本发明涉及一种动物细胞的培养方法，尤其涉及一种能在多种无血清培养基中悬浮生长的bhk-21细胞株的培养方法和用途。
背景技术：
：动物细胞的无血清悬浮培养一直是基因工程药物和病毒疫苗规模化生产所追求的目标，但迄今成功的例子不多。cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞)是最为成功的例子，它可以在数百升的容器中用无血清培养基连续悬浮培养2-3周，细胞生长的密度能达到108个/ml，解决了细胞大量表达基因工程药物和病毒的高效扩增的技术难题，该细胞已在全球的基因工程药物(蛋白类药物、多肽药物、人源治疗性单抗)规模化生产中广泛应用。cho细胞无血清培养基连续悬浮培养的成功，为建立动物细胞的无血清悬浮培养体系开辟了新的途经。bhk-21细胞(叙利亚肾细胞)是包括腺病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒、水泡性口炎病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒在内的很多病毒的理想宿主，通常这些病毒的培养及大量扩增，尤其是病毒疫苗生产均采用bhk-21细胞做宿主。由于bhk-21细胞为赖性生长细胞，需要加入一定量的动物血清细胞才能贴壁生长，常规悬浮培养几乎不可能。因此，工业级用含有血清的培养基培养bhk-21细胞进行病毒的扩大生产时，主要利用园形转瓶接种在转瓶机上滚动培养，有限的转瓶表面积制约了病毒产率的提高，为解决病毒产率较低的问题，研究者们研发了一种微载体细胞培养体系，让细胞依附在微珠上生长再进病毒感染，以达到增加表面积提高病毒产率的目的，但效率仍不高。再者细胞贴壁培养时加入高浓度(10-15％)动物来源的血清会对下游病毒纯化造成困难。长期以来，研究者借用cho细胞无血清悬浮培养的驯化方法，试图采用递次降低血清浓度；添加生长因子、激素、氨基酸等营养物质进行无血清选择；连续培养选择等不同的方法驯化bhk-21细胞，改变细胞的培养状态(悬浮培养)，使其用于疫苗的工业化生产，但尚末见成功的例子。可见，bhk-21细胞的确是一种非常难于驯化的细胞，在含有血清的培养基中趋向于贴壁生长，而不加血清的无血清培养基中就不生长，甚至在短期内死亡。看来，要成功建立无血清的细胞悬浮培养体系，需采用创新的策略。单细胞分离技术有很多种，常用的有显微镜直接分离技术、磁珠分离技术、激光捕获显微切割技术、膜片钳技术等，近年发展成熟的流式细胞仪分选技术可快速高效地行各种单细胞分离。本发明采用流式细胞仪分选技术分离单细胞结合饲养层方法筛选bhk-21克隆细胞群体，并用无血清培养基驯化克隆细胞群体，获得3株能在无血清培养基中连续悬浮培养，且大规摸增殖的bhk-21悬浮培养细胞株；同时证明该细胞株能支撑口蹄疫病毒高效扩增，使应用bhk-21细胞为宿主大规摸扩增病毒成为可能。技术实现要素：针对利用动物细胞生产疫苗的工业生产中存在的问题，本发明提供了一种bhk-21细胞的无血清悬浮培养方法，该方法利用流式细胞仪分选技术分离单细胞结合饲养层方法筛选bhk-21克隆细胞群体，并用无血清培养基驯化。为此，本发明采取的技术方案如下：一种能在多种无血清培养基中悬浮生长的bhk-21细胞株的培养方法，包括以下步骤：s1.复苏bhk-21细胞系取出液氮罐中保藏的bhk-21细胞系，转移至37℃的水浴锅中迅速解冻(0-2分钟内)，细胞溶解后接种到t25细胞培养瓶中，向其中添加7ml含有10％(v/v)胎牛血清的mem培养基，轻轻吹打混匀，培养4-6hr后，移弃细胞培养基，上新鲜的含10％(v/v)胎牛血清的mem培养基，于37℃，5％(v/v)二氧化碳培养箱中培养2-3d，用于分选单个细胞；s2.bhk-21细胞系的分选及克隆细胞培养扩增(1)无菌操作从昆明小鼠腹腔中取出腹腔细胞(主要是巨噬细胞及其它免疫细胞)，1000转/min离心10min，弃上清，用新鲜的市售mem培养基悬浮细胞，计数，调整细胞浓度为106个/ml，接种细胞至96孔细胞培养板中，0.1ml/孔；将该96孔细胞培养板置于37℃，5％(v/v)二氧化碳培养箱中培养24-36hr，制备饲养层细胞，以得到含1.0％(v/v)胎牛血清的96孔饲养层细胞培养板；(2)取步骤s1制备的bhk-21细胞系一瓶(要求细胞生长至95％融汇度)，弃培养上清，加入1.0ml，0.25％(w/v)胰酶以消化分散细胞，显微镜观察，保证所有细胞处于单个分散细胞状态；(3)将分散的bhk-21细胞置于流式细胞仪中分选单个细胞，之后将分选的单个细胞直接接种到上述步骤(1)制得的96孔饲养层细胞培养板中，一个单细胞/孔；将该96孔饲养层细胞培养板置于37℃，5％(v/v)二氧化碳培养箱中培养2-3周；(4)逐孔观察该96孔饲养层细胞培养板中细胞的生长状况，选择生长良好的细胞克隆传代到12孔细胞板中，细胞生长良好后转移至t25培养瓶中扩增细胞，获得遗传背景一致的bhk-21克隆细胞群体，当细胞传代培养达到5×107个细胞时，常规液氮冻存备用；s3.bhk-21克隆细胞群体的无血清悬浮培养(1)复苏冻存的bhk-21克隆细胞群体，之后向无血清培养基中入2.0％(v/v)的胎牛血清，接种104个/ml的bhk-21克隆细胞，培养一周后将其转移至含1.0％(v/v)胎牛血清的无血清培养基中驯化(12孔细胞培养板)，如此操作顺序将血清浓度(v/v)从0.5％、0.2％逐渐降至0，反复驯化bhk-21克隆细胞；(2)bhk-21克隆细胞经反复驯化后，1/5孔中的细胞能逐渐在无血清培养基中悬浮生长，然后优选出生长良好的悬浮bhk-21细胞再用无血清培养基反复传5代以上，将能稳定传代生长的悬浮细胞转移至t75瓶中，置于37℃，5％(v/v)二氧化碳培养箱中扩增细胞；(3)将能稳定传代的bhk-21悬浮细胞稀释计数，以4.5×105个/ml，共30ml接种于灭过菌的celsir双侧壁悬浮培养瓶，补充无菌的5％(v/v)co2气体，灼烧瓶口并立即拧紧；用微型磁力搅拌器提供磁力驱动，调整磁力搅拌器设置转瓶的转速为30-80转/min；置于37℃普通培养箱中培养；(4)bhk-21悬浮细胞于celsir双侧壁培养瓶中无血清悬浮培养7-10d后，取出扩增的悬浮细胞，800-1000rpm离心10min，稀释后分别接种到10个t75培养瓶中，每瓶加入20ml血清培养基，补充无菌的5％(v/v)co2气体到10个t75细胞培养瓶于37℃，普通培养箱中静止培养7-10d；(5)将大量扩增的细胞(细胞总数约3-5×108/10个t75瓶)冻存液氮中长期保存。一种能在多种无血清培养基中悬浮生长的bhk-21细胞株，通过上述的无血清悬浮培养方法获得，且所述bhk-21细胞株能在静置培养的条件下悬浮生长，在通气摇床中无血清悬浮培养细胞浓度达107-8个/ml，扩增口蹄疫活病毒的效率为106cfu/ml。一种上述的bhk-21细胞株在用于扩增口蹄疫病毒中的用途。本发明所述的方法无需微载体作为附着载体，无需转瓶维持悬浮培养模式，培养基不含血清，无蛋白成分，是由无机盐及营养物组成的cd级商业无血清培养基。此外，该无血清悬浮培养bhk-21细胞株可直接由无血清培养基添加dmso冻存，复苏时也可直接用无血清培养基复苏。为工业级扩大生产病毒疫苗提供了新的思路与方法。本发明具有以下有益效果：1.无血清培养基成分清楚，用途广泛，易购得，驯化获得的bhk-21悬浮细胞株适应性强：本发明所用的无血清悬浮驯化培养基(代号x)来源于gibco公司的cdfortichotmmedium。驯化成功的悬浮bhk-21细胞株适应性强，悬浮培养的细胞密度高达108/ml。2.bhk-21悬浮培养细胞株能支撑病毒扩增本发明所驯化的bhk-21细胞株可在静置或动态两种模式下无血清悬浮培养，且扩增口蹄疫病毒滴度达106cfu/ml。病毒的3d基目拷贝数4.31×108copies/μg。3.冻存、复苏细胞方法简单、方便正常的bhk-21贴壁细胞系，在冻存时均需要一定浓度的血清才能成功复苏，而本发明所驯化的bhk-21细胞株，无血清悬浮培养后的细胞可直接用无血清细胞培养基添加10％的dmso冻存并复苏传代生长。大大简化了悬浮细胞冻存步骤，达到真正的无血清培养无血清冻存，有利于工业化生产。附图说明图1a为bhk-21细胞系正常贴壁生长的形态图(×100)；图1b为bhk-21细胞株无血清悬浮驯化培养的形态图(×100)；图2a为经冻存的bhk-21细胞系生长形态图(×100)；图2b为经冻存的bhk-21细胞株无血清悬浮驯化培养的形态图(×100)；图3为bhk-21悬浮细胞株感染fmdv出现的cpe判定图(×400)；图4为bhk-21悬浮细胞株中fmdv扩增的动力学曲线。具体实施方式下列实施例将进一步说明本发明的其它特征和优点，但该等实施例仅为示例而用，并非对本发明的限制。下文所使用的材料或试剂若无特别说明，均为市售。实施例1复苏bhk-21细胞系取出液氮罐中保藏的bhk-21细胞系(购自中国典型培养物保藏中心(cctcc))，转移至37℃的水浴锅中迅速解冻(0-2分钟内)。细胞溶解后接种到t25细胞培养瓶中，向其中添加7ml带有10％(v/v)胎牛血清的mem培养基，轻轻吹打混匀，培养4-6hr后，移弃细胞培养基，换上新鲜的含10％(v/v)胎牛血清的mem培养基，于37℃，5％(v/v)二氧化碳培养箱中培养2-3d，用于分选单个细胞。实施例2bhk-21细胞的分选及克隆细胞培养扩增(1)无菌操作从昆明小鼠腹腔中取出腹腔细胞(主要是巨噬细胞及其它免疫细胞)，1000转/min离心10min，弃上清，用新鲜的市售(gibco公司)mem培养基悬浮细胞，计数，调整细胞浓度为106个/ml，接种细胞至96孔细胞培养板中，0.1ml/孔。将该96孔细胞板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24-36hr，制备饲养层细胞，以得到含1.0％(v/v)胎牛血清的96孔饲养层细胞培养板。(2)取一瓶步骤s1制备的bhk-21细胞系(要求细胞生长至95％融汇度，培养2-3d)，弃培养上清，加入1.0ml，0.25％(w/v)胰酶消化分散细胞，显微镜观察，保证所有细胞处于单个分散细胞状态。(3)将分散的bhk-21细胞置流式细胞仪中分选单个细胞，之后将分选的单个细胞直接接种到上述步骤(1)制得的96孔饲养层细胞培养板中，一个单细胞/孔。将该96孔饲养层细胞培养板置于37℃，5％(v/v)二氧化碳培养箱中培养2-3周。隔天观察细胞生长状态。(4)逐孔观察该96孔饲养层细胞培养板中细胞的生长状况，选择生长良好的细胞克隆传代到12孔细胞扳中，细胞生长良好后(镜检观察细胞密度)转移至t25培养瓶中扩增细胞，获得遗传背景一致的bhk-21克隆细胞繁殖群体，当细胞传代培养达到一定浓度(5×107个细胞)时常规液氮冻存备用。务必注意一对一的传代，保证培养扩增的细胞群体来源于同一个分选的单细胞。实施例3bhk-21克隆细胞群体的无血清悬浮培养驯化(1)复苏冻存的bhk-21克隆细胞群体，以用于培养。将不同来源的商品化无血清培养基分为b,q,x,y,z组。分别向无血清培养基中入2.0％(v/v)的胎牛血清，接种104个/ml的bhk-21克隆细胞，培养一周后将其转移至含1.0％(v/v)胎牛血清的无血清培养基中驯化，如此操作顺序将血清浓度从0.5％、0.2％逐渐降至0，反复驯化bhk-21克隆细胞(驯化的目的是细胞的无血清培养，反复驯化就是逐渐降低细胞培养基的血清浓度，直至不加血清细胞能正常培养生长为止，实际上一种不断筛选的过程)。(2)bhk-21克隆细胞经反复驯化后，1/5孔中的细胞能逐渐在无血清培养基中悬浮生长，然后分别从b,q,x,y,z五种无血清培养基筛选出生长良好的悬浮bhk-21细胞，用无血清培养基反复传5代以上，将能稳定传代生长的悬浮细胞转移至t75瓶中，置于37℃，5％(v/v)二氧化碳培养箱中扩增细胞(静止培养)。静止培养中，每隔一天取出一部分细胞进行细胞死活计数，结果(表1)。考察静止状态下悬浮细胞的生长效率。表1的数据显示，细胞于静止状态下悬浮培养时，3-6天的细胞细密度相近(106/ml)，但培养时间延长细胞死亡率增加(6天达24.2％)，显然，细胞于静止状态下悬浮培养不是最好的培养方式。表1静止状态下悬浮细胞的生长效率天数(days)细胞数(cells/ml)细胞死亡率(％)14.5×105n/a25.0×1054.231.0×1067.943.5×10610.756.3×10624.2(3)将稳定传代bhk-21悬浮细胞稀释计数，以4.5×105个/ml，共30ml接种于灭过菌的celsir双侧壁悬浮培养瓶，补充无菌的5％(v/v)co2气体(调节培养基的ph值，确保细胞培养早期的培养基的ph值升高)，灼烧瓶口并立即拧紧；用微型磁力搅拌器提供磁力驱动，调整磁力搅拌器设置转瓶的转速为30-80转/min，置于37℃普通培养箱中动态培养。搅拌转瓶培养中，每隔一天取出一部分细胞进行细胞死活计数，结果(表2)。考察搅拌状态下悬浮细胞的生长效率。表2的数据显示，细胞搅拌状态下悬浮时，6-7天的细胞细密度达108/ml，但培养时间延长细胞死亡率增加(8天达20.0％)，因此，细胞在搅拌状态下悬浮培养是较好的培养方式，培养6天效果最佳。表2搅拌状态下悬浮细胞的生长效率天数(days)细胞数(cells/ml)细胞死亡率(％)12.7×105n/a28.0×1054.234.0×1063.843.5×1067.156.3×1077.861.8×10810.072.4×10820.0(4)bhk-21悬浮细胞于celsir双侧壁培养瓶中无血清悬浮培养7-10d后，取出扩增的悬浮细胞，800-1000rpm离心10min，稀释后分别接种到10个t75培养瓶中，每瓶加入20ml血清培养基(gibco公司)，补充无菌的5％(v/v)co2气体到每个t75细胞培养瓶中，于37℃，普通培养箱中静止培养7-10d(说明：二氧化碳培养箱通5％(v/v)co2气体，普通培养箱不加co2气体)，继续大量扩增；(5)将大量扩增的细胞(细胞总数约3-5×108/10个t75瓶)冻存液氮中长期保存。驯化成功细胞的形态(图1b)。图1a显示的是bhk-21细胞系正常贴壁生长的形态图，从图1a中可以看出正常的bhk-21细胞系为典型的贴壁生长。图1b显示的是bhk-21细胞株无血清悬浮驯化培养的形态图，从图1b中可以看出bhk-21细胞株为典型的悬浮生长。实施例4bhk-21悬浮细胞的保藏与复苏(1)收集悬浮bhk-21细胞，1000rpm中离心10min，去除上清。将dmso(二甲基亚砜)与市售无血清悬浮培养基预混，使dmso终浓度为10％(v/v)。置于4℃预冷。(3)按照以下程序设置程序降温仪：用含有dmso10％(v/v)的无血清悬浮培养基悬浮离心沉集细胞后)放入冻存管，1.0ml/管(2-5×106/ml)，置于4℃冰箱20min；设置程序降温每分钟温度降低0.5℃，至-30℃后，再设置为每分钟降低1℃，降至-100℃，取出冻存管，保藏于液氮罐中。(4)一周后从液氮中取出冻存的bhk-21细胞株，37℃水浴锅内迅速融化(0～1.0min)。吸出1ml的细胞液与相对应的9ml无血清悬浮培养基混合。800-1000rpm离心2min去上清，添加新鲜的市售无血清培养基，置于37℃，5％(v/v)二氧化碳培养箱中培养。图2a为经冻存的bhk-21细胞系生长形态图，图2b为经冻存的bhk-21细胞株无血清悬浮驯化培养的形态图，从图2b中可以看出，冻存的bhk-21悬浮细胞可以成功复苏。实施例5bhk-21悬浮细胞株的病毒扩增(1)病毒感染悬浮细胞及其致细胞病变效应(cpe)的判定取-80℃冻存的口蹄疫病毒，稀释至200pfu/ml，加5μl稀释病毒液感染1×107个bhk-21悬浮细胞。置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。bhk-21悬浮细胞的cpe判定如图3a、图3b所示。从图3a中可以看出，活细胞四周折光率高，在普通学显微镜下bhk-21悬浮细胞显示出一周明亮的圆环。从图3b中可以看出，病变细胞表现出折光率低，细胞黯淡无光，部分bhk-21悬浮细胞已经变形，细胞内容物流出。据此来判定悬浮细胞cpe。(2)bhk-21无血清悬浮培养细胞支撑病毒扩增的能力a)取200pfu/ml口蹄疫病毒液5μl感染1×107个bhk-21无血清悬浮培养细胞。每隔12个小时取一次病毒感染细胞的上清液。b)用tcid50法测定各时期的病毒液滴度，结果(表3和图4)。表3tcid50法测定各时期的病毒液滴度表3和图4的结果显示，口蹄疫病毒感染84-96hr，病毒滴度达到6iog的峰值，这是口蹄疫病毒疫苗工业化生产的最大值，但时间缩短三分之一。可见，bhk-21无血清悬浮培养细胞可为口蹄疫病毒疫苗工业化生产提供新的途径。(3)bhk-21细胞株悬浮时扩增病毒的能力以1000个pfu病毒分别感染4个t-75瓶的bhk-21悬浮细胞株(2×107个/20ml/瓶)，各2瓶用静置与动态两种模式培养考察扩增病毒的能力(见表1、图2及图4)。分别收集上述两种培养状态的细胞裂解液与培养上清液，用tcid50法检测培养上清液中病毒滴度。结果显示，动态与静止状态下悬浮培养的bhk-21细胞均能支撑口蹄疫病毒增殖，且动态悬浮培养时，病毒滴度达6iog/ml。同时用荧光定量pcr法检测细胞裂解液中口蹄疫病毒3d基因拷贝数。比较测定动态与静置状态培养状况下3d基因在细胞中的拷贝数，发现静置培养的细胞总rna中3d基因的拷贝数为7.55×106copies/μg，动态培养的细胞总rna中3d基因拷贝数为4.31×108copies/μg，动态培养细胞中3d基因拷贝数较之静止培养的细胞要多100倍。本发明的技术效果1、无血清培养基成分清楚，用途广泛，易购得，驯化获得的bhk-21悬浮细胞株适应性强：本发明所用的无血清悬浮驯化培养基(代号x)来源于gibco公司的cdfortichotmmedium。驯化成功的悬浮bhk-21细胞株适应性强，悬浮培养的细胞密度高达108/ml。2、bhk-21悬浮培养细胞株能支撑病毒扩增本发明所驯化的bhk-21无血清悬浮细胞株可在静置或动态两种模式下培养，且扩增病毒滴度达106/ml。病毒的3d基目拷贝数4.31×108copies/μg。3、冻存、复苏细胞方法简单、方便正常的bhk-21贴壁细胞，在冻存时均需要一定浓度的血清才能成功复苏，而本发明所驯化的bhk-21无血清悬浮细胞可直接用无血清细胞培养基添加10％的dmso后冻存并复苏传代生长。大大简化了悬浮细胞冻存步骤，达到真正的无血清培养无血清冻存，有利于工业化生产。综上所述，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非因此而限制本发明的专利保护范围，故举凡本发明说明书及附图所作等效变化等，皆应包括于本发明的保护范围内。当前第1页12