本发明属于细菌分子检测领域，具体是餐饮食品中的一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因型快速检测方法。
背景技术：
：餐饮是人们赖以生存的基础，随着生活节奏的加快，工作压力的增加，特别是互联网销售的突起，人们对于大众化餐饮的需求每年都在呈现上升趋势，线上订餐已经成为一种流行。而餐饮中主要的致病菌之一便是金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，其营养要求不高，耐盐性强，在多数种类的食品中均可存活，故食品受其污染的机会很多，如果条件适合，还会大量繁殖并产生足够剂量的肠毒素，这些毒性物质与食源性葡萄球菌中毒密切相关，是引起人类疾病的主要致病因子。据美国疾病控制中心报告，在美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒数量仅次于大肠埃希菌，居第2位，占细菌性食物中毒的33％，而在加拿大则占45％。日本的调查结果表明，平均32.5％的食品存在金黄色葡萄球菌的污染。2010—2012年北京市共报告细菌性食物中毒27起,其中金黄色葡萄球菌食物中毒占22％。金黄色葡萄球菌是一种条件致病菌微生物，其产生的肠毒素(se)是引起食物中毒的主要原因，其中50％以上的金黄色葡萄球菌可产生肠毒素(se)。金黄色葡萄球菌引起的食物中毒除了最早被人们发现和熟知的sea外，目前已发现的肠毒素有20多种血清型，常见的se为11种，分别为sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、ser、ses和set。肠毒素以sea最为常见(约占75％)，其次是sed。一般认为，sea的毒性最强，由它引起的食物中毒的报道也最多，携带肠毒素基因的金黄色葡萄球菌可产生一种或多种肠毒素，但是，一株金黄色葡萄球菌如果产生多种肠毒素，却往往以某一型的肠毒素为主，大多数时候引起食物中毒的是sea-see这几种肠毒素。当前很多国家都就其国内金黄色葡萄球菌分离株肠毒素基因型的分布作了调查，但是不同报道的各型食源性金黄色葡萄球菌肠毒素所占的比例在各研究中都有所不同。迄今为止今，对已发现的金黄色葡萄球菌肠毒素的系统分型鉴定方法仍鲜有报道。目前，针对金黄色葡萄球菌肠毒素的检测分型的方法技术主要有：基于病毒抗原、抗体反应的免疫学方法和包括病毒分离、病毒抗原和基因组dna的核酸检测技术，以及传统的动物试验和新兴的生物传感器技术等。这些年新兴发展的pcr技术能在数小时内使靶序列扩增上百万倍，并可直接进行样品检测，以其快速、灵敏、特异性强、操作简便、重复性好等优点，被广泛应用于生命科学等各个领域。利于pcr技术可快速检测餐饮产品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因型，相比于其它的检测与分型方法具有步骤简便、价格低廉和准确性高等优点，并且检测与分型的时间减少为几个小时。金黄色葡萄球菌是作为引起食物中毒最普遍的细菌之一，其分布的广泛性、新型肠毒素基因产生的复杂与多样性、肠毒素强的耐热特性，使金黄色葡萄球菌肠毒素功能与检测的研究需求变得尤为突出。加强食品原料中金黄色葡萄球菌肠毒素检测与评价，发展金黄色葡萄球菌肠毒素检测新型技术，成为餐饮食品安全控制的迫切需要。技术实现要素：本发明的目的在于提供餐饮食品中的一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因型快速检测方法，步骤简单、价格低廉，而且准确度高。本发明提供的餐饮食品中的一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因型快速检测方法，包括以下步骤：1)菌株的培养鉴定与筛选；2)dna模板的提取：取经筛选的金黄色葡萄球菌，用脑心浸出液肉汤增菌培养，然后，取该增菌液于离心管中，离心，弃上清，加入细菌裂解液，振荡混匀后，置金属浴恒温加热，然后室温离心，将上清液转移到新的离心管中，作为pcr反应模板，-4℃保存备用；3)pcr扩增：根据需要检测的金黄色葡萄球菌肠毒素基因型的个数，取相同数量的pcr管，每支pcr管中所需pcr引物对，所述pcr引物对由引物a和引物b组成；然后进行pcr扩增，条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性40秒；55℃退火40秒；72℃延伸1分钟；前述变性、退火和延伸共30个循环；最后72℃延伸10分钟；4℃保温10分钟，得扩增样品；4)pcr扩增产物分析：将步骤3)制得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，取5μl扩增产物与2μl质量比为0.25％的溴酚蓝加样缓冲液混合，混匀之后点样于含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果扩增的核酸条带与对应基因型的肠毒素扩增长度一致，则可判断被检测的样品是含有相应金黄色葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品。具体的，步骤1)菌株的培养鉴定与筛选具体为：菌株培养与鉴定参照国标gb4789.10-2016，按常规方法增菌分离培养，根据菌落形态及血平板溶血现象，通过全自动细菌生化分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌。将纯培养的金黄色葡萄球菌肉汤经vidas全自动荧光酶标免疫测试系统检测肠毒素，筛选携带肠毒素的菌株进行下一阶段实验。步骤2)具体为：取筛选的金黄色葡萄球菌，用脑心浸出液肉汤37℃增菌培养15-17h，吸取该增菌液100μl于离心管中，10000-12000r/min条件下离心5-8min，弃上清，加入100μl细菌裂解液，振荡混匀后置100℃金属浴恒温加热14-16min，室温下，10000-12000r/min离心5-7min，将上清液转移到新的离心管中，作为pcr反应模板，-4℃保存备用。步骤3)具体为：每支pcr管中加入1.0μl20μmol/l引物a，1.0μl20μmol/l引物b；模板dna:2μl；10×pcrbuffer:2.5μl；mgcl225mmol/l：1.5μl；dntpmixture：2μldntp，所述dntp为dttp、datp、dctp、dgtp四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mmol/l；taq酶(2.5u/μl)：1μl；灭菌去离子水：50μl；5000r/min条件下离心3秒，混匀，置于pcr仪内进行扩增。步骤3)中所述的pcr引物对为：sea肠毒素基因型：引物a：aaagtcccgatcaatttatggcta；引物bgtaattaaccgaaggttctgtaga。seb肠毒素基因型：引物a：tcgcatcaaactgacaaacg；引物b：gcaggtactctataagtgcc。sec肠毒素基因型：引物a：gacataaaagctaggaattt；引物b：aaatcggattaacattatcc。sed肠毒素基因型：引物a：ctagtttggtaatatctcct；引物b：taatgctatatcttataggg。see肠毒素基因型：引物a：tagataaggttaaaacaagc；引物b：taacttaccgtggacccttc。步骤4)中对应基因型的肠毒素扩增长度分别对应为：sea肠毒素基因型：扩增长度218bp；seb肠毒素基因型：扩增长度478bp；sec肠毒素基因型：扩增长度257bp；sed肠毒素基因型：扩增长度317bp；see肠毒素基因型：扩增长度300bp。本发明与现有技术相比，可快速检测餐饮产品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因型，相比于其它的检测与分型方法具有步骤简便、价格低廉和准确性高等优点，并且检测与分型的时间减少到几小时内。具体实施方式实施例1餐饮食品中的一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因型快速检测方法，包括以下步骤：1)菌株的培养鉴定与筛选：菌株培养与鉴定参照国标gb4789.10-2016，按常规方法增菌分离培养，根据菌落形态及血平板溶血现象，通过全自动细菌生化分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌。将纯培养的金黄色葡萄球菌肉汤经vidas全自动荧光酶标免疫测试系统检测肠毒素，筛选携带肠毒素的菌株进行下一阶段实验。2)dna模板的提取：步骤1)筛选的金黄色葡萄球菌，用脑心浸出液肉汤37℃增菌培养16h，吸取该增菌液100μl于离心管中，12000r/min，离心5min，弃上清，加入100μl细菌裂解液，振荡混匀后置100℃金属浴恒温加热15min，室温12000r/min离心5min，将上清液转移到新的离心管中，作为pcr反应模板，-4℃保存备用。3)pcr扩增：根据需要检测的葡萄球菌肠毒素基因型的个数，取相同数量的pcr管，每支pcr管中加入任意一组pcr引物对，所述pcr引物对由引物a和引物b组成，每支pcr管中加入1.0μl20μmol/l引物a，1.0μl20μmol/l引物b；模板dna:2μl；10×pcrbuffer:2.5μl；mgcl2(25mmol/l)：1.5μl；dntpmixture：2μldntp，所述dntp为dttp、datp、dctp、dgtp四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mmol/l；taq酶(2.5u/μl)：1μl；灭菌去离子水：50μl。5000r/min离心3秒混匀，置于pcr仪内进行扩增；反应条件为：①94℃预变性3分钟；②94℃变性40秒；③55℃退火40秒；④72℃延伸1分钟；②③④共30个循环；最后72℃延伸10分钟；4℃保温10分钟，得扩增样品；根据需要检测的葡萄球菌肠毒素基因型选择pcr引物对，引物对情况见表1。表1：4)pcr扩增产物分析：将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，取5μl扩增产物与2μl质量比为0.25％的溴酚蓝加样缓冲液混合，混匀之后点样于含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果扩增的核酸条带与表2中扩增长度一致，则可判断被检测的样品是含有相应金黄色葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品。表2：扩增长度(bp)肠毒素基因型218sea478seb257sec317sed300see本发明可快速检测餐饮产品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因型，步骤简便、价格低廉，而且，准确性高。sequencelisting<110>芜湖市食品药品检验中心（市药品不良反应监测中心）<120>餐饮食品中的一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因型快速检测方法<130>1<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>sea肠毒素基因型引物a<400>1aaagtcccgatcaatttatggcta24<210>2<211>24<212>dna<213>sea肠毒素基因型引物b<400>2gtaattaaccgaaggttctgtaga24<210>3<211>20<212>dna<213>seb肠毒素基因型引物a<400>3tcgcatcaaactgacaaacg20<210>4<211>20<212>dna<213>seb肠毒素基因型引物b<400>4gcaggtactctataagtgcc20<210>5<211>20<212>dna<213>sec肠毒素基因型引物a<400>5gacataaaagctaggaattt20<210>6<211>20<212>dna<213>sec肠毒素基因型引物b<400>6aaatcggattaacattatcc20<210>7<211>20<212>dna<213>sed肠毒素基因型引物a<400>7ctagtttggtaatatctcct20<210>8<211>20<212>dna<213>sed肠毒素基因型引物b<400>8taatgctatatcttataggg20<210>9<211>20<212>dna<213>see肠毒素基因型引物a<400>9tagataaggttaaaacaagc20<210>10<211>20<212>dna<213>see肠毒素基因型引物b<400>10taacttaccgtggacccttc20当前第1页12