本发明涉及鲍鱼血细胞处理技术领域，具体涉及一种鲍鱼血细胞处理方法。
背景技术：
鲍鱼由于营养丰富，经济价值高，成为我国重要的海水养殖品种。目前，在生物实验领域，并没有一种完全针对鲍鱼血细胞的统一处理方式。人们通常采用各种不同的方式来处理鲍鱼的血细胞。在不加抗凝保护剂的情况下，鲍鱼血细胞一旦离体，几分钟内即大量凝集。即便加入某些抗凝保护剂的鲍鱼血细胞也会在短时间内大量死亡。这样不仅要求实验在短时间内就要完成，还会导致实验结果受系统误差影响较大、实验成本增加，实验结果不准确等问题。因此快速处理血细胞，确保在一定时间内鲍鱼血细胞不凝集在实验中十分重要。
目前，用于流式细胞仪检测的贝类(鲍鱼)血液，并没有一套完整或正规的处理装置，人们一般将收集到的血液不经过滤处理就直接进行流式细胞仪检测。结果表明，没有经过处理的血液含有较多杂质，呈现出来的图像是一个比较混乱、杂乱无章的散点图。另外，未处理细胞群容易造成检测仪堵塞，需要花很长的时间对检测仪进行清洗(10-40min)，才能继续进行测样。这样不仅耽误检测的进程，也无形间造成测试费用升高(200元/h)。所以在鲍鱼血细胞处理过程中采用合适的血液过滤器也十分必要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供鲍鱼血细胞处理方法，通过采用合适的血液抗凝保护剂和血液过滤器，能够有效的延长血细胞的凝集时间，快速过滤血液中的杂质，改善血液的纯度，减少实验误差，使实验结果更加准确。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鲍鱼血细胞处理方法，其特征在于，所述处理方法包括如下步骤：
(1)首先在2ml离心管中加入1ml抗凝保护剂；
(2)然后用解剖刀划开鲍鱼腹足部血窦，将鲍鱼倾斜20-30°放在冰上以便血液更易流出；
(3)待血液流出，用无菌注射器抽1ml血直接注入到加入抗凝保护剂后的离心管中；
(4)用一种用于流式细胞仪检测的血液过滤器过滤步骤(3)中液体到新的2ml离心管中；
(5)再经18℃，3000rpm离心10min，去掉上清；
(6)最后用1ml滤菌海水重新悬浮经过步骤(5)处理的血细胞制成鲍血淋巴悬液。
上述鲍鱼血细胞处理方法中，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.45～2.55g、edta0.9～1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mmpbs100ml。
优选地，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.5g、edta1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mmpbs100ml。
上述鲍鱼血细胞处理方法中，所述抗凝保护剂的制备方法为：
(1)将0.1mmpbs缓冲液倒入烧杯中，再向烧杯中加入固体氯化钠粉末搅拌3-5分钟，直到氯化钠全部溶解，然后再加入1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液a；
(2)将混合溶液a放入38-40℃水浴锅中加热，再缓慢加入edta，边加入边搅拌，直到edta完全溶解得混合溶液b；
(3)将混合溶液b转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌0.5-1h，使各组分充分溶解到pbs缓冲液中；
(4)超净工作台开启紫外杀菌功能30-35min，然后在超净工作台上将混合溶液b先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，最终得到鲍鱼血细胞抗凝保护剂。
优选地，上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法中，所述步骤(2)中水浴锅加热温度为40℃。
优选地，上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法中，所述步骤(3)中磁力搅拌器搅拌时间为0.5h。
上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂可在4℃或室温条件下，保存于灭菌蓝盖瓶中备用。
另外，所述血液过滤器一种血液过滤器，包括固定台、竖杆、过滤装置和置物装置，置物装置放置于过滤装置的下方，过滤装置通过压圈杆安装在竖杆上，压圈杆通过高度调节钮安装在竖杆上，竖杆安装在固定台上，过滤装置包括上压圈和下压圈，上压圈和下压圈均和压圈杆连接。所述上压圈与下压圈之间设置有筛绢。利用筛绢过滤掉血液中的杂质。
其中，所述上压圈上设置有四个压扣，四个压扣均布在所述上压圈的外围。四个压扣能够牢固的将上压圈扣压在下压圈上，同时能够扣住上压圈与下压圈之间的筛绢。
进一步地，所述上压圈上设置有格口网，所述格口网具有四个方形网格。利用格口网将筛绢在空间上分为四个部分。
更进一步地，所述置物装置包括置物盒和离心管，所述离心管放置在置物盒中。
优选地，所述置物盒内设置有圆柱状凹槽，所述圆柱状凹槽中放置有冰块。用冰块维持过滤血液所需的低温环境。
前述的血液过滤器中，所述圆柱状凹槽中设置有两个隔离片，两个隔离片垂直交叉设置。通过垂直交叉设置的两个隔离片，将圆柱状凹槽空间上分成四个小槽，四个小槽与格口网的四个方形网格一一对应，每个小槽中放置一个离心管，从而便于标记样品，不会造成混淆。
前述的血液过滤器中，所述压扣的材质为塑料。
前述的血液过滤器中，所述上压圈和下压圈的材质均为不锈钢。
前述的血液过滤器中，所述固定台为菱形铁制固定台。菱形铁制固定台能够保证本发明的稳固性，不会因位于竖杆一侧的置物装置而倾倒。
本发明的优点：
经过上述处理方法处理后的鲍鱼血细胞，由于加入抗凝保护剂，血细胞取出后可在较长时间内不聚集成团，依旧保持细胞的完整性和独立性，而且经过血液过滤器过滤后，血液中杂质大大减少，所以通过此处理方法处理后的血细胞在后续实验中可得到成本更低，数据更准确的实验结果。
附图说明
图1是血液过滤器结构示意图；
图2是置物装置结构示意图。
附图标记：1-固定台，2-竖杆，3-过滤装置，4-置物装置，5-压圈杆，6-上压圈，7-下压圈，8-压扣，9-置物盒，10-离心管，11-凹槽，12-隔离片，13-格口网，14-高度调节钮。
图3是鲍鱼血细胞离体1.5h后在各抗凝保护剂中的凝集情况(无抗凝保护剂组为对照组)；
图4是鲍鱼血细胞离体3h后在各抗凝保护剂中的凝集情况；
图5是鲍鱼血细胞离体4h后在各抗凝保护剂中的凝集情况；
图6是鲍鱼血细胞离体5h后在各抗凝保护剂中的凝集情况；
图3-6中，箭头所指为细胞凝集现象。
具体实施方式
下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1
一种血液过滤器，如图1、2所示，包括固定台1、竖杆2、过滤装置3和置物装置4，所述置物装置4放置于过滤装置3的下方，所述过滤装置3通过压圈杆5安装在竖杆2上，压圈杆5通过高度调节钮14安装在竖杆2上，竖杆2安装在固定台1上，所述过滤装置3包括上压圈6和下压圈7，所述上压圈6和下压圈7均和竖杆2连接。上压圈6与下压圈7之间设置有筛绢。格口网13通过筛绢对血液进行过滤。
进一步的，为了便于更换设置在上压圈6与下压圈7之间的筛绢，上压圈6上设置有四个压扣8，四个压扣8均布在所述上压圈6的外围。四个压扣8能够牢固的将上压圈6扣压在下压圈7上，同时能够扣住上压圈6与下压圈7之间的筛绢。
进一步的，上压圈6上设置有格口网13，格口网13具有四个方形网格。利用格口网13将筛绢分为四个部分。
具体的，置物装置4包括置物盒9和离心管10，离心管10放置在置物盒9中。离心管10用于盛装过滤后的血液。
进一步的，置物盒9内设置有圆柱状凹槽11，所述圆柱状凹槽11中放置有冰块。用冰块维持过滤后血液所需的低温环境。
进一步的，圆柱状凹槽11中设置有两个隔离片12，两个隔离片12垂直交叉设置。通过垂直交叉设置的两个隔离片12，将圆柱状凹槽11拆分成四个小槽，四个小槽与格口网13的四个方形网格一一对应，每个小槽中放置一个离心管10，从而便于标记样品，不会造成混淆。
具体的，压扣8的材质为塑料。上压圈6和下压圈7的材质均为不锈钢。固定台1为菱形铁制固定台。菱形铁制固定台能够保证本实用新型的稳固性，不会因位于竖杆2一侧的置物装置4而倾倒。
当筛绢置于上压圈6与下压圈7之间时，筛绢被格口网13分为四个部分，用去掉针头的注射器或者移液枪吸取血液，调节高度调节钮14，使其正好对准置物盒9(其中放冰)的四个离心管10，对准其中一部分筛绢往下注射，液体通过筛绢进入正对下方置物盒9中的离心管10；每一部分筛绢用一次，当用完圈内的筛绢时，打开压扣8，换一个崭新的筛绢。通过本血液过滤器过滤的血液，能够过滤掉血液中的杂质，提高了血液的纯度，使其经过流式细胞仪检测后，能够得到规则有序、聚集成簇的细胞散点图。
实施例2
一种鲍鱼血细胞处理方法，所述处理方法包括如下步骤：
(1)首先在2ml离心管中加入1ml抗凝保护剂；
(2)然后用解剖刀划开鲍鱼腹足部血窦，将鲍鱼倾斜20-30°放在冰上以便血液更易流出；
(3)待血液流出，用无菌注射器抽1ml血直接注入到加入抗凝保护剂后的离心管中；
(4)采用实施例1中的血液过滤器过滤步骤(3)中的液体到新的2ml离心管中；
(5)再经18℃，3000rpm离心10min，去掉上清；
(6)最后用1ml滤菌海水重新悬浮经过步骤(5)处理的血细胞制成鲍血淋巴悬液。
其中，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.5g、edta1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mmpbs100ml。
上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法具体为：
(1)取100ml0.1mmpbs缓冲液倒入烧杯中，再向烧杯中加入2.5g固体氯化钠粉末搅拌3分钟，直到氯化钠全部溶解，然后再加入0.23g1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液a；
(2)然后将混合溶液a放入40℃水浴锅中加热，再缓慢加入edta1g，边加入边搅拌，直到edta完全溶解得混合溶液b；
(3)将混合溶液b转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌0.5h，使各组分充分溶解到pbs缓冲液中；
(4)超净工作台开启紫外杀菌功能30min，然后在超净工作台上将混合溶液b先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，然后得到的鲍鱼血细胞抗凝保护剂。
实施例3
一种鲍鱼血细胞处理方法，所述处理方法包括如下步骤：
(1)首先在2ml离心管中加入1ml抗凝保护剂；
(2)然后用解剖刀划开鲍鱼腹足部血窦，将鲍鱼倾斜20-30°放在冰上以便血液更易流出；
(3)待血液流出，用无菌注射器抽1ml血直接注入到加入抗凝保护剂后的离心管中；
(4)采用实施例1中的血液过滤器过滤步骤(3)中的液体到新的2ml离心管中；
(5)再经18℃，3000rpm离心10min，去掉上清；
(6)最后用1ml滤菌海水重新悬浮经过步骤(5)处理的血细胞制成鲍血淋巴悬液。
所述抗凝保护剂，由以下成分组成：氯化钠2.55g、edta1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.24g和0.1mmpbs100ml。
上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法具体为：
(1)取100ml0.1mmpbs缓冲液倒入烧杯中，再向烧杯中加入2.55g固体氯化钠粉末搅拌4分钟，直到氯化钠全部溶解，然后，加入0.24g1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液a；
(2)然后将混合溶液a放入39℃水浴锅中加热，再缓慢加入1.1gedta，边加入边搅拌，直到edta完全溶解得混合溶液b；
(3)将混合溶液b转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌45min，使各组分充分溶解到pbs缓冲液中；
(4)超净工作台开启紫外杀菌功能32min，然后在超净工作台上将混合溶液b先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，然后得到的鲍鱼血细胞抗凝保护剂。
实施例4
一种鲍鱼血细胞处理方法，所述处理方法包括如下步骤：
(1)首先在2ml离心管中加入1ml抗凝保护剂；
(2)然后用解剖刀划开鲍鱼腹足部血窦，将鲍鱼倾斜20-30°放在冰上以便血液更易流出；
(3)待血液流出，用无菌注射器抽1ml血直接注入到加入抗凝保护剂后的离心管中；
(4)采用实施例1中的血液过滤器过滤步骤(3)中的液体到新的2ml离心管中；
(5)再经18℃，3000rpm离心10min，去掉上清；
(6)最后用1ml滤菌海水重新悬浮经过步骤(5)处理的血细胞制成鲍血淋巴悬液。
所述抗凝保护剂，由以下成分组成：氯化钠2.45g、edta0.9g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22g和0.1mmpbs100ml。
上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法具体为：
(1)取100ml0.1mmpbs缓冲液倒入烧杯中，再向烧杯中加入2.45g固体氯化钠粉末搅拌5分钟，直到氯化钠全部溶解，然后，加入0.22g1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液a；
(2)将混合溶液a放入38℃水浴锅中加热，再缓慢加入0.9gedta，边加入边搅拌，直到edta完全溶解得混合溶液b；
(3)将混合溶液b转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌1h，使各组分充分溶解到pbs缓冲液中；
(4)超净工作台开启紫外杀菌功能35min，然后在超净工作台上将混合溶液b先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，然后得到的鲍鱼血细胞抗凝保护剂。
为了进一步证明本发明的有益效果，申请人还进行了如下试验：
一、不同抗凝保护剂抗凝活性对比
1号抗凝保护剂配方(本发明的抗凝保护剂配方，记为ap)：氯化钠2.5g、0.1mmpbs100ml、edta1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g；
2号抗凝保护剂配方：氯化钠2.5g、0.1mmpbs100ml、edta1g；
3号抗凝保护剂配方：氯化钠2.5g、0.1mmpbs100ml、edta1g，草酸钠0.15g。
首先将鲍鱼血细胞与不同抗凝保护剂(1、2、3号抗凝保护剂)按1：1体积混合，室温保持1.5h后血细胞的凝集情况见表1和图3，在本对比中增加了未加抗凝保护剂的纯鲍血细胞作为对照。
表1鲍鱼血细胞在不同抗凝保护剂中的凝集情况
注：凝集团数是指随机观察20个视野中，平均每个视野细胞团数。
显微镜下观察，不加抗凝保护剂的鲍鱼血细胞发生凝集，出现多个细胞凝集团，且每个凝集团的细胞凝集数大于20个细胞。鲍鱼血细胞在ap中呈现均匀分布，在随机观察的20个视野中血细胞团数均少于2个，每个细胞团的血细胞数少于3个，抗凝集效果最好。2号抗凝保护剂的效果次之，3号抗凝保护剂中血细胞凝集现象普遍发生。
在上述实验的基础上继续对添加1、2、3号抗凝保护剂的鲍鱼血细胞的抗凝情况进行观察。在室温条件下，分别对保持3h、4h、5h后的血细胞在1号、2号、3号抗凝保护剂的凝集情况进行对比，具体比较结果见表2和图4-6。
表2不同时间段鲍鱼血细胞在不同抗凝保护剂中的凝结情况
从图4可以看出，3小时后血细胞在ap中依旧分布均匀，视野中血细胞有凝集的趋势，凝集的细胞数目只有3-4个。血细胞在2号抗凝保护剂中分布不均匀，视野中血细胞有明显凝集的现象，凝集的细胞数目超过5个，且出现絮状杂质现象。血细胞在3号抗凝保护剂中分布不均匀，视野中血细胞有明显凝集的现象，凝集的细胞数目超过10个。
从图5可以看出，4小时后血细胞在ap中分布较均匀，视野中有少量细胞凝集团出现，但凝集的细胞数目不超过4个，凝集现象并不严重。血细胞在2号抗凝保护剂中分布不均匀，视野中有明显的细胞凝集团，且凝集的细胞数目超过8个。血细胞在3号抗凝保护剂中分布极不均匀，视野中细胞凝集团较多，且凝集的细胞数目超过20个。
从图6可以看出，5小时后血细胞在ap中分布较不均匀，视野中有少量细胞凝集团出现，但凝集的细胞数目不超过6个，凝集现象并不严重。由图可见，5小时后血细胞在2号抗凝保护剂中分布不均匀，视野中有大量的细胞凝集团出现，凝集现象较严重。5小时后血细胞在3号抗凝保护剂中分布极不均匀，视野中细胞凝集团较多，且凝集的细胞数目多(＞22个)，凝集现象严重。
经过试验证明，在不同时间段(0-5h)，ap抗凝保护剂无论是在维持细胞形态，还是防止细胞凝集方面都明显优于抗凝保护剂2和3，是在研究鲍鱼试验中较为理想的选择。
二、不同抗凝保护剂血细胞死亡率对比
血细胞死亡率的测定采用流式细胞仪进行。具体操作步骤如下：抽500ul鲍鱼血(加不同抗凝保护剂后)到新2ml灭菌离心管中，各加入pi染液10ul(终浓度20ug/m1)，20℃暗室中孵育10min。20℃，400g离心5min以去除未染色的pi试剂。用600ul灭菌海水重悬细胞，放入5ml流式管中。用流式细胞仪计数30秒。630nm条件下具有荧光信号，用流式细胞仪fl2频道的单参数直方图，区分死细胞和活细胞。
鲍血细胞与各种抗凝保护剂等体积混合后测定的细胞死亡率结果见表3。
表3血细胞在各抗凝保护剂中的死亡率
从表3中可以看出，ap中的血细胞在1.5-5h内均表现出较低的死亡率，而2号和3号抗凝剂的死亡率高于ap。结合考虑表1和2的抗凝效果，本发明的ap抗凝保护剂效果更好。
三、利用本发明血液过滤器的处理效果
对过滤前后的效果进行比较，用本发明血液过滤器过滤血淋巴后，去除了大量杂质，流式细胞仪清洗时间缩短，并且分析误差降低，得到的实验结果更加准确。
并且对其鲍鱼血细胞样品上机清洗时间和费用进行对比，具体比较结果见表4。
表4鲍鱼血细胞样品上机清洗时间和费用
为了检测细胞处理的效果，申请人继续进行了如下检测，具体如下：采用流式细胞仪这种高精密仪器来测血细胞的吞噬活性。具体步骤如下：取500ul鲍血淋巴悬液到2ml离心管中，加入88ul荧光微球液(荧光微球10ul+过滤海水490ul→2％的荧光微球液)，混合均匀后置于20℃暗室中孵育60分钟。向每个离心管中加入300ul冷抗凝保护剂终止反应。20℃，400g离心5min(未被吞噬的荧光微球就到了上清中)，弃上清。再用600ul滤菌海水重新悬浮细胞，将样品倒入5ml流式细胞仪中测定，具体检测结果见表5。
表5细胞处理对细胞吞噬活性的影响
从表5中可以看出，细胞未经过抗凝保护剂和过滤器处理的吞噬活性值显著低于处理组。这表明，未经过处理的细胞会显著影响吞噬活性，并最终影响实验测定的准确性。而经过处理的细胞不影响细胞的吞噬活性，有助于实验得到准确的测定值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。