaaaaggaaacacagatcttgcagcctctatcggtggatcagatcgaaattgtgcaactgcttgttatgcctctgctgttggtgccggtgcctcccaaagcccaagaaaccgagctgcttcagttgttcttgctgctcctgctgcgacacatcgtgctgtagaccgagctgcggctgcctcaaggccccttcttcgtgctgctgcaaatccaactgcagctgctgcagcagcgattgctgcacctgcagccttcccagctgcggctgcacaggctgcggccactgccgaccgttgtgtggcggcggcggcggctgctgtccgcccagcgactgctgctccagctgcaagtgctcgtgctcgtcctgcacgcggtgctgtagcagctgcgccggcggctgcaagccgagctgcagcggctgcggcacggggtgctcgtcctgcggcggcggctgctgccccaagtgctcgtcctgcgcggcgccgtgcgtcggctgcctggctctgctccggcggtggctgagctgccggtcgtcgtgctgcaaggggcagccgtcctgctgcaagtgccagtcgtcgtgctgcgagggggagccttcctgctgctgctgctgcggcggcgggaagggatcgtcggcgtgctgctgcggcaggccttgctgcctcggaggcgcgacgccggcgccgtcgtgccccgagtgctcctgcggctgctcgtgctcctgcccgaggtgcaaagatgggtgcagccgcccgtcgtgtggcaatccgtgctgtgccggcggatgcttatgctgaagtagatcgttaaactacagtatg

上述片段中的下划线的序列是指扩增的utr片段，是不编码蛋白的，由于构建的载体是含有这些序列的就写上了。下游的非编码区是24个碱基

以步骤(2)反转录而来的cdna为模板，用引物ggc2oef和ggc2oer进行pcr扩增。pcr反应总体积为50μl，包含cdna模板2μl，2×gcibuffer25μl，10mmdntp5μl，10mm引物ggc2oef和ggc2oer各1μl，extaq酶1μl,加去离子水至50μl(所用到的2×gcibuffer、dntp、rtaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。

pcr反应条件如下：①94℃4min；②94℃30s；③58℃30s；④72℃1min；⑤从步骤②－步骤④循环33次；⑥72℃7min；⑦25℃保存。pcr产物在1％(质量/体积)的tbe琼脂糖凝胶上电泳检测，回收长度为1065bp(1053bp的目标dna区段加上引物上附加的两个限制性酶切位点12bp)的dna片段。进行ta克隆的连接以及测序验证，挑选正确的ta克隆作下一步实验。

实施例2：构建ggc2基因的蛋白质编码区的超量表达载体

用saci和sali双酶切质粒ta-ggc2(saci和sali限制性内切酶购买自宝生物工程大连有限公司，具体用法与用量参考该公司相应产品的说明书，质粒ta-ggc2来自实施例1，如图2中的a图所示)，回收包含ggc2的1065bp的dna片段，然后与经过saci和sali双酶切的载体质粒pcambia1301s[该载体是公开报道的一种商业质粒:zhouetal.,over-expressionofaspartateaminotransferasegenesinriceresultedinalterednitrogenmetabolismandincreasedaminoacidcontentinseeds.theorapplgenet,2009,118:1381-1390；其基本骨架是澳大利亚cambia实验室(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)的pcambia1301，通过加入35s启动子实现对转化基因的表达调控，其结构如图2中的b图所示]利用t4dna连接酶(购自promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)进行连接。连接产物通过热激化转的方法转入大肠杆菌tran-t1(购自北京全式金生物技术有限公司)中，加400μllb培养基复苏45min，涂于含50mg/l的卡那霉素的la培养基平板上，37℃温箱培养14-16h(la与lb配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过saci和sali双酶切筛选阳性克隆，并将所得的表达载体命名为35s:ggc2oe，其结构如图2所示。

实施例3：构建ggc2基因突变载体pyl-cas9-grna-ggc2

针对水稻ggc2基因设计基于crispr/cas9的sgrna序列，位于ggc2基因的第2个外显子，其核苷酸序列为o1：5’aacggattcagccggtctcg3’；o2：5’gggacttgaacggattcagc3’(见图4中的a图)。将sgrnao1以及o2通过重叠延伸pcr的方法分别插入到载体pylsgrna-osu3与pylsgrna-osu6a中，获得pcr片段osu3-o1-grna-polyt(序列如seqidno:4所示)以及osu6a-o2-grna-polyt(序列如seqidno:5所示)。将以上pcr片段通过bsaⅰ酶切连接至pylcrispr/cas-mh(序列如seqidno:6所示)载体中。pylsgrna-osu3、pylsgrna-osu6a以及pylcrispr/cas-mh载体由华南农业大学刘耀光教授惠赠，参考文献(含载体构建)已公开发表：maetal.,arobustcrispr/cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.molecularplant,2015,8:1274–1284)。具体操作步骤如下所述：

(1)osu3-o1-grna-polyt以及osu6a-o2-grna-polyt片段的构建

第一轮pcr以pylsgrna-osu3质粒(华南农业大学刘耀光教授惠赠)为模板，用引物b1’和o1r扩增osu3启动子与ggc2基因20bp的o1靶序列；同样以pyl-u3-grna为模板，用引物o1f和b2扩增ggc2基因o1靶序列与grna-polyt；第二轮pcr是以第一轮pcr产物为模板，用引物b1’和b2扩增得到osu3-o1-grna-polyt片段。

采用同样的方法获得osu6a-o2-grna-polyt的片段。第一轮pcr以pylsgrna-osu6a质粒(由华南农业大学刘耀光教授惠赠)为模板，用引物b2’和o2r扩增osu6a启动子与ggc2基因20bp的o2靶序列；同样以pyl-u6a-grna为模板，用引物o2f和bl扩增ggc2基因o2靶序列与grna-polyt；第二轮pcr是以第一轮pcr产物为模板，用引物b2’和bl扩增得到osu6a-o2-grna-polyt片段(见图4中的b图所示)。

(2)ggc2的crispr突变载体pyl-cas9-grna-ggc2的构建

利用限制性内切酶bsaⅰ，通过一边酶切一边连连的方法，将osu3-o1-grna-polyt和osu6-o2-grna-polyt的pcr片段连接到pylcrispr/cas9-mt载体(由华南农业大学刘耀光教授惠赠)中的bsaⅰ位点处中(参见图4中的c图)。

其中步骤(1)中使用的引物序列如下:

b1’:ttcagaggtctctctcgcactggaatcggcagcaaagg-3(下划线的序列为bsaⅰ酶切位点)

b2:agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc-3(下划线的序列为bsaⅰ酶切位点)

b2’:ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg-3(下划线的序列为bsaⅰ酶切位点)

bl:agcgtgggtctcgaccgggtccatccactccaagctc-3(下划线的序列为bsaⅰ酶切位点)

o1f:aacggattcagccggtctcggttttagagctagaaatagca(下划线的序列为靶点o1)

o1r:cgagaccggctgaatccgtttgccacggatcatctgcaca(下划线的序列为靶点o1)

o2f:gggacttgaacggattcagcgttttagagctagaaatagca(下划线的序列为靶点o2)

o2r:gctgaatccgttcaagtccccggcagccaagccagcacccg(下划线的序列为靶点o2)

实施例4：转基因水稻的获得

将表达载体35s:ggc2oe(来自实施例2)，以及敲除载体pyl-cas9-grna-ggc2(来自实施例3)通过农杆菌eha105介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11(又称zh11，品种资源来自中国农业科学院作物科学研究所)的愈伤组织，经过预培养、侵染培养、共培养和筛选培养得到具有对潮霉素(用于筛选阳性的转基因愈伤的一种抗生素，购自丹麦的罗氏制药有限公司)抗性的愈伤组织，再经过分化培养、生根培养，炼苗并移栽至大田，得到转基因植株。本发明的农杆菌遗传转化的方法和所用的试剂及配方是根据hiei等人的报道优化而来(hieietal.,efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantj,1994,6:271-282；linandzhang,optimisingthetissuecultureconditionsforhighefficiencytransformationofindicarice.plantcellrep,2005,23:540-548)。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄基腺嘌呤)；kt(kinetin，激动素)；naa(napthaleneaceticacid，萘乙酸)；iaa(indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-d(2,4-dichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸)；as(acetosringone，乙酰丁香酮)；ch(caseinenzymatichydrolysate，水解酪蛋白)；hn(hygromycinb，潮霉素)；dmso(dimethylsulfoxide，二甲基亚砜)；n6max(n6大量成分溶液)；n6min(n6小量成分溶液)；msmax(ms大量成分溶液)；msmin(ms小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)n6max母液[10倍浓缩液(10x)]

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)n6min母液[100倍浓缩液(100x)]

室温下溶解并定容至1000ml。

3)fe2-edta贮存液(100×)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(feso4·7h2o)2.78g，在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(na2edta·2h2o)3.73g。将它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2h，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100×)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)msmax母液(10×)

室温下溶解并定容至1000ml。

6)msmin母液(100×)

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-d贮存液(1mg/ml)

2,4-d100mg.

1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-ba贮存液(1mg/ml)

6-ba100mg.

1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)naa贮存液(1mg/ml)

naa100mg.

1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)iaa贮存液(1mg/ml)

iaa100mg.

1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)as贮存液

as0.392g

dmso10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1n氢氧化钾贮存液

氢氧化钾(koh)5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)kt贮存液(1mg/ml)

kt100mg.

1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlas贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlas贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节ph值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μlas贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节ph值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)la培养基(lb培养基不含琼脂粉)

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化的步骤如下：

(1)愈伤组织的诱导

1)将成熟的水稻种子(中花11)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞(hgcl2)15min

2)灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

(2)愈伤组织的继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

(3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于预培养基上黑暗下培养4d，培养温度为26±1℃。

(4)农杆菌培养

1)在带有卡那霉素的la培养基上预培养含构建好载体的农杆菌eha1052d，培养温度为28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，与28℃摇床上培养2-3h。

(5)农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤组织转移至灭菌好的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至od6000.8-1.0；

3)将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30min；

4)转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上并吸干；然后放置在共培养培养基上培养2d，培养温度为19-20℃。

(6)愈伤组织洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤组织至看不见农杆菌；

2)将洗涤后的愈伤组织浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30min；

3)将步骤2)处理的愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上吸干；

4)将步骤3)的愈伤组织转移至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)。

(7)分化

1)将抗性愈伤组织转移至预分化培养基上并在黑暗处培养5-7d；

2)将步骤1)培养的愈伤组织转移至预分化培养基上，在光照培养室(16小时光照，光照强度按水稻遗传转化或组织培养常规光照/8小时黑暗)下培养，培养温度为26℃，培养5－7周。

(8)生根

1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

2)然后将其转移至生根培养基中于光照培养室(16小时光照，光照强度按水稻遗传转化或组织培养常规光照/8小时黑暗)下培养2-3周，培养温度为26℃，得到转基因植株。

(9)移栽

洗掉转基因植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载至大田。

实施例5：ggc2基因转基因水稻的鉴定

(1)ggc2基因超量表达转基因植株的表达量检测

1)抽提来自35s:ggc2oe的转化植株分蘖期叶片的rna，反转录合成cdna。方法和过程同实施例1。

2)对得到的反转录产物用2对引物进行rt-pcr的检测(引物组合为ggc2qrt-f1和ggc2qrt-r1，以及ggc2qrt-f2和ggc2qrt-r2)，并且用ubiquitin基因(loc_os03g13170)的扩增结果作为内参(引物组合为ubiqrt-f和ubiqrt-r)，序列如下所示：

ggc2qrt-f1:5'-gtgcaactgcttgttatgcc-3'

ggc2qrt-r1:5'-gctcggtctacagcacgat-3'

ggc2qrt-f2:5'-ggacttgaacggattcagc-3'

ggc2qrt-r2:5'-gatccgactttgcaccaac-3'

ubiqrt-f:5'-aaccagctgaggcccaaga-3'

ubiqrt-r:5'-acgattgatttaaccagtccatga-3'

pcr反应总体积为20μl，包含cdna模板1ul，2×gcⅰbuffer10μl，10mmdntp2μl，10mm引物各0.2μl，rtaq酶0.2μl,加去离子水至20μl(所用到的2×gcⅰbuffer、dntp、rtaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。pcr反应条件如下：①94℃4min；②94℃40s；③58℃30s；④72℃30s；⑤从步骤②至步骤④循环28次；⑥72℃7min；⑦4℃保存。pcr产物在2％(质量/体积)的tbe琼脂糖凝胶上电泳检测。

rt-pcr检测结果表明，表达载体35s:ggc2oe转基因阳性植株相对于阴性植株而言，其表达量明显上升。对种子的长度进行考察表明，表达量上升的单株种子变长，表型与表达量呈共分离，结果如图4所示。

(2)ggc2基因cripsr突变的转基因植株检测

选取靶点上下游127-198bp序列，设计引物，进行pcr扩增，对扩增片段进行测序，通过峰图判断靶位点是否发生突变。鉴定ggc2基因突变效果的引物序列如下(片段大小为352bp)：

ggc2e2f:5'-gcattgctcgtgttctttactg-3'

gggce2r:5'-ctgacattcagagtagctgtg-3'

用引物ggc2e2f对ggc2基因cripsr突变的t0转基因单株的pcr产物进行测序。测序结果表明纯合突变的转基因植株ggc2^ko-7在ggc2基因中插入了1bp；ggc2^ko-26在ggc2基因中缺失了4bp，造成移码突变，导致ggc2基因的翻译提前终止。测序峰图以及突变位点分析见图5。

ggc2^ko-7突变体插入了1bp的ggc2的编码序列如下(带方框的碱基代表插入的1bp，下划线代表sgrna位点)：

atgggggaggcgccgaggcccaagtcgccgccgaggtacccggacctgtgcggccggcggcggctgcagctggagatgcagatcctcaaccgggaggtcggcttcctcgagcaagagctacagggacttgaacggattcagccggtctcgaggtgttgcaaagatgtcaacgaatttgttggtgcaaagtcggatccgcttataccaataaacaaaaggaaacacagatcttgcagcctctatcggtggatcagatcgaaattgtgcaactgcttgttatgcctctgctgttggtgccggtgcctcccaaagcccaagaaaccgagctgcttcagttgttcttgctgctcctgctgcgacacatcgtgctgtagaccgagctgcggctgcctcaaggccccttcttcgtgctgctgcaaatccaactgcagctgctgcagcagcgattgctgcacctgcagccttcccagctgcggctgcacaggctgcggccactgccgaccgttgtgtggcggcggcggcggctgctgtccgcccagcgactgctgctccagctgcaagtgctcgtgctcgtcctgcacgcggtgctgtagcagctgcgccggcggctgcaagccgagctgcagcggctgcggcacggggtgctcgtcctgcggcggcggctgctgccccaagtgctcgtcctgcgcggcgccgtgcgtcggctgcctggctctgctccggcggtggctgagctgccggtcgtcgtgctgcaaggggcagccgtcctgctgcaagtgccagtcgtcgtgctgcgagggggagccttcctgctgctgctgctgcggcggcgggaagggatcgtcggcgtgctgctgcggcaggccttgctgcctcggaggcgcgacgccggcgccgtcgtgccccgagtgctcctgcggctgctcgtgctcctgcccgaggtgcaaagatgggtgcagccgcccgtcgtgtggcaatccgtgctgtgccggcggatgcttatgctga

突变后推导的氨基酸序列如下：

mgeaprpkspprypdlcgrrrlqlemqilnrevgfleqelqgleriqaglevlqrcqricwckvgsaytnkqketqilqplsvdqieivqllvmplllvpvppkaqetellqlflllllrhivlggc2^ko-26突变体ggc2缺失了4bp的编码序列如下(带方框的碱基代表缺失的4bp，下划线代表sgrna位点)：

atgggggaggcgccgaggcccaagtcgccgccgaggtacccggacctgtgcggccggcggcggctgcagctggagatgcagatcctcaaccgggaggtcggcttcctcgagcaagagctacagggacttgaacggagccggtctcgaggtgttgcaaagatgtcaacgaatttgttggtgcaaagtcggatccgcttataccaataaacaaaaggaaacacagatcttgcagcctctatcggtggatcagatcgaaattgtgcaactgcttgttatgcctctgctgttggtgccggtgcctcccaaagcccaagaaaccgagctgcttcagttgttcttgctgctcctgctgcgacacatcgtgctgtagaccgagctgcggctgcctcaaggccccttcttcgtgctgctgcaaatccaactgcagctgctgcagcagcgattgctgcacctgcagccttcccagctgcggctgcacaggctgcggccactgccgaccgttgtgtggcggcggcggcggctgctgtccgcccagcgactgctgctccagctgcaagtgctcgtgctcgtcctgcacgcggtgctgtagcagctgcgccggcggctgcaagccgagctgcagcggctgcggcacggggtgctcgtcctgcggcggcggctgctgccccaagtgctcgtcctgcgcggcgccgtgcgtcggctgcctggctctgctccggcggtggctgagctgccggtcgtcgtgctgcaaggggcagccgtcctgctgcaagtgccagtcgtcgtgctgcgagggggagccttcctgctgctgctgctgcggcggcgggaagggatcgtcggcgtgctgctgcggcaggccttgctgcctcggaggcgcgacgccggcgccgtcgtgccccgagtgctcctgcggctgctcgtgctcctgcccgaggtgcaaagatgggtgcagccgcccgtcgtgtggcaatccgtgctgtgccggcggatgcttatgctga

突变后推导的氨基酸序列如下：

mgeaprpkspprypdlcgrrrlqlemqilnrevgfleqelqglersrgvakmstnllvqsrirlyq

(对突变后推导的氨基酸序列的说明：蛋白质的编码是从核酸的atg起始密码子开始到tga/taa/tag这3个中的一个终止子停止。没有突变的蛋白质序列从atg一直可以编码到tga，但是如果在中间插入了一个碱基或者缺失了4个碱基，那么它的读码框就发生了移码，以此类推，从atg开始，到3的整数倍的终止子tga/taa/tag就停止了，所以编码的蛋白就不一样了，从而丧失了原有蛋白的功能。这里上述2个核苷酸序列和氨基酸序列是指的利用crispr构建的突变体的序列，相对于在原始序列中插入了一个碱基或者缺失了4个碱基。上述公开的序列只是描述突变体的状况。)

本发明成功构建获得ggc2基因单碱基插入以及4碱基缺失的cripsr纯合突变的转基因植株。

实施例6：转基因水稻的表型鉴定

为了进行表型分析，申请人将2个独立转化而来的35s:ggc2oe的t0植株及ggc2^ko-7，ggc2^ko-26t0的种子以经过常规浸种、催芽后播种于秧田，20d以后移栽至大田获得t1代转基因植株。种植密度即株行距为15厘米×24厘米，种植地点为中国湖北省武汉市洪山区华中农业大学的试验田，在一个有生物基因安全防护设施条件下按常规的水稻种植方法进行田间管理。

利用pcr的方法检测gus基因进行35s:ggc2oe阳性鉴定，并且分析pcr检测结果与表型的对应关系。结果表明35s:ggc2oe在t1代分离出来的所有gus阳性单株相对于阴性单株而言，都表现为种子变大，分蘖减少，表明35s:ggc2oe的转基因事件同本发明所指的种子变大以及分蘖减少的表型是共分离的。对ggc2^ko-7，ggc2^ko-26这两个纯合突变体的t1表型与野生型“中花11”进行比较，这2个纯合突变体都显著降低了株高，穗长以及种子大小。由此说明ggc2基因是正调控种子大小的基因，它的突变会使种子变小，降低株高以及穗长(图6)。考察和记录t1代相关植株的表型变化和数据，包括株高、分蘖数、每穗粒数和穗长、粒长以及粒宽，并以每个家系分离出来的gus阴性单株为对照，分别进行统计学分析，结果见表1。

表1ggc2超量表达以及cripsr突变的转基因植株t1代的表型统计值

表1的说明：

表1中的(+)和(-)分别表示转基因阳性和阴性单株。利用t测验进行统计学分析，^a,b,c分别表示p<0.05、0.01和0.001的显著水平。

ggc2^ko是与中花11即zh11相比较的结果。

序列表

<110>华中农业大学

<120>ggc2基因的分离克隆及其在水稻改良中的应用

<141>2017-08-16

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3133

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(3133)

<400>1

agggtggttgtcttgcgtctccggtggataagttgggttgagatgggggaggcgccgagg60

cccaagtcgccgccgaggtacccggacctgtgcggccggcggcggctgcagctggagatg120

cagatcctcaaccgggaggtcggcttcctcgaggtgacctcacttcacttccccgtcatg180

tcacctcgctttctttcacagtgatgaagaaaagcgtgcatttttttttgttcttcctat240

ggagtggagagacagagagagagagagagagagagagaggaaatctccggggaaaaaagt300

tgatgtggagagctcatcggtttggggtttcgcgacggaagcgaggcgagagctcgctct360

gtcgcgacaaccgatgcgcgacaggctcccatgttgtactagcagtacgtgcggctgtca420

tggctgcccctactgccgtcttcttgcagagagaacaagaacaatgggcagccatgaacc480

aatgccattttacttctggagtagtagtagtagtagagttctactgcaatatgtattttt540

tccccctgcaacatcaggcatttcagaattgcaaagcaagtgcagtataggagtagtact600

tccgaagtctcctcattacattgcatcatgcgtaaagtctgatgaattctggaactatag660

gggtatgggggagtacctgcaattgataattaaaaataaaaagaactctactttcagatt720

tctgcttctcttgagcgtgacatcacctggcaatggcaatcagtaggtagagacgctgct780

gctgctgctgcgcattgctcgtgttctttactgcttccattcatggcacatggagcagga840

ctgtgtataggtctgtggaagccatgtgcatgtgcctcggcctgactgggggctcccttt900

ttgcagcaagagctacagggacttgaacggattcagccggtctcgaggtgttgcaaagag960

tatgcgccctatcctctcctttctgctttcctcattagcctcgcttctctctgcaaatct1020

tgtcgccggcagtgctggtgtttcgctcggatgggcaactagcaagttcttgttcattct1080

agtgatctagtctcagcctttcaggctcaaatgccatttaatcacagctactctgaatgt1140

cagtagtgtttgagtcattagtgttgttgtttctttgatttgtagtggtcttattgataa1200

acaagacaattctttttccgaggagagcactaaaaattagaattttttccattgtgttct1260

ttttatttgctgaatcctgacacattcctcaaacttattttttttttgaaaaaaaagaaa1320

gtggcccacatgaattgcgacatttactatacttttcgattttcttgaatgccaataata1380

atctctgctagtaacttctgacctggtggtccaacagtcaacatgtgaactgttcatgca1440

tgacctacatttcaattttgctccttttggaactgtactatgtaacgttcaaatgccatt1500

gtcgattacaaagatactaatgctatattatcacatttggcagtgtcaacgaatttgttg1560

gtgcaaagtcggatccgcttataccaatgtatgaatatattgatttatgttttgcatttc1620

agagtttcttttttcaaagtttgctgatcagtgttctccctgtgccttatttattccaga1680

aacaaaaggaaacacagatcttgcagcctctatcggtggatcaggtcccttactcttccc1740

ttgtccatgcttttgggtgtacggataaaaacattctaaaagctttgctgtttaaaccga1800

gggaatatattgttgtttataatttgagagtttattaaattcaagccattagtgaataag1860

taggtaacactcatagggcaaagtatgacaatatgctggtttcagtttgttgctgaataa1920

actagttcaacagtcaacactgttaagactcatactcctacttgtttctgttcctgtcaa1980

atgcccgaactgaatttcaccttattagcccattttatcaaatgctcactcaatttgtag2040

aacctcaatacaccaacaaagtgatttgtcagaaatgtcacactttaatactacatgata2100

actcggagtactgccttcttttgatgaaaaaagtcaggatatctgacatcagttatggtg2160

gcatcaaagcaattttcgcagtctttttgtggagccaatactgttcccagaactgcagcg2220

ctatttacacgacaaataccgccttttttttcgttctgaacttcttgcaaatgacatgct2280

gtttcaacgctcccttggaaagactaaaagatcttaaacctgttgttttttatcagatcg2340

aaattgtgcaactgcttgttatgcctctgctgttggtgccggtgcctcccaaagcccaag2400

aaaccgagctgcttcagttgttcttgctgctcctgctgcgacacatcgtgctgtagaccg2460

agctgcggctgcctcaaggccccttcttcgtgctgctgcaaatccaactgcagctgctgc2520

agcagcgattgctgcacctgcagccttcccagctgcggctgcacaggctgcggccactgc2580

cgaccgttgtgtggcggcggcggcggctgctgtccgcccagcgactgctgctccagctgc2640

aagtgctcgtgctcgtcctgcacgcggtgctgtagcagctgcgccggcggctgcaagccg2700

agctgcagcggctgcggcacggggtgctcgtcctgcggcggcggctgctgccccaagtgc2760

tcgtcctgcgcggcgccgtgcgtcggctgcctggctctgctccggcggtggctgagctgc2820

cggtcgtcgtgctgcaaggggcagccgtcctgctgcaagtgccagtcgtcgtgctgcgag2880

ggggagccttcctgctgctgctgctgcggcggcgggaagggatcgtcggcgtgctgctgc2940

ggcaggccttgctgcctcggaggcgcgacgccggcgccgtcgtgccccgagtgctcctgc3000

ggctgctcgtgctcctgcccgaggtgcaaagatgggtgcagccgcccgtcgtgtggcaat3060

ccgtgctgtgccggcggatgcttatgctgaagtagatcgttaaactacagtatggttttg3120

tactattcttttt3133

<210>2

<211>1008

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<220>

<221>cds

<222>(1)..(1008)

<400>2

atgggggaggcgccgaggcccaagtcgccgccgaggtacccggacctg48

metglyglualaproargprolysserproproargtyrproaspleu

151015

tgcggccggcggcggctgcagctggagatgcagatcctcaaccgggag96

cysglyargargargleuglnleuglumetglnileleuasnargglu

202530

gtcggcttcctcgagcaagagctacagggacttgaacggattcagccg144

valglypheleugluglngluleuglnglyleugluargileglnpro

354045

gtctcgaggtgttgcaaagatgtcaacgaatttgttggtgcaaagtcg192

valserargcyscyslysaspvalasngluphevalglyalalysser

505560

gatccgcttataccaataaacaaaaggaaacacagatcttgcagcctc240

aspproleuileproileasnlysarglyshisargsercysserleu

65707580

tatcggtggatcagatcgaaattgtgcaactgcttgttatgcctctgc288

tyrargtrpileargserlysleucysasncysleuleucysleucys

859095

tgttggtgccggtgcctcccaaagcccaagaaaccgagctgcttcagt336

cystrpcysargcysleuprolysprolyslysprosercyspheser

100105110

tgttcttgctgctcctgctgcgacacatcgtgctgtagaccgagctgc384

cyssercyscyssercyscysaspthrsercyscysargprosercys

115120125

ggctgcctcaaggccccttcttcgtgctgctgcaaatccaactgcagc432

glycysleulysalaprosersercyscyscyslysserasncysser

130135140

tgctgcagcagcgattgctgcacctgcagccttcccagctgcggctgc480

cyscysserseraspcyscysthrcysserleuprosercysglycys

145150155160

acaggctgcggccactgccgaccgttgtgtggcggcggcggcggctgc528

thrglycysglyhiscysargproleucysglyglyglyglyglycys

165170175

tgtccgcccagcgactgctgctccagctgcaagtgctcgtgctcgtcc576

cysproproseraspcyscyssersercyslyscyssercysserser

180185190

tgcacgcggtgctgtagcagctgcgccggcggctgcaagccgagctgc624

cysthrargcyscyssersercysalaglyglycyslysprosercys

195200205

agcggctgcggcacggggtgctcgtcctgcggcggcggctgctgcccc672

serglycysglythrglycyssersercysglyglyglycyscyspro

210215220

aagtgctcgtcctgcgcggcgccgtgcgtcggctgcctggctctgctc720

lyscyssersercysalaalaprocysvalglycysleualaleuleu

225230235240

cggcggtggctgagctgccggtcgtcgtgctgcaaggggcagccgtcc768

argargtrpleusercysargsersercyscyslysglyglnproser

245250255

tgctgcaagtgccagtcgtcgtgctgcgagggggagccttcctgctgc816

cyscyslyscysglnsersercyscysgluglygluprosercyscys

260265270

tgctgctgcggcggcgggaagggatcgtcggcgtgctgctgcggcagg864

cyscyscysglyglyglylysglyserseralacyscyscysglyarg

275280285

ccttgctgcctcggaggcgcgacgccggcgccgtcgtgccccgagtgc912

procyscysleuglyglyalathrproalaprosercysproglucys

290295300

tcctgcggctgctcgtgctcctgcccgaggtgcaaagatgggtgcagc960

sercysglycyssercyssercysproargcyslysaspglycysser

305310315320

cgcccgtcgtgtggcaatccgtgctgtgccggcggatgcttatgctga1008

argprosercysglyasnprocyscysalaglyglycysleucys

325330335

<210>3

<211>335

<212>prt

<213>水稻(oryzasativa)

<400>3

metglyglualaproargprolysserproproargtyrproaspleu

151015

cysglyargargargleuglnleuglumetglnileleuasnargglu

202530

valglypheleugluglngluleuglnglyleugluargileglnpro

354045

valserargcyscyslysaspvalasngluphevalglyalalysser

505560

aspproleuileproileasnlysarglyshisargsercysserleu

65707580

tyrargtrpileargserlysleucysasncysleuleucysleucys

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275280285

procyscysleuglyglyalathrproalaprosercysproglucys

290295300

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305310315320

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325330335

<210>4

<211>603

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<220>

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<400>4

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gct603

<210>5

<211>629

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<213>水稻(oryzasativa)

<220>

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<400>5

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