本发明涉及心肌保护方法技术领域，具体为一种体外培养诱导的调节型巨噬细胞用于心肌保护的方法。
背景技术：
目前心肌保护措施往往局限于对炎症损伤的干预，缺少对远期纤维化的干预，而心肌损伤后纤维化也是影响患者预后的重要因素之一，为此发明了一种体外培养诱导的调节型巨噬细胞用于心肌保护的方法用于解决上述弊端，调节型巨噬细胞有别称为m2b型巨噬细胞。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种体外培养诱导的调节型巨噬细胞用于心肌保护的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种体外培养诱导的调节型巨噬细胞用于心肌保护的方法，该方法包括以下步骤：
s1：提取骨髓来源巨噬细胞，培养诱导调节型巨噬细胞，所有操作均在无菌情况下进行，具体操作如下：
一、骨髓穿刺取患者自体骨髓，体外重悬至rpmi-1640培养基中，200目滤网过滤，500g离心5min，弃上清，红细胞裂解液裂解红细胞，重悬细胞至bmm培养基；
二、细胞置于37℃、50ml/lco2培养箱，每2-3天换液(每次换液需加新鲜m-csf)，7天成为成熟单核-巨噬细胞(m0)；
三、诱导成熟的m0如下刺激48h：鸡卵清蛋白(ova)-lgg免疫复合物(15μg/mlova和150μg/ml抗ova-lgg，37℃孵育30min)+lps(50ng/ml)，即诱导为成熟调节型巨噬细胞；
s2：制备巨噬细胞悬液：调节型巨噬细胞使用前使用胰酶消化重悬至生理盐水中，调整浓度为1×107个/ml，总量为1×106个/kg；
s3：细胞移植，用于体外循环下心脏手术，在心脏停跳时，随心肌保护液一起，灌注至冠状动脉，用于急性冠脉综合症的患者，行经皮冠脉支架植入术时，支架植入后经导管注射至冠状动脉。
优选的，经上述条件诱导的调节型巨噬细胞，可经上述方法用于心脏手术及急性冠脉综合症的患者。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：调节型巨噬细胞首次被提出用于心肌保护，调节型巨噬细胞作为新型心肌保护方法，兼顾提高心肌保护近期和远期效果，提高患者生活质量，进一步可为多种器官的缺血再灌注损伤和器官纤维化的治疗提供借鉴经验，需要本治疗的患者，骨髓穿刺取自体骨髓，经体外培养及诱导，培养出调节型巨噬细胞，移植至患者心肌，因其近远期的心肌保护效果，达到改善心功能、减少术后并发症、降低远期心脏纤维化的作用。
附图说明
图1为本发明用调节型巨噬细胞用于人体心肌保护实验时的流程结构示意图；
图2为本发明用调节型巨噬细胞用于动物心肌保护实验时的流程结构示意图；
图3为本发明用于动物实验时减轻心肌损伤(降低肌钙蛋白i)示意图；
图4为本发明用于动物实验时减轻心肌损伤(减小梗死面积)示意图；
图5为本发明用于动物实验时减轻心肌损伤(减少心肌细胞凋亡)示意图；
图6为本发明用于动物实验时减轻心肌缺血再灌注损伤后的心脏纤维化结构示意图；
图7为本发明用于动物实验时改善心肌缺血再灌注损伤后的心脏收缩功能结构示意图。
图中：图3为细胞治疗可降低心肌缺血再灌注损伤后的血清肌钙蛋白i(肌钙蛋白i为心肌损伤标志物)、图4为细胞治疗可减少心肌缺血再灌注损伤后的梗死面积(深色区域：未缺血区域；浅色区域：缺血未梗死区域；淡浅色区域：梗死区域)、图5为细胞治疗可减少心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡(深色区域：所有细胞核；浅色区域：凋亡细胞)、图6为细胞治疗可减轻心肌缺血再灌注损伤后的心脏纤维化(深色区域：心脏中的胶原纤维)、图7为为m型心脏超声。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-7，本发明提供一种技术方案：一种体外培养诱导的调节型巨噬细胞用于心肌保护的方法，包含以下步骤：
s1：提取骨髓来源巨噬细胞，培养诱导调节型巨噬细胞，所有操作均在无菌情况下进行，具体操作如下：
一、骨髓穿刺取患者自体骨髓，体外重悬至rpmi-1640培养基中，200目滤网过滤，500g离心5min，弃上清，红细胞裂解液裂解红细胞，重悬细胞至bmm培养基；
二、细胞置于37℃、50ml/lco2培养箱，每2-3天换液(每次换液需加新鲜m-csf)，7天成为成熟单核-巨噬细胞(m0)；
三、诱导成熟的m0如下刺激48h：鸡卵清蛋白(ova)-lgg免疫复合物(15μg/mlova和150μg/ml抗ova-lgg，37℃孵育30min)+lps(50ng/ml)，即诱导为成熟调节型巨噬细胞；
s2：制备巨噬细胞悬液：调节型巨噬细胞使用前使用胰酶消化重悬至生理盐水中，调整浓度为1×107个/ml，总量为1×106个/kg；
s3：细胞移植，用于体外循环下心脏手术，在心脏停跳时，随心肌保护液一起，灌注至冠状动脉，用于急性冠脉综合症的患者，行经皮冠脉支架植入术时，支架植入后经导管注射至冠状动脉。
进一步地，经上述条件诱导的调节型巨噬细胞，可经上述方法用于心脏手术及急性冠脉综合症的患者。
经充分的动物实验，结果证明该细胞治疗可有效减轻急性心肌缺血再灌注损伤，减轻远期心肌纤维化，改善心功能。流程示意图如图1。
具体作用为：一、建立小鼠急性缺血再灌注模型(结扎前降支30min后再灌注2h)，心肌缺血时经心外膜注射该细胞，发现可明显减轻其缺血再灌注损伤，包括肌钙蛋白i(图3)、梗死面积(图4)、心肌细胞凋亡(图5)；二、建立大鼠慢性心肌缺血再灌注模型(结扎前降支45min后再灌注2周)，心肌缺血时经心外膜注射该细胞,发现2周后其心肌纤维化明显减轻(图6)，心功能明显改善(图7)。因此：假手术组，ck：模型未经治疗组，mt：模型+细胞治疗组。
故我们证实该细胞对心肌缺血再灌注损伤，包括急性及慢性均具有保护作用。可进一步用于临床中，提高心脏手术后心肌保护效果，提高患者生活质量，是一个兼顾近、远期影响的心肌保护措施。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。