本发明属于植物病害生物防治
技术领域：
。具体而言，本发明涉及一株地衣芽孢杆菌及其在防治甜瓜枯萎病中的应用，以及采用该地衣芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术：
：甜瓜又称香瓜、熟瓜、哈密瓜等，在我国栽培历史悠久，因甜瓜果肉营养价值较高，具有消暑利尿、保护肝脏、补充维生素等功能，再加上色香味俱全，使得甜瓜深受大众喜爱。甜瓜作为一年生蔓生植物，在世界范围内广泛栽培，我国甜瓜产量居各国之首。近年来，随着甜瓜种植密度及复种指数的增加，甜瓜病虫害发生的频率也越来越高，其中甜瓜枯萎病则是影响甜瓜农业生产的主要病害之一。甜瓜枯萎病又称死秧、死藤、萎蔫病、蔓割病，露地和保护地栽培均可发生，是甜瓜生产上重要的真菌病害，常引起瓜秧枯萎死亡。甜瓜枯萎病由尖孢镰刀菌甜瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.melonis)引起。甜瓜枯萎病是典型的土传真菌病害，从苗期到成株期均可发病。其中，开花坐果期发病最重，常引起瓜秧枯萎死亡。目前防治甜瓜枯萎病的主要方法还是化学防治，由于长期用药，使甜瓜枯萎病病原菌产生抗药性，最终导致防治效果不理想，再加上化学药剂的大量使用对甜瓜质量安全与环境造成许多负面影响，而生物防治具有对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性等优点，因此甜瓜枯萎病的绿色无公害生物防治越来越多的受到人们关注。地衣芽孢杆菌为芽孢杆菌属内菌株，是目前得到广泛应用和研究，并具有巨大潜在开发价值的菌株之一，菌体能产生抗菌活性物质，具有独特的生物夺氧作用机制，抑制病原菌的生长繁殖，同时能够产生多种促生相关物质，促进植物生长。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于高效防治甜瓜枯萎病的新的微生物——地衣芽孢杆菌lt4-3。本发明的地衣芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物(尤其是甜瓜)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明所提供的菌株为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)菌株lt4-3，是从山东省济宁市运河河泥中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.14745。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或lb(luria-bertani)培养基上该菌株形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央隆起、边缘整齐，后期有褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形，中生或近中生，抱囊不膨大。本发明地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3的培养方法或繁殖方法包括：(1)普通培养保存采用lb培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0～7.2。(2)实验室液体培养采用lb液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0～7.2。(3)固体培养基配方：包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.6∶0.4；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝54∶30∶10∶6；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾21％，硫酸镁5％，硫酸铵9％，轻质碳酸钙65％。(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。本发明还提供了一种用于防治甜瓜枯萎病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3。并且，本发明还提供了一种用于防治甜瓜枯萎病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有枯萎病的甜瓜植株施用上述地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3或者上述生物防治制剂。本发明也提供了上述地衣芽孢杆菌菌株lt4-3或者上述生物防治制剂在防治甜瓜枯萎病中的用途。本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：(1)制备所述地衣芽孢杆菌菌株lt4-3的种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，27～29℃下恒温培养；(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温27～29℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：(1)将所述地衣芽孢杆菌菌株lt4-3的孢子移植到lb液体培养基，27～29℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，27～29℃下振荡培养3～5d；(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温27～29℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。其中，步骤(1)中的lb液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0～7.2。步骤(2)中的固体培养基包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.6∶0.4；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝54∶30∶10∶6；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾21％，硫酸镁5％，硫酸铵9％，轻质碳酸钙65％。步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物(尤其是甜瓜)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该地衣芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治甜瓜枯萎病害，还能有效促进甜瓜生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治甜瓜枯萎病。试验结果表明：地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3可湿性粉剂防治甜瓜枯萎病效果显著，防治效果达到74.31％，且甜瓜长势良好，无药害产生。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。实施例11、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)lt4-3的分离与纯化本发明的地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)lt4-3是从河泥中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：(1)芽孢杆菌的分离河泥样品于2014年5月15日取自山东省济宁市运河。称取1g河泥于100ml无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μl10-2、10-3、10-4稀释液涂布于lb培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取lb培养基上的不同形态的微生物菌落于lb培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，并编号保存。(2)甜瓜枯萎病高效拮抗菌株的筛选①初筛：采用对峙培养法，制备pda(potatodextroseagar)平板，用打孔器在芽孢杆菌、甜瓜枯萎病病原菌边缘取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验，并对筛选得到的菌株lt4-3进行鉴定。本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治甜瓜枯萎病的地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)lt4-3。实验证明，该地衣芽孢杆菌原粉在防治甜瓜枯萎病中显示出非常高效的防治效果，使得甜瓜长势良好。因而，本发明的地衣芽孢杆菌是具有广泛应用前景的地衣芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治甜瓜枯萎病的生物防治制剂。2、菌株鉴定(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或lb培养基上该菌株形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央隆起、边缘整齐，后期有褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形，中生或近中生，抱囊不膨大。(2)分子生物学特性该菌株的16srdna基因序列测定结果如下(seq-1)：tcctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcagacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatcg。(3)细胞形态和理化实验结果表1地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)lt4-3的细胞形态和理化实验结果实验项目结果实验项目结果革兰氏染色阳性碳水化合物产酸+细胞形状杆状葡萄糖+细胞直径﹥1μm－木糖+形成芽孢+l－阿拉伯糖+芽孢膨大－甘露醇－芽孢圆形－乳糖－伴孢晶体－发酵葡萄糖产气+接触酶+利用柠檬酸盐+氧化酶+50℃生长+厌氧生长－ph5.7生长+vp试验+7％nacl生长+vp﹤ph6+淀粉水解+vp﹥ph7－分解酪素+硝酸盐还原+水解明胶+该菌株鉴定为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14745。实施例21、地衣芽孢杆菌菌种发酵过程lb液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0～7.2。固体培养基配方：固料、无机盐和水，所述固料和无机盐的质量比为98.6∶0.4；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝54∶30∶10∶6；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾21％，硫酸镁5％，硫酸铵9％，轻质碳酸钙65％。配制方法：加入适量的水(10-15倍质量)溶解无机盐，得到无机盐溶液；无机盐溶液与固料混合，并加入水最终调整固体培养基的含水量为40-60％，以将固体培养基攥在手中，指缝中有水但不会滴落为宜。地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3大量固体发酵过程：①菌种种子液培养将地衣芽孢杆菌菌株(b.licheniformis)lt4-3从试管斜面中挑取少量孢子，移至lb液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。②固体生产菌种的培养将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500ml三角瓶)中，28℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d；然后进一步干燥制成地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3原粉，活性菌达150亿/克。④可湿性粉剂原料配比：地衣芽孢杆菌lt4-3原粉10％，葡萄糖45％，湿润剂10046％，分散剂nno2.0％，cmc1％，轻质碳酸钙余量。为了明确地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3粉剂对甜瓜枯萎病的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年2月～3月在山东省济南市章丘区进行试验，现将试验结果报告如下：1供试材料及方法1.1供试药剂按本发明实施例2发酵方法生产的地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3粉剂(15亿/克孢子粉剂wp)；60％多菌灵可湿性粉剂(河南省金亮精细化工有限公司生产，市售)。1.2试验材料与防治对象试验材料为甜瓜，品种为京甜5；防治对象为甜瓜枯萎病(fusariumoxysporumf.sp.melonis)。1.3试验地情况试验地设在山东省济南市章丘区高官寨镇甜瓜种植基地大棚。近几年，该地区由于连续种植甜瓜，甜瓜枯萎病发生比较普遍。试验土壤类型为潮土，有机质含量为1.72％，ph值为7.5，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时甜瓜枯萎病处于发病初期。1.4试验设计及安排本试验共3个处理，分别为地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3粉剂20倍液、60％多菌灵可湿性粉剂800倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理140株。于发病初期对病株及其附近植株灌根，10天一次，连续3次，每次每病株灌药液0.25kg。于2016年2月25日、3月5日和3月15日各灌根一次。1.5试验调查及计算方法1.5.1气象条件第1次施药(2月25日)当日多云，风力3级，最高气温为9℃，最低气温为-2℃，相对湿度为51％。第2次施药(3月5日)，当日多云，风力3级，最高气温为13℃，最低气温为3℃，相对湿度为50％；第3次施药(3月15日)当日晴，风力3级，最高气温为15℃，最低气温为5℃，相对湿度为52％。1.5.2药效及安全性调查药效调查：最后一次施药后14d进行调查。调查120株，调查全部叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察甜瓜的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。甜瓜枯萎病分级标准：0级：全株无病症。1级：植株1/4以下叶片表现萎蔫症状。2级：植株1/4～1/2叶片表现萎蔫症状。3级：植株1/2以上叶片表现萎蔫症状。4级：植株因病枯死。1.5.3药效计算方法防治效果按式(1)、(2)计算：式中：ck0——空白对照区施药前病情指数；ck1——空白对照区施药后病情指数；pt0————药剂处理前施药前病情指数；pt1————药剂处理后施药后病情指数。1.5.4对甜瓜的直接影响观察药剂对甜瓜有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对甜瓜长势的影响。用下列方式记录药害：(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高。(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：①按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。药害分级方法：—：无药害；+：轻度药害，不影响植物生长；++：中度药害，可复原，不会降低植物生物量；+++：中度药害，影响植物正常生长，对植物生物量造成一定程度的降低；++++：严重药害，植物生长受阻，植物生物量降低严重。②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述植物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。2结果2.1供试药剂对甜瓜枯萎病的防治效果供试药剂对甜瓜枯萎病的防治效果如表2-3所示。表3结果显示，地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3可湿性粉剂和60％多菌灵可湿性粉剂对甜瓜枯萎病均具有较好的防治效果，其中前者的防治效果达到70％以上。从甜瓜枯萎病田间试验的病情指数来看(表3)，最后一次施药后14d，地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)lt4-3防治效果为74.31％，明显高于60％多菌灵可湿性粉剂55.42％的防治效果。表2三种药剂处理前甜瓜枯萎病病害情况表3三种药剂处理对甜瓜枯萎病的防治效果2.2甜瓜安全性调查经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，甜瓜生长正常，无药害产生，说明地衣芽孢杆菌粉剂对甜瓜安全。3小结3.1从病情指数和防治效果来看，地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3(保藏号cgmccno.14745)对甜瓜枯萎病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d其防治效果达到70％以上。3.2从甜瓜长势看，地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)菌株lt4-3对甜瓜具有促进生长效果，没有药害，安全可靠。sequencelisting<110>山东新禾丰作物营养有限公司<120>一株地衣芽孢杆菌及其在防治甜瓜枯萎病中的应用<130>0<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1381<212>dna<213>地衣芽孢杆菌（b.licheniformis）菌株lt4-3的16srdna基因序列<400>1tcctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcc60cgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgca120gtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgc180ggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggc240atgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagt300gcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaa360catctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaagggg420acgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgct480tcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttca540gtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggc600ggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatc660ctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcg720ccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcc780tcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttc840acatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgctt900gccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggta960ccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacg1020atccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaa1080gattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccga1140tcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagc1200taatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccat1260gcggttcagacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacag1320gcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatc1380g1381当前第1页12